黎玉蓮，孫廷麗，陳嘉樂，徐碧霞，謝小保

廣東省科學(xué)院微生物研究所，廣東省微生物分析檢測(cè)中心，華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070

2019年以來，新冠肺炎疫情持續(xù)在全世界蔓延，在抗擊新冠肺炎疫情的過程中，病毒相關(guān)防治知識(shí)得到廣泛傳播，具有抗病毒功能的家紡產(chǎn)品也成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)之一[1]。疫情防控期間，口罩和防護(hù)服等疫情防控用紡織品，作為人體第一道保護(hù)的防護(hù)紡織品，已成為抗病毒感染的有力屏障，是不可或缺的防疫保障物資。防護(hù)紡織產(chǎn)品具有過濾作用，因此口罩佩戴是預(yù)防病原微生物傳染的有效措施之一。在病原菌感染風(fēng)險(xiǎn)高的公共場(chǎng)所，人們通過口罩對(duì)空氣中的傳染性病原菌進(jìn)行過濾處理，可以控制疾病傳染，保障人們的身體健康。各種病原微生物也因此截留在紡織品過濾層上，紡織品若沒有抗微生物性能，病原菌微生物則會(huì)在濾層上聚集和繁殖，這將在使用過程中造成二次感染，嚴(yán)重危害消費(fèi)者身體健康。

疫情防控用紡織品大多數(shù)是疏水性或防水性紡織品，而國際標(biāo)準(zhǔn)化組織制定的國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 18184:2019《紡織品抗病毒活性的測(cè)定》主要適用于吸水性紡織品抗病毒性能檢測(cè)[2]。該標(biāo)準(zhǔn)未提供對(duì)疏水性的紡織品處理的方法，導(dǎo)致該方法不適用于測(cè)試疏水性紡織品的抗病毒性能。疏水性紡織品有沒有抗病毒性能，效果如何，則是消費(fèi)者和生產(chǎn)研發(fā)機(jī)構(gòu)共同關(guān)心的問題[3]。本文通過加入沒有抗微生物性能的表面活性劑來改變疏水性的紡織品的吸水性能或使用不同的接種方式，比較疏水性樣品抗病毒效果差異性，為建立疏水性紡織品抗病毒測(cè)試方法提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品

本實(shí)驗(yàn)選取的紡織品樣本由某抗病毒紡織品研發(fā)機(jī)構(gòu)提供，吸水性的紡織品樣本被命名為樣品A，疏水性的紡織品樣本分別被命名為樣品B、C和D。

1.2 主要試劑和儀器

試驗(yàn)毒株與細(xì)胞：甲型流感病毒H3N2(ATCC VR-1679)，宿主細(xì)胞MDCK細(xì)胞(ATCC.CCL-34)。

相關(guān)培養(yǎng)基和試劑：胎牛血清(Gibco)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，青霉素-鏈霉素雙抗(Gibco)，磷酸鹽緩沖液PBS(Gibco,pH 7.2,0.01M)。

主要試驗(yàn)儀器：二級(jí)生物安全柜(BSC-1360ⅡA2,廣東環(huán)凱)、二氧化碳培養(yǎng)箱(INC153,Memmert)、低溫超速離心機(jī)(Sorvall ST16R,Thermo Fisher)、倒置顯微鏡(ECLIPSE Ts2,Nikon)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1病毒懸液培養(yǎng)

從液氮罐中取出凍存的MDCK細(xì)胞，室溫下融化，隨后加入細(xì)胞培養(yǎng)液，于37 ℃的5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h～24 h，更換細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞長滿單層備用。

將取出低溫凍存的H3N2病毒毒種，于37 ℃水浴融化，隨后接種于以長滿單層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。加入針對(duì)流感病毒的含TPCK胰酶的DMEM，置于34 ℃溫箱中培養(yǎng)，使之與細(xì)胞吸附、生長。逐日觀察病變，待3/4或以上細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，將培養(yǎng)液取出，反復(fù)凍融3次，低溫離心，將含病毒的上清液分裝于滅菌離心管中，冷凍保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2病毒滴度計(jì)數(shù)方法TCID50法

細(xì)胞預(yù)先以105(100 μL)每孔密度接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，移除舊的培養(yǎng)液，每孔加入100 μL新鮮的PBS緩沖液沖洗細(xì)胞三遍，100 μL濃度梯度的病毒懸液分別加入到預(yù)先接種細(xì)胞的96孔板中，對(duì)照組加入100 μL維持液做陰性對(duì)照(NC)，繼續(xù)在37 ℃下培養(yǎng)1 h ～2 h后，棄去上清液，每孔加入100 μL新鮮的PBS緩沖液沖洗細(xì)胞，隨后每孔加入100 μL針對(duì)流感病毒的含TPCK胰酶的DMEM繼續(xù)34 ℃培養(yǎng)4 d～7 d。通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變。確認(rèn)細(xì)胞病變之后用behren和Karber方法計(jì)算病毒TCID50滴度。

