馮小婉，張 匯，賴?guó)P羲，艾連中

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海 200093

乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖(EPS)對(duì)食品的流變性、質(zhì)構(gòu)、穩(wěn)定性、持水性和口感等有所改善，常被當(dāng)作穩(wěn)定劑、凝膠劑和增稠劑用于食品生產(chǎn)中[1,2]，這與其EPS黏度、熱穩(wěn)定性、表觀結(jié)構(gòu)和溶液構(gòu)象等物化性質(zhì)有關(guān)[3,4]。有研究表明，植物乳桿菌 SKT109的EPS能通過(guò)提高發(fā)酵乳中特征風(fēng)味物質(zhì)的濃度，改善了發(fā)酵乳的風(fēng)味和流變性質(zhì)[5]。植物乳桿菌 MTCC 9510的EPS 能通過(guò)防止脫水來(lái)改善含淀粉食品的質(zhì)地[6]。植物乳桿菌 KF5 EPS的結(jié)構(gòu)表面光滑、結(jié)構(gòu)緊湊具有增塑薄膜特性，其物理特性不同于其他商業(yè)用膠，賦予KF5 EPS在食品工業(yè)的潛在應(yīng)用[7]。因此，只有弄清楚多糖的物化特性才能深入理解它們的生物功能特性，從而更好的將其利用到生產(chǎn)生活中。前期研究中已提取純化了植物乳桿菌AR307胞外多糖，得到兩個(gè)不同結(jié)構(gòu)的多糖組分，分別為丙酮酸多糖LPE-1和糖醛酸多糖LPE-2[8,9]。為更全面的了解這兩個(gè)酸性多糖，本文對(duì)LPE-1和LPE-2的固有黏度、熱降解溫度、表觀形貌和溶液構(gòu)象等物化性質(zhì)進(jìn)行研究，為多糖在食品、藥品和化妝品等領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

植物乳桿菌AR307(LactobacillusplantarumAR307)保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCC10773。鹽酸、氫氧化鈉、硝酸鈉、氯化鈣、剛果紅等分析純?cè)噭┎少?gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)買于美國(guó)Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；C-MAG MS10磁力攪拌器，德國(guó)IKA公司；熱重分析儀，美國(guó)珀金埃爾默公司；SEM Sigma 500/VP 掃描電鏡，德國(guó)卡爾蔡司公司；多角度激光光散射粒徑分析儀，美國(guó)Brookhaven公司；圓二色譜儀，日本JASCO公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1固有黏度測(cè)定

將純化多糖樣品配成的一定濃度的水溶液，用烏氏黏度計(jì)在(25.00±0.01)℃水浴中進(jìn)行測(cè)定，為了獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，相對(duì)黏度值(ηrel)范圍保持在 1.2～2.2之間。

1.3.2熱重分析

對(duì)純化后的多糖樣品進(jìn)行熱重掃描，觀察多糖結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。采用綜合熱分析儀對(duì)樣品進(jìn)行熱分析，升溫速率10 ℃/min，升溫范圍30 ℃～700 ℃。氣氛為靜態(tài)氮?dú)?參比物為 Al2O3。

1.3.3表觀形貌分析

用超純水配制10 mg/mL的純多糖溶液，冷凍干燥。將凍干的粉末適量置于導(dǎo)電碳膠帶上，噴金處理，抽真空后使用掃描式電子顯微鏡進(jìn)行電鏡掃描，觀察多糖組分的表觀形貌。

1.3.4粒徑分布

采用173 plus多角度激光光散射粒徑分析儀對(duì)多糖溶液的光散射特征進(jìn)行分析。用純水和0.15 mol/L的NaCl溶液分別配制1.0 mg/mL的LPE-1和LPE-2溶液，40 ℃ 攪拌溶解1 h，冷卻，溶液用0.20 μm膜過(guò)濾，裝入散射池中，通過(guò)動(dòng)態(tài)激光光散射溫度為25 ℃，波長(zhǎng)633 nm，測(cè)試角度為90°條件下測(cè)定溶液聚集程度。樣品平衡時(shí)間為300 s,檢測(cè)時(shí)間為120 s。

1.3.5剛果紅實(shí)驗(yàn)

