劉亞萍，錢佳俊，鄭雯清，易文濤，王世杰，楊 玲，艾連中，熊智強(qiáng)*

1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海食品微生物工程研究中心，上海 200093;2.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018;3.河北一然生物科技有限公司，河北 石家莊 050899

雙歧桿菌(Bifidobacterium)屬于細(xì)菌域、放線菌門、放線菌綱、放線菌目、雙歧桿菌科、雙歧桿菌屬，是一類不運(yùn)動(dòng)、不產(chǎn)孢子、不產(chǎn)氣和嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陽(yáng)性菌，主要存在于哺乳動(dòng)物的胃腸道(GIT)及口腔等環(huán)境。由于對(duì)人體健康具有生物屏障、改善胃腸道功能和抗衰老等重要生理功能，被認(rèn)為是腸道健康的指示菌[1]。然而，雙歧桿菌對(duì)氧氣具有高度敏感性，氧不完全還原的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)可引起蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和聚集、DNA損傷和脂質(zhì)過(guò)氧化等有害影響[2]。雙歧桿菌作為一類具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的益生菌，其對(duì)氧敏感是限制在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域中應(yīng)用的重要因素。因此，本文在蛋白水平上綜述雙歧桿菌中參與氧化脅迫的酶、分子伴侶和調(diào)節(jié)因子，理解雙歧桿菌抗氧化脅迫機(jī)制，以期為雙歧桿菌產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 雙歧桿菌的活性氧損傷

分子氧(O2)是一種非極性小分子，可以自由跨越細(xì)胞膜，并從電子傳遞酶類暴露的還原基團(tuán)接受外界電子，隨著連續(xù)加入電子產(chǎn)生超氧陰離子(O2-)、過(guò)氧化氫(H2O2)和羥自由基(OH-)等ROS[3]，其主要來(lái)源于生存環(huán)境的氧化還原反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)酶自氧化、NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)催化、其他競(jìng)爭(zhēng)性微生物的釋放等生理過(guò)程[4]。產(chǎn)生的ROS通過(guò)破壞雙歧桿菌細(xì)胞膜磷脂、蛋白質(zhì)、鐵依賴酶和DNA/RNA的完整性對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致雙歧桿菌產(chǎn)生表達(dá)紊亂、代謝失調(diào)、細(xì)胞生長(zhǎng)停滯甚至死亡等危害(圖1)。

圖1 雙歧桿菌活性氧損傷

2 雙歧桿菌氧脅迫應(yīng)答機(jī)制

大腸桿菌是細(xì)菌中對(duì)氧化應(yīng)激和防御機(jī)制研究最透徹的模式生物，當(dāng)細(xì)胞受到外源性H2O2的脅迫時(shí)，其中OxyR和SoxRS作為ROS感應(yīng)調(diào)節(jié)因子參與氧脅迫應(yīng)答，激活烷基過(guò)氧化氫還原酶(Alkylhydroperoxide reductase,Ahp)、過(guò)氧化氫酶(Catalase,CAT)等多種ROS清除酶，同時(shí)促進(jìn)鐵吸收儲(chǔ)藏、Fe-S簇合成組裝，抑制Fenton反應(yīng)，并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子和sRNA表達(dá)，保護(hù)DNA和促進(jìn)DNA損傷修復(fù)[5]。其他厭氧微生物中，乳酸菌在應(yīng)答氧化脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、CAT等多種ROS清除酶[6,7]；巰基-二硫鍵氧化還原系統(tǒng)催化蛋白質(zhì)二硫鍵/二巰基電子交換向巰基依賴酶類提供電子保持蛋白活性；GroEL、Hsp20、Clp和DanK等伴侶蛋白參與防止蛋白質(zhì)變性、聚集和錯(cuò)誤折疊過(guò)程[8]。

