張 洋

安徽國科檢測科技有限公司，安徽合肥 230001

中國白酒是世界上最古老的蒸餾酒精飲料之一，通常它以谷物為原料，以大曲為發(fā)酵劑，通過復(fù)雜的生化反應(yīng)獲得。大曲以小麥等谷物為原料,進(jìn)行固態(tài)生料發(fā)酵。大曲的類型決定了白酒的風(fēng)味特征，其相應(yīng)的被劃分為清香型、濃香型、醬香型和其它香型[1]。大曲作為白酒生產(chǎn)中主要的微生物酶源，其質(zhì)量直接關(guān)系到出酒率與酒的品質(zhì)。

濃香型白酒因香氣濃郁成為我國最受歡迎的蒸餾酒[2]。濃香型白酒是由谷物(高粱、玉米、大米、小麥和糯米)與作為糖化和發(fā)酵劑的濃香大曲粉混合發(fā)酵而成。濃香型大曲的制作復(fù)雜，制備需歷時將近四個月。傳統(tǒng)濃香型白酒大曲的制備如圖1所示。

圖1 傳統(tǒng)濃香白酒大曲生產(chǎn)工藝流程圖

傳統(tǒng)大曲制作采用自然接種，不添加額外的微生物。對濃香型白酒大曲微生物群落已進(jìn)行了密集的研究[3-4]，但到目前為止，大多數(shù)研究集中在最終產(chǎn)物上。針對不同生產(chǎn)過程條件下濃香型白酒大曲中微生物群落的研究仍很少。另外，濃香型白酒大曲發(fā)酵過程中微生物動態(tài)與理化性質(zhì)和生化特性的關(guān)系也鮮有報道。

因此，本研究利用聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)研究了濃香型大曲生產(chǎn)過程中細(xì)菌和真菌群落的多樣性。此外，對整個發(fā)酵過程中微生物群落的變化與理化和生化因子變化之間的關(guān)系進(jìn)行了探索。本實(shí)驗(yàn)研究有助于提高我們對濃香型白酒大曲發(fā)酵過程中微生物組成及演替的認(rèn)識，也為今后設(shè)計更有效的大曲發(fā)酵工藝提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1酒曲

濃香型大曲樣品由安徽迎駕貢酒股份有限公司隨機(jī)從曲房上層、中層和下層抽出，然后在酒精消毒研磨機(jī)中將塊磨成粉末，將大約100 g濃香型大曲粉末樣品轉(zhuǎn)移到無菌袋中，密封置-20 ℃下保存供分析。

1.1.2主要試劑

DNA抽提試劑盒(Fast DNA? Spin Kit for Soil,MPbio,USA)，Taq DNA聚合酶 (5 U/μL，上海生工)。

1.2 主要儀器

DCode通用突變檢測系統(tǒng)(BioRad，Richmond，CA，USA)，成像密度計GS-710 (BioRad，CA，美國)，PCR純化試劑盒(中國上海生工)，Quantity One軟件(Quantity One 4.0.1，BioRad，美國)，電子溫度傳感器(OMEGA工程公司，美國)。

1.3 方法

1.3.1DNA 抽提和PCR擴(kuò)增

使用快速DNA抽提試劑盒從各階段濃香型大曲樣品中提取總基因組DNA。利用通用細(xì)菌引物對27f (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r (5′-CGGCTACCTTGTTACGAC-3′)[5]擴(kuò)增16S rDNA基因的細(xì)菌V3區(qū)。為了分析真菌的多樣性，用真菌通用引物GC-Fung (5′-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CAT TCC CCG TTA CCC GTT G-3′)和NS1 (5′-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′)對18S rRNA基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，目標(biāo)長度～400 bp[6]。反應(yīng)混合體系由5 μL的10×PCR緩沖液、3.2 μL的dNTPs(2.5 mM)、0.4 μL的Taq DNA聚合酶、1 μL的每個引物(20 μM)、5 μL的模板DNA(約50 ng)和雙蒸水(ddH2O)組成，使最終體積達(dá)到50 μL。

細(xì)菌(27f,1492r)PCR反應(yīng)在94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃預(yù)變性30次，變性60 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃延伸10 min的條件下進(jìn)行。為了分析真菌的多樣性，PCR條件為：94 ℃處理5 min，94 ℃變性35次，變性30 min，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸引物1 min，72 ℃一步擴(kuò)增10 min。用Green VIEW對1×TAE瓊脂糖凝膠進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(DGGE)。