剛果紅與多糖的相互作用通過(guò)多糖在不同溶液體系中與剛果紅反應(yīng)的最大吸收波長(zhǎng)的變化來(lái)評(píng)價(jià)[10]。將2 mL多糖樣品(1 mg/mL)與2 mL 80 μmol/L剛果紅試劑混合均勻，逐漸滴加4 mol/L NaOH溶液，使溶液中NaOH濃度在0～0.5 mol/L范圍內(nèi)變化，然后在波長(zhǎng)200 nm～600 nm進(jìn)行紫外掃描，測(cè)定混合液在不同濃度NaOH下最大吸收波長(zhǎng)的變化。

1.3.6溶液構(gòu)象分析

將多糖配制成1 mg/mL的溶液，通過(guò)改變溫度(20 ℃、60 ℃和100 ℃)，添加金屬離子(Ca2+)，絡(luò)合劑(剛果紅)及解璇劑(DMSO)等不同外界因素觀察EPS在紫外吸收光譜和圓二色譜測(cè)定值的變化，從而觀察其溶液構(gòu)象的變化(180 nm～400 nm)。

2 結(jié)果與分析

2.1 固有黏度分析

特性黏度是多糖溶液的一個(gè)重要特性，對(duì)于一個(gè)特性條件下的多糖溶液體系，其特性黏度為常數(shù)，與多糖分子量大小和構(gòu)象有關(guān)[11]。本研究采用烏氏黏度計(jì)測(cè)定LPE-1和LPE-2在水溶液中的特性黏度，根據(jù)Huggins和Kraemer方程，以ηsp/C和(Inηr)/C為縱坐標(biāo)，多糖濃度C為橫坐標(biāo)作圖如圖1，將濃度外推至零時(shí)，即可得到特性黏度[η]。其中，ηsp為比黏度，ηr為相對(duì)黏度。由圖1得到LPE-1和LPE-2在水溶液中的特性黏度分別為3.32 dL/g、3.85 dL/g。

圖1 LPE-1(a)和LPE-2(b)在去離子水溶液中的特性黏度

2.2 熱重分析

熱重分析(Thermogravimetric Analysis,TG)是在程序控制溫度下，測(cè)量物質(zhì)的物理性質(zhì)與溫度關(guān)系的一類技術(shù)[12]。LPE-1和LPE-2的熱重分析結(jié)果如圖2所示，都是以逐步降解的方式，出現(xiàn)兩個(gè)明顯的熱失重峰。在第一個(gè)降解階段，從30 ℃到120 ℃，LPE-1和LPE-2的失重量分別為8.8%和8.5%。初始重量損失可能與EPS中水分的蒸發(fā)和損失有關(guān)。隨著溫度的上升，出現(xiàn)第二個(gè)降解階段，LPE-1在溫度大于285 ℃時(shí)，觀察到重量損失約52.3%(圖2a)，LPE-2在溫度大于290 ℃ 時(shí)，就開(kāi)始降解，重量損失58%左右 (圖2b),這可能是由于EPS解聚所致。隨后溫度達(dá)到400 ℃ 以上時(shí)，失重趨勢(shì)均變緩，最后有35%左右的糖殘余量。以上可知，LPE-1的和LPE-2都具有較高的降解溫度，高溫下不易被降解，受熱的穩(wěn)定性比較好。據(jù)報(bào)道，植物乳桿菌生產(chǎn)的大多數(shù)EPS具有良好的熱穩(wěn)定性[13]，EPS對(duì)高溫度的耐受性使其能夠更好的承受食品工業(yè)的加工過(guò)程[4,14]。例如，菌株L.plantarumRJF4的EPS可耐受225 ℃的高溫，其降解溫度為280 ℃左右[15]；尤其是菌株L.plantarumBC-25和70810的EPSs分別能耐受320 ℃和339 ℃的高溫，這些具有熱穩(wěn)定性的EPSs可用于油炸食品或其它高溫食品加工中[16]。

圖2 LPE-1(a)和LPE-2(b)的熱重分析(TG-DTG)曲線

2.3 EPS表觀形貌分析

掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope，SEM)可用來(lái)觀察多糖分子的形貌，已成為研究大分子生物多糖表觀形的有力工具[17,18]。本實(shí)驗(yàn)則通過(guò)SEM觀察兩個(gè)酸性純多糖的表觀形貌，圖3分別是LPE-1和LPE-2的SEM掃描圖像，每行圖像從左至右放大倍數(shù)依次增大，從每個(gè)組分的掃描圖像能夠清晰觀察到彼此間的差異。圖3a和3b可見(jiàn)LPE-1多糖分子表觀形貌呈現(xiàn)分支化狀鏈狀結(jié)構(gòu)；圖3c和3d可觀察到LPE-2分子形貌表現(xiàn)為多孔致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。有研究報(bào)道菌株L.plantarumHM47 EPS具有高度多孔的結(jié)構(gòu)，顯示出增塑膜的特性,用于改善產(chǎn)品的質(zhì)地、黏度和保水性，可作為食品工業(yè)中一種很有前途的材料[3]。