相比大腸桿菌和乳酸菌，在雙歧桿菌基因組中未發(fā)現(xiàn)OxyR和SoxRS編碼基因，但含有鐵攝取調(diào)節(jié)因子Fur編碼基因，然而對(duì)短雙歧桿菌UCC2003鐵調(diào)節(jié)研究中證實(shí)Fur不參與氧脅迫應(yīng)答[9]。此外，雙歧桿菌基因組中也沒(méi)有編碼谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase,GR)、CAT和SOD等常見(jiàn)的ROS清除酶類基因[10]。因此，大腸桿菌和乳酸菌的抗氧化脅迫機(jī)制并不適用于雙歧桿菌，需探尋雙歧桿菌ROS清除途徑機(jī)制。對(duì)雙歧桿菌生理、生化和組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌氧脅迫應(yīng)答呈現(xiàn)復(fù)雜且相互作用的網(wǎng)絡(luò)。例如，ZOMER等在短雙歧桿菌UCC2003中建立主要由clgR、lexA、hrcA和hspR等因子調(diào)控的氧化應(yīng)激網(wǎng)絡(luò)模型[11]。在雙歧桿菌有氧培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的Ahp是內(nèi)源性H2O2的主要清除劑[12]；SATOH證實(shí)雙歧桿菌中存在TrxR-AhpC系統(tǒng)，保護(hù)雙歧桿菌免受氧化應(yīng)激[13]；NOX和氧依賴性輔卟啉原III氧化酶(coproporphyrinogen III oxidase,HemN)參與動(dòng)物雙歧桿菌中對(duì)O2或H2O2的解毒[14]。分子伴侶和蛋白酶在氧化應(yīng)激中起著關(guān)鍵作用，抑制由應(yīng)激引起的蛋白質(zhì)變性、聚集和錯(cuò)誤折疊，保護(hù)多種蛋白質(zhì)免受氧化損傷[15]。HUANG等從百歲老人糞便中篩出一株具有較強(qiáng)抗氧化的長(zhǎng)雙歧桿菌LTBL16，通過(guò)分析其基因組發(fā)現(xiàn)3個(gè)過(guò)氧化物酶(LTBL-000027、LTBL-000028和LTBL-000976)和1個(gè)NOX編碼基因(LTBL-001911)，能改善抗氧化酶FoxO依賴性轉(zhuǎn)錄，降低細(xì)胞中ROS水平，這些基因的豐度可能與ROS清除率和耐氧有關(guān)[16]。MOZZETTI等利用固定化細(xì)胞技術(shù)培養(yǎng)雙歧桿菌，篩選出一株適應(yīng)過(guò)氧化氫的長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2705-HPR2，與原始菌株相比存在兩個(gè)參與跨膜運(yùn)輸?shù)木幋a基因BL1404和BL0931，闡明其存在有助于提高雙歧桿菌對(duì)氧化應(yīng)激抗性[17]。

2.1 NAD(P)H氧化酶

NOX是產(chǎn)生ROS的主要來(lái)源，可將進(jìn)入細(xì)胞的氧氣進(jìn)行氧化還原(圖2)，產(chǎn)生O2-和H2O2[18]。乳酸菌中CAT可將H2O2還原為H2O[19]，但雙歧桿菌中沒(méi)有CAT編碼基因。氧敏感型雙歧桿菌中，表現(xiàn)出較高的NOX活性，耐氧型雙歧桿菌則表現(xiàn)出極低的NOX活性[10]。在嬰兒雙歧桿菌中敲除nox可降低H2O2生成，減輕菌株對(duì)O2的敏感性[20]。因此，NOX是影響雙歧桿菌氧脅迫耐受能力的重要因素。

2.2 硫氧還蛋白系統(tǒng)(Thioredoxin system,TrxR)

細(xì)菌通常利用Ahp兩個(gè)亞基AhpF和AhpC還原細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物底物，來(lái)緩解細(xì)胞抗氧化壓力[21]。在雙歧桿菌中不含有AhpF，但含有AhpC和TrxR編碼基因。TrxR是NAD(P)H依賴性二硫化物還原酶系統(tǒng)，負(fù)責(zé)多種過(guò)氧化物酶包括谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase,Gpx)和AhpC的還原，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡。TrxR與AhpC相互作用構(gòu)成TrxR-AhpC通路，保護(hù)雙歧桿菌免受氧化應(yīng)激(圖2)。SATOH等從一株氧敏感雙歧桿菌JCM1255T在有氧環(huán)境下的NOX活性組分中純化得TrxR，證實(shí)TrxR-AhpC通路對(duì)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的H2O2進(jìn)行降解，闡明其在雙歧桿菌氧化脅迫應(yīng)激中的調(diào)控作用[13]。雙歧桿菌中含有類似于TrxR的TrxB(Thioredoxin reductase-like protein)，與大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中的AhpF具有同源性，且過(guò)表達(dá)AhpC時(shí)TrxB的表達(dá)量也顯著上調(diào)，表明TrxB受AhpC的反饋調(diào)節(jié)[12]。

2.3 保護(hù)鐵硫蛋白(iron-sulfur proteins,Fe/S protein)