1.3.2擴(kuò)增產(chǎn)物的PCR-DGGE分析

DCode通用突變檢測系統(tǒng)用于PCR擴(kuò)增片段的序列特異性分離。為了確定細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，使用聚丙烯酰胺凝膠(7% (W/V)丙烯酰胺/雙丙烯酰胺凝膠37.5∶1)進(jìn)行電泳，其中含有35%～55%脲甲酰胺變性梯度(100%對應(yīng)于7 mol/L脲和40%(W/V)甲酰胺)，在1×TAE緩沖液中處于恒定V。在60 ℃下，56伏特為14 h。為確定真菌群落結(jié)構(gòu)，用15%～35%的變性梯度的8%聚丙烯酰胺凝膠分析了引物GC-Fung和NS1獲得的PCR產(chǎn)物，在1×TAE緩沖液中在60 ℃恒壓100 V下進(jìn)行17 h的分離。在DGGE電泳后，用AgNO3溶液對凝膠進(jìn)行染色[6]。使用經(jīng)校準(zhǔn)的成像密度計GS-710，用Quantity One軟件掃描從DGGE獲得的指紋圖譜。

1.3.3DGGE 條帶的切割和測序

使用無菌手術(shù)刀片從凝膠中切取DGGE圖譜條帶。在4 ℃下，條帶放入50 μL的ddH2O中孵育，洗脫DNA。然后將2 μL的洗脫DNA按上述方法進(jìn)行PCR再擴(kuò)增。然后用DGGE分析每個再擴(kuò)增的產(chǎn)物以及原始樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物，以確定條帶位置和純度。接著用通用PCR純化試劑盒純化已確認(rèn)的PCR產(chǎn)物，送商業(yè)測序公司進(jìn)行克隆和測序。然后將所獲得的序列與GenBank中的16S rRNA基因和18S rRNA基因序列進(jìn)行比較 (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)識別同源性最強(qiáng)的親緣家屬。

1.3.4分析方法

電子溫度傳感器被插入大曲坯塊中心，用于連續(xù)在線檢測大曲磚芯溫度和室溫。水分、酸度、淀粉、還原糖、氨基氮、α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶和酯酶的活性測定采用大曲通用分析方法[7]。

1.3.5數(shù)據(jù)分析

使用Quantity One軟件進(jìn)行群落多樣性分析。該軟件用于將每個DGGE車道轉(zhuǎn)換為密度分布圖。利用一般多樣性Shannon index指數(shù)(H)、微生物群落豐度(S)和均勻度指數(shù)(E)對DGGE結(jié)果進(jìn)行分析，并根據(jù)條帶的數(shù)量和相對強(qiáng)度進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 大曲發(fā)酵過程中細(xì)菌菌群動態(tài)變化

采用DGGE技術(shù)對大曲樣品中提取的16S rRNA基因V3區(qū)擴(kuò)增片段進(jìn)行了分析,得到的DGGE指紋圖譜如圖2所示。DGGE圖譜中的條帶反映了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性。根據(jù)平均光密度值可以計算出每個條帶豐度。

A，B，C，D，E分別代表取自大曲發(fā)酵過程中安曲、培菌期、頂火期、緩落期和打壟期的樣品。圖2 濃香型大曲發(fā)酵不同階段細(xì)菌群落16S rRNA基因的PCR-DGGE指紋圖譜

大曲發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性指數(shù)如表1所示。由表1可知，培菌期大曲多樣性指數(shù)高于安曲、頂火期、緩落期和打壟期，表明培菌期微生物多樣性最高。此外，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的條帶均勻性在培菌期樣品中也最高，表明細(xì)菌群落具有優(yōu)良的均勻性。從總體物種豐富度來看(根據(jù)PCR-DGGE圖譜中單一泳道內(nèi)的主要條帶數(shù)量進(jìn)行估計)，培菌期(泳道B)比其它階段(泳道A、C、D和E)具有更多的條帶。

表1 濃香型大曲不同發(fā)酵階段細(xì)菌群落微生物多樣性指數(shù)