圖3 LPE-1(a、b)和LPE-2(c、d)的SEM掃描圖

2.4 EPS的粒徑分布

動(dòng)態(tài)光散射(Dynamic Light Scattering,DLS)，用于測(cè)量溶液或懸浮液中的粒徑分布，是一種準(zhǔn)確、快速的研究高分子在稀溶液中聚集行為的表征方法[19]。LPE-1和LPE-2兩個(gè)組分均含有酸性基團(tuán)，而鹽溶液則被認(rèn)為是減少或消除多糖聚集體最有效且最安全的方法。在室溫25 ℃，波長(zhǎng)633 nm，90°條件下通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)得LPE-1和LPE-2在超純水、0.15 mol/L NaCl溶液中分子粒徑分布如圖4。LPE-1和LPE-2在超純水溶液中均存在大小不等的粒徑分布。在0.15 mol/L NaCl溶液中，雖然LPE-1出現(xiàn)了兩種粒徑分布，但在35 nm處的顆粒僅占17% 左右，比在水溶液中溶解性好。LPE-2則在0.15 mol/L NaCl溶液中粒徑分布比較集中，雖然分子粒徑比較大，但出現(xiàn)了單粒徑的分布。由此說(shuō)明0.15 mol/L氯化鈉能有效消除LPE-1和LPE-2在溶液中粒徑的聚集現(xiàn)象。

a：LPE-1在水溶液中的分布；b：LPE-1在0.15 M NaCl溶液中分布；c：LPE-2在水溶液中的分布；d：LPE-2在0.15 M NaCl溶液中分布圖4 動(dòng)態(tài)光散射測(cè)得EPS在溶液中的粒徑分布

2.5 剛果紅實(shí)驗(yàn)

剛果紅是一種酸性染料，可與具有多股螺旋構(gòu)象的多糖形成絡(luò)合物，絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)會(huì)發(fā)生紅移，當(dāng)NaOH濃度超出一定范圍后，最大吸收波長(zhǎng)則會(huì)急劇下降[10]。如圖5所示，NaOH的濃度在0 mol/L～0.5 mol/L范圍內(nèi)變化時(shí)，剛果紅和LPE-1的復(fù)合物雖然吸收波長(zhǎng)沒(méi)有太大的變化，但也沒(méi)有出現(xiàn)波長(zhǎng)的紅移，說(shuō)明LPE-1不具有三螺旋結(jié)構(gòu)。和剛果紅一樣，剛果紅和LPE-2復(fù)合物的最大吸收波長(zhǎng)也隨著NaOH濃度的升高而逐漸減小，沒(méi)有出現(xiàn)波長(zhǎng)的紅移，表明LPE-2也不具有三螺旋結(jié)構(gòu)。有研究報(bào)道，結(jié)構(gòu)單元中含有1.3-糖苷鍵的香菇多糖常具有三螺旋的結(jié)構(gòu)[20]，由此推測(cè)LPE-1和LPE-2的結(jié)構(gòu)單元中可能都不含有1,3-糖苷鍵。

圖5 EPS-剛果紅復(fù)合物的最大吸收波長(zhǎng)變化

2.6 不同因素對(duì)多糖溶液構(gòu)象的影響

圓二色譜是一種用于測(cè)定蛋白質(zhì)和核酸構(gòu)象的方法，它能為α螺旋、β折疊、無(wú)規(guī)則線團(tuán)等構(gòu)象形式提供可靠信息[21]。由于多糖存在不對(duì)稱性結(jié)構(gòu)，特別是在水溶液中，多糖分子間或分子內(nèi)的相互作用導(dǎo)致其分子呈現(xiàn)卷曲、纏繞等無(wú)規(guī)形態(tài)，使得這種不對(duì)稱性顯得更為突出。當(dāng)外界環(huán)境因素改變時(shí)，如溫度的改變、金屬離子、溶劑種類及染料等的存在，都可引起多糖分子的空間構(gòu)象及分子間的相互作用發(fā)生相應(yīng)改變，這種改變必然引起分子不對(duì)稱性的變化，因此可以通過(guò)測(cè)定多糖的圓二色譜來(lái)研究和分析這種變化過(guò)程[22]。

