晁志祥 秦西淳 賈才力 秦昊 張昊

目前肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率極高的惡性腫瘤[1]，據(jù)統(tǒng)計(jì)，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）約占報(bào)告病例的85%[2]，近80%的NSCLC患者被診斷為晚期，晚期NSCLC患者的預(yù)后極差[3]。近年來(lái)，血管生成在腫瘤發(fā)展，生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的作用一直是研究的熱點(diǎn)[4]。色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor,PEDF）是一種50 kDa分泌性的糖蛋白，具有多種生物學(xué)功能，包括抗血管生成、抗炎和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)[5]。越來(lái)越多的證據(jù)[6]表明，PEDF對(duì)多種類(lèi)型腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，如卵巢癌、胰腺癌、骨肉瘤等。然而，由于PEDF本身分子量較大，半衰期短，免疫原性較強(qiáng)，難以實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。多肽在多種疾病的治療上具有特異性和有效性，并具有良好的藥理動(dòng)力學(xué)和較低的生產(chǎn)成本[7]。已在人類(lèi)PEDF中鑒定出兩個(gè)功能性基序，分別是34聚體（氨基酸位置Asp44-Asn77）和44聚體（氨基酸位置Val78-Thr121），它們分別負(fù)責(zé)抗血管生成活性和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性[8]。已有研究[9]證明PEDF能有效抑制肺癌的增殖和遷移，然而PEDF多肽的抗腫瘤作用鮮有報(bào)道。因此，探究短功能PEDF肽的抗腫瘤生物學(xué)活性具有潛在價(jià)值。本研究旨在探討PEDF及其衍生多肽對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響，從而為肺癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與試劑 A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)，A549細(xì)胞用含10%血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，H1299細(xì)胞用含10%血清的高糖RPMI-1640培養(yǎng)基，在37oC、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)到90%以上時(shí)，消化傳代培養(yǎng)。A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)皿60%左右時(shí)，分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行藥物處理，分為正常組、PEDF組（60 nmol/L）、34肽組（60 nmol/L）、44肽組（60 nmol/L）及34+44組合肽（60 nmol/L）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司）；胎牛血清（四季青公司）；人重組PEDF蛋白34肽（氨基酸序列：DPFFKVPVNKLAAAVSNFGYDLYRVRSSTSPTTN）、44肽（氨基酸序列：PLSVATALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT）（生工生物工程上海股份有限公司）溶于無(wú)菌PBS中；CCK-8試劑盒（南京凱基公司）；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基公司）。

1.2 CCK-8法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，分別調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，鋪96孔板，每孔100 μL。細(xì)胞貼壁后，A549細(xì)胞系中，實(shí)驗(yàn)組各孔加入相同濃度的體積為3 μL的分組藥物稀釋的DMEM培養(yǎng)基，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，作用48 h后，各孔加入CCK-8試劑10 μL，置于37oC、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（optical density, OD）值。H1299細(xì)胞系中，實(shí)驗(yàn)組各孔加入相同濃度的體積為3 μL的分組藥物稀釋的RPMI-1640培養(yǎng)基，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，作用48 h后，各孔加入CCK-8試劑10 μL，置于37oC、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。計(jì)算各組細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，抑制率（%）=［1-（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/空白組OD值］×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞鋪板于6孔板中，在細(xì)胞生長(zhǎng)至約50%密度時(shí)，對(duì)不同分組加入藥物處理，24 h后在光鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.4 免疫印跡法 細(xì)胞加入裂解液后經(jīng)離心提取蛋白，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。配制聚丙烯酰胺凝膠，每孔按照20 μL體積上樣，接下來(lái)依次進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后使用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。一抗1:1,000稀釋后4oC過(guò)夜孵育。根據(jù)一抗來(lái)源的不同選擇二抗，稀釋倍數(shù)為1:20,000，避光室溫條件下孵育2 h，采用Odyssey系統(tǒng)進(jìn)行掃描。使用Image J對(duì)條帶進(jìn)行定量分析，各組目的蛋白灰度值與內(nèi)參（β-tubulin）灰度值比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力，將A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞以5×105/mL的密度鋪于6孔板內(nèi)，在A549細(xì)胞系中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在H1299細(xì)胞系中加入RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，使之形成單層細(xì)胞。用200 μL移液槍槍頭在單層細(xì)胞上縱橫劃痕。劃痕操作后，將其分為5組，分別為空白對(duì)照組、PEDF組、PEDF-34肽組、PEDF-44肽組和PEDF-34+44組合肽組，分別于劃痕之后的0 h、24 h在倒置熒光顯微鏡下觀察（×40倍）并拍照。使用Image J對(duì)劃痕愈合率進(jìn)行分析。劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.6 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PEDF全蛋白，不同肽段（PEDF-34肽、PEDF-44肽）對(duì)A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞凋亡的影響，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞（2×105/mL）接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后棄去孔內(nèi)的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入相同濃度PEDF全蛋白、PEDF-34肽、PEDF-44肽及PEDF-34+44肽（濃度為20 mg/μL）稀釋的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)基，置于37oC、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，加藥48 h后，用不含EDTA的胰酶和預(yù)冷的PBS消化、離心、洗滌、收集細(xì)胞（按說(shuō)明書(shū)操作，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)凋亡），加入500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，5 μL Annexin-VFIT避光孵育15 min，加入5 μL PI混勻后避光5 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間差異比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PEDF全蛋白、34肽、44肽及34+44組合肽對(duì)A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞增殖的影響 CCK-8法檢測(cè)各組OD值，在A549細(xì)胞系中，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組抑制率相比，抑制率最明顯的為PEDF-34+44肽組55.91%±2.24%，44肽組為43.15%±3.43%、34肽組為33.02%±2.24%、PEDF組為26.07%±3.16%（圖1A、圖1B）。在H1299細(xì)胞系中，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組抑制率相比，抑制率最明顯的為34+44肽組58.03%±2.99%，44肽組為44.45%±2.70%、34肽組為33.30%±3.08%、PEDF組為27.78%±2.53%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖1C、圖1D）。上述結(jié)果表明，PEDF全蛋白及34肽、44肽對(duì)NSCLC A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞的增殖具有抑制作用，34+44肽組抑制效果最為明顯。