1.3.3抗病毒活性實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 相同測(cè)試方法下吸水性不同的樣品的抗病毒實(shí)驗(yàn)

根據(jù)ISO 18184標(biāo)準(zhǔn)，采用吸收法比較樣品A、B、C和D抗病毒性能。詳細(xì)步驟如下所述:取0.40±0.05 g樣品，剪成約20 mm×20 mm大小，將其放入帶蓋子的容器滅菌備用。在對(duì)照樣本和檢測(cè)樣本分別加入0.2 mL病毒滴度為1×107～5×107TCID50/mL病毒后孵育2 h，分別繼續(xù)往瓶子里加入20 mL洗脫液進(jìn)行洗脫，渦旋震蕩5次，回收病毒計(jì)數(shù)。根據(jù)TCID50方法確定感染滴度。空白對(duì)照樣為無抗病毒處理的標(biāo)準(zhǔn)無紡布，根據(jù)5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算最終結(jié)果。

1.3.3.2 使用不同表面活性劑后的抗病毒實(shí)驗(yàn)

使用不同表面活性劑處理，進(jìn)一步比較疏水性樣品抗病毒效果差異性。按1.3.3.1制備樣品，將接種病毒液加入0.5%吐溫-80、0.01%Triton X-100或0.4%十二烷基硫酸鈉作為分散劑，再按照1.3.3.1進(jìn)行抗病毒測(cè)試，根據(jù)5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算最終結(jié)果。

1.3.3.3 采取不同接種方式的抗病毒實(shí)驗(yàn)

采用不同接種方式，進(jìn)一步比較疏水性樣品抗病毒效果差異性。詳述如下：

吸收法：同1.3.3.1。

貼膜法：將樣品剪成約每片50 mm×50 mm，正面向上放入培養(yǎng)皿中滅菌備用。首先在對(duì)照樣本和檢測(cè)樣本分別加入0.2 mL病毒滴度為1×107～5×107TCID50/mL病毒液，隨后給貼膜實(shí)驗(yàn)組貼上50 mm×50 mm大小的覆蓋膜。孵育2 h后，最后分別往培養(yǎng)皿里加入20 mL洗脫液洗脫，回收病毒計(jì)數(shù)。根據(jù)TCID50方法確定感染滴度。根據(jù)5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算最終結(jié)果。

振蕩法：取(0.40±0.05)g樣品，剪成約10 mm×10 mm大小，放入三角燒瓶中滅菌備用。首先分別加入20 mL DMEM培養(yǎng)基到每個(gè)三角燒瓶中混勻。隨后加入0.2 mL病毒滴度為1×107～5×107TCID50/mL病毒懸液震蕩2 h。最后回收病毒計(jì)數(shù)。根據(jù)TCID50方法確定感染滴度。根據(jù)5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算最終結(jié)果。

1.3.3.4 使用表面活性劑和采取不同接種方式的抗病毒實(shí)驗(yàn)

將接種病毒液加入0.5%吐溫-80，再使用1.3.3.3的貼膜法和振蕩法進(jìn)行抗病毒測(cè)試。根據(jù)5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算最終結(jié)果。

1.4 結(jié)果計(jì)算

抗病毒活性值(Mv)=對(duì)照樣品lgTCID50/mL-抗病毒檢測(cè)樣品lgTCID50/mL。涉及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的均使用軟件GraphPad Prism計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 相同測(cè)試方法下吸水性不同的樣品的抗病毒效果

將吸水性紡織品樣品A和疏水性紡織品樣品B、C、D使用吸收法進(jìn)行抗病毒性能的檢測(cè)，5次重復(fù)試驗(yàn)平均值為最終結(jié)果。如圖1所示，樣品A吸水性能相對(duì)較好，抗病毒活性值相對(duì)較高，結(jié)果穩(wěn)定，抗病毒平均值為(2.61±0.06)。疏水性樣品B、C、D的抗病毒活性平均值分別為(1.08±0.35)、(1.68±0.43)、(1.02±0.30)。由于病毒懸液不能均勻分散到疏水性紡織品中，直接采用吸收法測(cè)試其抗病毒性能，結(jié)果普遍偏低且不穩(wěn)定。

圖1 相同測(cè)試方法下吸水性不同的樣品的抗病毒活性值

2.2 使用不同表面活性劑后的抗病毒效果

將接種病毒液加入0.5%吐溫-80、0.01%Triton X-100或0.4%十二烷基硫酸鈉作為分散劑進(jìn)行抗病毒測(cè)試。由圖2可以看出，疏水性樣品B經(jīng)0.5%吐溫-80、Triton X-100或十二烷基硫酸鈉處理后與無任何處理的測(cè)試結(jié)果相比，其抗病毒效果有一定的提高，其中經(jīng)0.5%吐溫-80處理后的結(jié)果重復(fù)性較好且抗病毒效果有明顯改善，其平均抗病毒活性值為(1.86±0.18)。樣品C使用不同表面活性劑后，其抗病毒效果和其重復(fù)性均有提高。樣品D使用不同表面活性劑后，其抗病毒效果無明顯變化，但結(jié)果的重復(fù)性有所提高。具體結(jié)果見圖2。僅使用表面活性劑改變吸水性能，抗病毒效果雖有一定的提高，但重復(fù)性較差。