O2可通過(guò)Fenton反應(yīng)直接攻擊[Fe-S]酶中的鐵離子(圖2)，氧化釋放出鐵離子導(dǎo)致酶失活，同時(shí)產(chǎn)生的OH-繼續(xù)攻擊細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸，導(dǎo)致DNA損傷斷裂，影響細(xì)胞的代謝與生長(zhǎng)[22]。在大腸桿菌氧化脅迫機(jī)制中，H2O2激活OxyR和PerR轉(zhuǎn)錄調(diào)控以清除ROS、保護(hù)DNA、減少氧化毒性[23,24]。Fur可調(diào)控鐵吸收，DNA結(jié)合類鐵蛋白(Dps)清除游離鐵以抑制Fenton反應(yīng)[25]，鐵硫簇組裝蛋白(Suf家族)促進(jìn)Fe-S簇蛋白合成[26]。盡管在雙歧桿菌基因組中未發(fā)現(xiàn)OxyR和PerR編碼基因，但含有fur、dps和sufBCD編碼基因，可參與到Fe-S簇蛋白合成和保護(hù)，進(jìn)而清除細(xì)胞內(nèi)OH-，減輕ROS對(duì)雙歧桿菌的損傷。

圖2 雙歧桿菌活性氧代謝途徑

2.4 分子伴侶

2.5 調(diào)節(jié)因子

調(diào)節(jié)因子通過(guò)控制靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在雙歧桿菌抗氧化脅迫應(yīng)激中起到調(diào)控作用(表1)。例如，Dps參與羥自由基清除的調(diào)控[10]，非特異性結(jié)合DNA，防止DNA降解，通過(guò)結(jié)合氧化鐵抑制Fenton反應(yīng)產(chǎn)生OH-[28]。氧化脅迫可觸發(fā)雙歧桿菌的SOS響應(yīng)，RecA和LexA是主要調(diào)節(jié)因子。正常生長(zhǎng)條件下，SOS受LexA的抑制調(diào)控，氧化脅迫時(shí)DNA損傷導(dǎo)致復(fù)制區(qū)單鏈DNA積累，激活RecA使LexA解離并激活SOS中recA、recX和clgR等修復(fù)基因的表達(dá)[29]。

表1 雙歧桿菌氧耐受相關(guān)的伴侶蛋白和調(diào)節(jié)因子

3 展望

雙歧桿菌作為具有代表性和重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的益生菌，厭氧特性是影響其在工業(yè)應(yīng)用的重要限制因素。因此，解析雙歧桿菌氧脅迫應(yīng)答機(jī)制并提高氧化脅迫耐受性是雙歧桿菌工業(yè)化瓶頸的關(guān)鍵。通常提高雙歧桿菌抗氧化脅迫方法包括添加保護(hù)劑、包埋法、與其他乳酸菌共培養(yǎng)和適應(yīng)性訓(xùn)化。分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌缺少ROS調(diào)節(jié)因子和清除酶等基因，導(dǎo)致氧化脅迫響應(yīng)機(jī)制與其他厭氧細(xì)菌具有明顯差異。本文在蛋白層面上總結(jié)雙歧桿菌中參與氧脅迫響應(yīng)的酶、分子伴侶和調(diào)節(jié)因子及其應(yīng)答，未來(lái)可結(jié)合基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組等多組學(xué)方法對(duì)雙歧桿菌氧脅迫響應(yīng)中關(guān)鍵基因和代謝物進(jìn)行功能鑒定，為深入解析雙歧桿菌抗氧脅迫機(jī)制提供依據(jù)。

近年來(lái)IncRNA、miRNA和sRNA等非編碼RNA被大量研究[32]，在調(diào)控細(xì)胞凋亡和物質(zhì)代謝等重要生理活動(dòng)中起到關(guān)鍵作用。例如，大腸桿菌中存在sRNA SorX抑制調(diào)控多胺轉(zhuǎn)運(yùn)體的一個(gè)亞基的potAmRNA，降低亞精胺攝取，提高對(duì)單線態(tài)氧(Singlet oxygen)和氫過(guò)氧化物(Hydroperoxide)的敏感性，減輕氧化損傷[33]。雖然細(xì)菌抗逆相關(guān)的非編碼RNA已有較多報(bào)道，但雙歧桿菌非編碼RNA研究尚處于起步階段，對(duì)其開(kāi)展生理功能鑒定和分子機(jī)制解析等研究，有望為系統(tǒng)闡釋雙歧桿菌氧脅迫應(yīng)答提供新的方向。