圖1 CCK8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性。A：A549細(xì)胞系中各組細(xì)胞的OD值；B：各組細(xì)胞增殖的抑制率及其相互比較。C：H1299細(xì)胞系中各組細(xì)胞的OD值；D：各組細(xì)胞增殖的抑制率及其相互比較。Fig 1 CCK8 detects cell proliferation activity in each group. A: the OD value of each group of cells in the A549 cell line; B: the inhibition rates of cell proliferation in each group and their comparison with each other; C: the OD value of each group of cells in the H1299 cell line; D: the inhibition rate of cell proliferation in each group and their comparison with each other. * means that all groups have statistical differences compared with the normal group (P<0.05); # means that all groups have statistical differences compared with the 34+44 peptide group (P<0.05).

2.2 PEDF全蛋白、34肽、44肽及34+44組合肽對(duì)A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞形態(tài)的影響 在加藥24 h后，熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)的變化，在兩個(gè)細(xì)胞系中，與正常組相比，34+44肽組的細(xì)胞形態(tài)從長(zhǎng)梭形變?yōu)轱枬M(mǎn)圓潤(rùn)的細(xì)胞數(shù)更多，依次為33肽組、PEDF組、44肽組。與正常組相比，細(xì)胞密度由高到低依次為PEDF組、34肽組、44肽組、34+44肽組（圖2）。因此得出，PEDF及其多肽對(duì)A549細(xì)胞及H1299細(xì)胞均可起到抑制增殖及間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用，且34+44肽組的抑制效果最明顯。

圖2 光學(xué)顯微鏡去觀察藥物處理24 h后各組細(xì)胞形態(tài)的變化（×200, bar=50 μm）Fig 2 Optical microscope to observe the changes of cell morphology in each group after 24 h of drug treatment (× 200, bar=50 μm)

2.3 PEDF全蛋白、34肽、44肽及34+44組合肽對(duì)A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞凋亡的影響 蛋白免疫印跡結(jié)果顯示：在兩個(gè)細(xì)胞系中，凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-Caspase-3及RIP3的表達(dá)量增加最為明顯的組別，依次為34+44肽組、44肽組及34肽組，各實(shí)驗(yàn)組與正常組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；各組與34+44肽組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖3D-圖3F；圖4D-圖4F）；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：在A549細(xì)胞系中，與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率最高的是34+44組合肽組為23.29%±2.36%；對(duì)照組為3.07%±0.21%；PEDF組為14.71%±0.78 %；34肽組為13.47%±1.24%以及44肽組為16.53%±0.88%。在H1299細(xì)胞系中，與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率最高的是34+44組合肽組為23.63%±2.40%；對(duì)照組為3.59%±0.29%；PEDF組為12.73%±2.35%；34肽組為12.51%±2.24%以及44肽組為14.48%±1.24%。可見(jiàn)不同組別與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組（P<0.05），且34+44肽組細(xì)胞凋亡率高于其他組（P<0.05），并且由流式結(jié)果可以得出各實(shí)驗(yàn)組對(duì)細(xì)胞促凋亡作用主要表現(xiàn)為晚期凋亡（圖6）。因此得出：PEDF全蛋白及不同肽段（34肽、44肽）對(duì)A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用，34+44組合肽組促進(jìn)凋亡效果最為明顯。