為了進(jìn)一步了解濃香型大曲發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落組成，將DGGE圖譜中出現(xiàn)的優(yōu)勢條帶(圖2中以數(shù)字標(biāo)識的條帶)從聚丙烯酰胺凝膠中切膠回收、擴(kuò)增和測序。27個優(yōu)勢條帶的測序結(jié)果在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對，確定對應(yīng)條帶種屬信息。結(jié)果匯總見表2。

表2 16S rRNA V3區(qū)基因的PCR-DGGE切膠條帶的測序分析結(jié)果

2.2 大曲發(fā)酵過程中真核微生物菌群動態(tài)變化

本實(shí)驗(yàn)還通過18S rDNA PCR-DGGE圖譜，揭示了大曲發(fā)酵過程中真核微生物群落的變化和大曲豐度。如圖3所示，所有樣品均呈現(xiàn)8～16條清晰帶，表明樣品經(jīng)30%～55%聚丙烯酰胺凝膠分離效果較好。此外，頂火期中條帶15、條帶18強(qiáng)度較培菌期明顯增強(qiáng)，這可能是由于高溫促進(jìn)了熱穩(wěn)定性真核微生物繁殖所致。

A，B，C，D，E分別代表樣品收集自大曲發(fā)酵過程中的安曲、培菌期、頂火期、緩落期和打壟期。圖3 濃香型大曲不同發(fā)酵階段真核微生物群落DGGE圖譜

與頂火期相比，緩落期中代表真核微生物群落的條帶10、條帶11、條帶12和條帶13灰度均增強(qiáng)，而以條帶15和條帶16為代表的微生物數(shù)量減少，說明微生物間的競爭可能會引起微生物群落數(shù)量的改變。此外，以條帶10、條帶11、條帶12和條帶13為代表的微生物群落之間可能存在互惠共生關(guān)系。

表3顯示了大曲不同發(fā)酵階段中真核微生物群落多樣性指數(shù)變化情況。從總體物種豐度來看(根據(jù)PCR-DGGE圖譜中出現(xiàn)的主要條帶的數(shù)量來估計)，緩落期樣品中(圖3中標(biāo)記為D)出現(xiàn)的條帶數(shù)最多，表明此階段樣品中真核微生物群落多樣性最大。此外，較其它期相比，緩落期樣品中條帶均勻度更高，表明該期真核微生物群落更趨于平衡。

為進(jìn)一步研究大曲發(fā)酵不同階段真核微生物菌群組成，DGGE電泳后(圖3)，對其中20個主要條帶進(jìn)行切膠回收、克隆、比對和測序。測序結(jié)果經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫比對后結(jié)果見表4?？偟膩碚f，圖3、表3和表4的數(shù)據(jù)揭示了傳統(tǒng)大曲培養(yǎng)過程中真核微生物種類的變化情況。

表3 濃香型大曲不同發(fā)酵階段真菌群落微生物多樣性指數(shù)

表4 利用BLAST技術(shù)從DGGE凝膠切出的條帶的18S rRNA基因序列的同一性

2.3 發(fā)酵過程中理化和生物指標(biāo)的變化

本實(shí)驗(yàn)對大曲發(fā)酵過程中的理化和生物因子的變化也進(jìn)行了考察，結(jié)果見圖4。

(A)培養(yǎng)室溫和曲心溫度

圖4A顯示了大曲曲心溫度隨著培養(yǎng)時間的延長是逐漸升高的，一直達(dá)到最大值(62 ℃)，維持一段時間后逐漸下降。曲房溫度較大曲曲心溫度相比變化不大。大曲在培養(yǎng)過程中，水分含量是逐漸下降的，從入房安曲階段的39.1 %下降至打壟期結(jié)束后的12.2 % (圖4B)。

圖4B和圖4C顯示了偏高溫大曲總酸度、還原糖、氨基氮含量從安曲到培菌期末是逐漸增加的。這證實(shí)了在此期間，由于適宜的溫度和濕度，大曲微生物大量繁殖，促進(jìn)了各種有機(jī)酸的積累，并導(dǎo)致總酸度進(jìn)一步增加，在培菌期結(jié)束時總酸度達(dá)到最大值，為11.375 mmoL/10 g大曲。