圖2 使用不同表面活性劑后的抗病毒活性值

2.3 采取不同接種方式的抗病毒效果

吸收法、貼膜法和振蕩法三種不同接種方式被用來比較不同樣品抗病毒效果，5次重復(fù)試驗(yàn)平均值為最終結(jié)果。從圖3數(shù)據(jù)可知，對(duì)于疏水性樣品B，采用貼膜法的抗病毒活性值為(2.15±0.23)，抗病毒效果顯著的改善；采用振蕩法的抗病毒效果也有明顯的提高，而且結(jié)果穩(wěn)定。樣品C使用吸收法、貼膜法與振蕩法的抗病毒活性值分別為(1.68±0.43)、(2.22±0.28)、(2.23±0.22)；與吸收法相比，其他接種方式結(jié)果穩(wěn)定性明顯提高。樣品D使用貼膜法或振蕩法的抗病毒效果也有相對(duì)的改善，抗病毒結(jié)果的重復(fù)性也有明顯的提高。采用貼膜法或振蕩法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，增加病毒液在樣品中分散均勻性，疏水性紡織品抗病毒結(jié)果均有明顯的改善，結(jié)果的穩(wěn)定也有所提高。

圖3 采取不同接種方式的抗病毒活性值

2.4 使用表面活性劑和采取不同接種方式的抗病毒效果

選用效果較好的0.5%吐溫-80表面活性劑，進(jìn)一步使用貼膜法和振蕩法進(jìn)行抗病毒測(cè)試，5次重復(fù)試驗(yàn)平均值為最終結(jié)果。如圖4所示，樣品B、C、D的抗病毒效果與傳統(tǒng)吸收法測(cè)試方法相比，抗病毒效果大大改善，而且結(jié)果穩(wěn)定。樣品B采用0.5%吐溫-80+振蕩法的抗病毒活性值達(dá)到(2.57±0.09)。樣品C采用0.5%吐溫-80+貼膜法和采用0.5%吐溫-80+振蕩法的抗病毒活性值分別為(2.52±0.13)、(2.51±0.10)。樣品D采用0.5%吐溫-80+貼膜法和采用0.5%吐溫-80+振蕩法的抗病毒活性值分別為(1.79±0.12)、(1.86±0.07)。說明通過采用不同接種方式并加入表面活性劑來改變吸水性能，與僅使用表面活性劑改變吸水性能或僅改變接觸方式相比，疏水性紡織品抗病毒效果有更好的改善，抗病毒結(jié)果重復(fù)性好，可為將來建立疏水性的紡織品抗病毒測(cè)試方法提供參考依據(jù)。

圖4 使用表面活性劑和采取不同接種方式的抗病毒活性值

3 結(jié)論

抗病毒織物主要是通過對(duì)病毒有滅活作用的整理助劑來實(shí)現(xiàn)其功能[4]。其作用機(jī)理包括抗病毒基團(tuán)與病毒表面接觸，并與蛋白衣殼結(jié)合，使其變性、變裂。變性使病毒損失對(duì)宿主細(xì)胞的吸附能力，失去生存的必要條件，變裂則使病毒衣殼內(nèi)的核酸外流、斷裂，遭到徹底破壞而失去感染性[5]。本實(shí)驗(yàn)通過加入表面活性劑提高疏水性紡織品中的吸水性能，采用不同接種方式探索提高疏水性紡織品吸水性能的策略，為建立疏水性的紡織品抗病毒試驗(yàn)方法提供科學(xué)依據(jù)。

抗菌紡織品的檢測(cè)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)較為完善，但目前我國尚沒有抗病毒織物的國家標(biāo)準(zhǔn)，ISO18184：2019測(cè)試范圍也僅規(guī)定了機(jī)織物和針織物、纖維、紗線、編織物等的測(cè)試方法，其測(cè)試方法采用的是吸收法。本文涉及到的目前廣泛使用的的疏水性或弱吸水性能的紡織品產(chǎn)品有手術(shù)衣、口罩、手術(shù)罩單、毛巾、襪子、手套等，已作為抗病毒織物已經(jīng)被廣泛使用。但是ISO18184：2019抗病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)并不適用于上述的疏水性紡織品，因此還需要進(jìn)一步研究建立新的測(cè)試方法。

探索疏水性紡織品抗病毒性能方法，積極研究制定疏水性紡織品抗病毒試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)，以補(bǔ)充完善我國抗微生物紡織品的標(biāo)準(zhǔn)體系，不僅可以規(guī)范市場(chǎng)，促進(jìn)行業(yè)的良性競(jìng)爭，而且也有助于提高產(chǎn)品的質(zhì)量，增加產(chǎn)品的附加值，打破國外技術(shù)壁壘，實(shí)現(xiàn)我國紡織品行業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。