2.4 PEDF全蛋白、34肽、44肽及34+44組合肽對(duì)A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞的遷移能力影響 蛋白免疫印跡結(jié)果顯示：在兩個(gè)細(xì)胞系中，各組EMT相關(guān)蛋白表達(dá)，其中E-cadherin表達(dá)量依次為34+44肽組、44肽組、PEDF組，各實(shí)驗(yàn)組與正常組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），各組與34+44肽組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；α-SMA在34+44肽組的減少最為明顯，依次為34肽組、PEDF組，各實(shí)驗(yàn)組與正常組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），各組與34+44肽組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖3A-圖3C；圖4A-圖4C）。這些結(jié)果表明34+44肽組抑制效果最好，其次為PEDF-34肽組。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與所有組別相比，34+44肽組的愈合率最低，其他組別與正常組相比，愈合率均有差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖5）。因此得出：PEDF全蛋白及不同肽段（PEDF-34肽、PEDF-44肽）對(duì)A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞均有抑制遷移作用，PEDF-34+44組合肽組抑制效果最為明顯。

圖3 蛋白印跡檢測(cè)各組EMT相關(guān)表達(dá)及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。A：檢測(cè)A549細(xì)胞系中遷移相關(guān)蛋白（E-cadherin、α-SMA）的表達(dá)量；B、C：相關(guān)蛋白表達(dá)量統(tǒng)計(jì)圖；D：A549細(xì)胞系中凋亡相關(guān)蛋白（Clevead-Caspase-3、Rip-3）的表達(dá)情況；E、F：相關(guān)蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖。Fig 3 Western blot was used to detect the expression of EMT-related and apoptosis-related proteins in each group. A: the detection of the expression of migration-related proteins (E-cadherin, α-SMA) in the A549 cell line; B and C: statistical diagrams of the expression of related proteins; D: the expression of apoptosis-related proteins (Clevead-Caspase-3, Rip-3) in the A549 cell line; E and F: statistical diagrams of related protein expression. * means that all groups have statistical differences compared with the normal group (P<0.05); # means that all groups have statistical differences compared with the 34+44 peptide group (P<0.05).

圖4 蛋白印跡檢測(cè)各組EMT相關(guān)表達(dá)及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。A：檢測(cè)H1299細(xì)胞系中遷移相關(guān)蛋白（E-cadherin、α-SMA）的表達(dá)量；B、C：相關(guān)蛋白表達(dá)量統(tǒng)計(jì)圖；D：H1299細(xì)胞系中凋亡相關(guān)蛋白（Clevead-Caspase-3、Rip-3）的表達(dá)情況；E、F：相關(guān)蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖。Fig 4 Western blot was used to detect the expression of EMT-related and apoptosis-related proteins in each group. A: the detection of the expression of migration-related proteins (E-cadherin, α-SMA) in the H1299 cell line; B and C: statistical diagrams of the expression of related proteins; D: the expression of apoptosis-related proteins (Clevead-Caspase-3, Rip-3) in the H1299 cell line; E and F: statistical diagrams of related protein expression. * means that all groups have statistical differences compared with the normal group (P<0.05); # means that all groups have statistical differences compared with the 34+44 peptide group (P<0.05).

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力的變化。A：A549細(xì)胞各組傷口愈合實(shí)驗(yàn)；B：愈合抑制率統(tǒng)計(jì)圖；C：H1299細(xì)胞各組傷口愈合實(shí)驗(yàn)；D：愈合抑制率統(tǒng)計(jì)圖。Fig 5 Wound healing test to detect changes in cell migration ability of each group. A: the wound healing experiment of each group of A549 cells;B: the statistical graph of the healing inhibition rate; C: a wound healing experiment of each group of H1299 cells; D: a statistical graph of the healing inhibition rate. * means that all groups have statistical differences compared with the normal group (P<0.05); # means that all groups have statistical differences compared with the 34+44 peptide group (P<0.05).