本實(shí)驗(yàn)還采用了可培養(yǎng)法對濃香型大曲發(fā)酵五個階段的細(xì)菌總數(shù)、霉菌數(shù)和酵母菌數(shù)進(jìn)行了分析。如圖4D所示，在發(fā)酵開始時存在少量細(xì)菌(安曲)。在此階段后，細(xì)菌總數(shù)迅速增加，在培菌期結(jié)束時達(dá)到最高值。然后在頂火期細(xì)菌數(shù)量降至最低。隨著發(fā)酵溫度降低，大曲進(jìn)入緩落期，此時細(xì)菌數(shù)量略有增加，但打壟期又再次下降。打壟期細(xì)菌數(shù)量下降的原因可能是由于該期大曲坯塊中低水分含量限制了大多數(shù)微生物的生長繁殖。大曲中水分能有助于調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度。水分具有較高的熱容，能夠有效的吸收微生物代謝釋放的熱量，因而能夠防止大曲溫度增加過快。大曲中霉菌變化趨勢與細(xì)菌類似，在頂火期時，其菌數(shù)達(dá)到最大值，為2.75×106CFU/g大曲。酵母菌數(shù)在培菌期末期達(dá)到了最大值，隨后逐漸下降直至發(fā)酵結(jié)束(圖4D )。

2.4 理化、生化指標(biāo)與微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性

為了研究強(qiáng)濃香型大曲的理化、生物指標(biāo)與微生物多樣性(以Shannon-Wiener指數(shù)表示)之間的關(guān)系，進(jìn)行了典型相關(guān)分析，結(jié)果見表5。水分含量與淀粉含量呈顯著正相關(guān)，與其它理化指標(biāo)和生化指標(biāo)呈顯著負(fù)相關(guān)。酸度與淀粉呈顯著負(fù)相關(guān)，與其它指標(biāo)呈顯著正相關(guān)。還原糖、氨基氮、α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶和酯酶之間均呈正相關(guān)。該發(fā)現(xiàn)揭示了理化、生化指標(biāo)對微生物群落的正、負(fù)效應(yīng)。因此，微生物群落指標(biāo)應(yīng)被視為大曲質(zhì)量評價的一個組成部分。大曲微生物受內(nèi)部、外部環(huán)境的影響，使大曲各項(xiàng)指標(biāo)及微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)的變化。通過對大曲各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性的綜合分析，有助于大曲發(fā)酵微生物內(nèi)部以及微生物之間的代謝機(jī)理的進(jìn)一步認(rèn)識，從而有助于大曲發(fā)酵條件的控制，通過發(fā)酵過程溫度、濕度、時間的控制，有意識的改變微生物群落結(jié)構(gòu)及代謝產(chǎn)物，使大曲發(fā)酵向有利的方向進(jìn)行。

表5 理化、生化指標(biāo)與微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析

3 結(jié)論

本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)對濃香型白酒大曲生產(chǎn)過程中細(xì)菌和真菌群落的多樣性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，16S rDNA的條帶數(shù)、優(yōu)勢度、多樣性和相似性在DGGE模式中明顯不同，反映了不同階段存在的細(xì)菌群落的廣泛多樣性。真核微生物群落的條帶豐度和優(yōu)勢度在不同時期有所不同。大曲的理化、生物因子變化情況表明，大曲的核心溫度在頂火期上升到最大值，隨后下降。水分和淀粉含量在整個發(fā)酵過程中不斷下降。總酸、還原糖、氨基氮、α-淀粉酶活性、糖化酶活性、蛋白酶活性、細(xì)菌和霉菌在培菌期末達(dá)到最大值，進(jìn)入頂火期開始下降，到達(dá)緩落期略有增加，隨后幾乎保持不變直至發(fā)酵結(jié)束。酯酶活性變化趨勢與其它酶變化趨勢相似，但其在培菌期后略有上升。酵母菌最大菌數(shù)同樣在培菌期達(dá)到最大值，隨后逐漸下降。相關(guān)分析表明，細(xì)菌和真菌多樣性分別與水分、淀粉呈負(fù)相關(guān)，與其它指標(biāo)呈正相關(guān)。其中，還原糖、氨基氮、α-淀粉酶和蛋白酶與細(xì)菌呈顯著或極顯著正相關(guān)，糖化酶和酯酶與真菌呈顯著或極顯著正相關(guān)。

本研究有助于提高我們對濃香型白酒大曲發(fā)酵過程中微生物組成及演替的認(rèn)識，也為今后設(shè)計更有效的大曲發(fā)酵工藝提供了有價值的參考，對指導(dǎo)濃香型白酒大曲生產(chǎn)工藝改進(jìn)具有重要的理論和實(shí)踐意義。