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。A：A549細(xì)胞系中各組細(xì)胞凋亡情況；B：H1299細(xì)胞系中各組細(xì)胞凋亡情況；C、D：A549細(xì)胞系及H1299細(xì)胞系各組細(xì)胞凋亡率及其比較。Fig 6 Flow cytometry to detect the apoptosis of each group of cells. A: shows the apoptosis of each group in the A549 cell line; B: the apoptosis of each group in the H1299 cell line; C and D: the apoptosis rate of each group of the A549 cell line and the H1299 cell line and their comparison. *means that all groups have statistical differences compared with the normal group (P<0.05); # means that all groups have statistical differences.

3 討論

目前，雖然在肺癌的診斷和治療方面取得重大進(jìn)展，但腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移仍是阻礙臨床治療效果的主要原因。PEDF由SERPINF1基因編碼，是一種具有高度保守的折疊構(gòu)象的分泌性多效單體糖蛋白，在機(jī)體多種組織中均有表達(dá)。PEDF最初被鑒定為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，但現(xiàn)在PEDF被公認(rèn)為最有效的內(nèi)源性抗血管生成因子之一。

隨著蛋白組學(xué)的發(fā)展，小分子多肽的研究越來(lái)越受關(guān)注，其保留全蛋白某種特異性功能，具有較高的生物利用率及生物安全性，同時(shí)還能避免全蛋白帶來(lái)的免疫反應(yīng)。已在PEDF中鑒定出兩個(gè)功能性肽段，分別是34肽（氨基酸位置Asp44-Asn77）和44肽（Val78-Thr121）。有研究顯示，34mer可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡而抑制血管再生。44mer具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)及細(xì)胞保護(hù)作用，但卻不能抑制血管再生。隨著對(duì)PEDF生物學(xué)功能研究的深入，PEDF已被證明可以抑制多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，不僅能靶向腫瘤異常的微血管系統(tǒng)[10,11]，還能直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖或介導(dǎo)其凋亡[12]。然而，目前為止，關(guān)于PEDF衍生肽段的抗腫瘤特性的作用卻知之甚少。

我們研究發(fā)現(xiàn)，在抑制A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞增殖及促凋亡方面，兩種PEDF衍生多肽效果均優(yōu)于PEDF全蛋白，其中44肽效果最好。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出34肽對(duì)細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用，但44肽效果不佳，WB的結(jié)果也證實(shí)這一點(diǎn)。值得注意的是，34+44組合肽在抑制增殖、遷移和促凋亡方面均表現(xiàn)最優(yōu)。與全蛋白相比，34肽和44肽分子量更小，結(jié)構(gòu)更為簡(jiǎn)單，可能更易于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與相應(yīng)受體結(jié)合，從而發(fā)揮特異性功能。由于多肽的氨基酸序列不同，因而會(huì)發(fā)揮不同的功能，但所選序列源自于同一蛋白，故而功能會(huì)有可能相似又不全相同。綜合整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這種組合用藥方式能夠有效抑制細(xì)胞的增殖和遷移，同時(shí)又能明顯促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

我們的研究尚有不足之處，本實(shí)驗(yàn)僅初步研究了34肽和44肽對(duì)NSCLC的生物學(xué)作用，作用機(jī)制尚不明確。PEDF存在多種受體，如層黏連蛋白受體（laminin receptor,LR）和脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triacylglyceride lipase,ATGL），這些受體或結(jié)合位點(diǎn)在很多細(xì)胞中表達(dá)，包括腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞[13]。PEDF可與這些受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。除此之外，PEDF還具有膠原蛋白I和糖胺聚糖（包括肝素和透明質(zhì)酸）的結(jié)合位點(diǎn)[14]。34-mer被認(rèn)為是LR的結(jié)合位點(diǎn)，而44-mer則是PEDF與ATGL（也稱(chēng)PEDFR）結(jié)合的位點(diǎn)[15]。34肽和44肽不同的生物學(xué)作用，可能涉及不同的膜上受體或信號(hào)通路，這仍需要進(jìn)一步研究?？傊?，34+44組合肽在抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移及促進(jìn)細(xì)胞凋亡顯現(xiàn)出良好的生物學(xué)效應(yīng)，這種組合用藥的方式不僅抗腫瘤效果顯著，且能夠極大降低生產(chǎn)成本，具有臨床轉(zhuǎn)化的可能，同時(shí)也為肺癌聯(lián)合藥物的研發(fā)提供一個(gè)策略。

Author contributions

Zhang H, Chao ZX and Qin XC conceived and designed the study. Chao ZX, Qin XC and Jia CL performed the experiments. Chao ZX, Qin XC and Jia CL analyzed the data.Chao ZX, Qin XC and Jia CL contributed analysis tools. Zhang H, Chao ZX, Qin XC and Jia CL provided critical inputs on design, analysis and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.