2.6.1溫度對(duì)多糖溶液構(gòu)象的影響

利用紫外吸收光譜和圓二色譜測(cè)定LPE-1和LPE-2溶液分別在20 ℃、60 ℃和100 ℃的溫度下構(gòu)象的變化。由圖6可知，在波長(zhǎng)200 nm附近，LPE-1在溫度為100 ℃時(shí)紫外峰發(fā)生了紅移，圓二色譜此時(shí)負(fù)相的吸收峰也最強(qiáng)，表明LPE-1在溫度低于100 ℃時(shí)構(gòu)象不發(fā)生變化，而溫度達(dá)到100 ℃以上時(shí)可能導(dǎo)致分子內(nèi)聚集狀態(tài)的改變使其構(gòu)象發(fā)生變化。隨溫度的升高，LPE-2的紫外吸收峰變化不大，圓二色譜的吸收峰雖有強(qiáng)度的變化但沒(méi)有發(fā)生位移的變化，表明LPE-2的構(gòu)象受溫度變化的影響不大。

圖6 不同溫度處理下LPE-1(a,b)和LPE-2 (c,d)的紫外光譜圖(a,c)和圓二色譜圖(b,d)

2.6.2金屬離子(Ca2+)對(duì)多糖溶液構(gòu)象的影響

多糖具有絡(luò)合多種金屬離子的能力，絡(luò)合后構(gòu)象發(fā)生較大變化，但往往也是可逆的，去除金屬離子后恢復(fù)原狀。含有羧基的酸性多糖可與Ca2+作用，形成“蛋箱”結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)分子間的不對(duì)稱性[10,23]。由圖7可知，經(jīng)Ca2+處理后，LPE-1和LPE-2的紫外吸收光譜均發(fā)生了紅移，且圓二色譜的峰也發(fā)生了很大的變化，由此推測(cè)Ca2+可能與羧基發(fā)生了作用，引起糖鏈之間的聚合反應(yīng)。結(jié)果說(shuō)明，LPE-1和LPE-2經(jīng)Ca2+處理后構(gòu)象發(fā)生了變化，可能還有酸性基團(tuán)，這與之前的研究相一致。

圖7 Ca2+處理后LPE-1(a,b)和LPE-2 (c,d)的紫外光譜圖(a,c)和圓二色譜圖(b,d)

2.6.3絡(luò)合劑對(duì)多糖溶液構(gòu)象的影響

剛果紅是一種非特異性多糖染料，可以和多種多糖絡(luò)合，如果這種作用發(fā)生在多個(gè)多糖分子之間，就有可能導(dǎo)致多糖分子之間出現(xiàn)較多的和新的分子間相互作用，明顯增加多糖分子的不對(duì)稱性。如圖8所示，LPE-1和LPE-2與剛果紅反應(yīng)后，紫外光譜除了吸收峰的強(qiáng)度發(fā)生了變化，峰位移沒(méi)有發(fā)生變化；圓二色譜峰除了強(qiáng)度的變化，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的高峰和低峰的正負(fù)科頓效應(yīng)。這表明EPS可與剛果紅產(chǎn)生絡(luò)合物，但不能形成多螺旋的特征絡(luò)合物，則推測(cè)兩個(gè)組分的多糖均不具有多螺旋結(jié)構(gòu)，這與2.5中剛果紅的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

圖8 剛果紅處理后LPE-1(a,b)和LPE-2 (c,d)的紫外光譜圖(a,c)和圓二色譜圖(b,d)

2.6.4解璇劑對(duì)多糖溶液構(gòu)象的影響

二甲基亞砜(DMSO)是一種氫鍵破壞劑，能使大分子變性[10]。如圖9所示，LPE-1與DMSO反應(yīng)后，200 nm處紫外吸收峰發(fā)生了位移，圓二色譜在220 nm 處出現(xiàn)了負(fù)科頓效應(yīng)，表明LPE-1在DMSO中構(gòu)象發(fā)生了變化。DMSO處理LPE-2后，在200 nm處紫外吸收峰位置發(fā)生變化，且圓二色譜在220nm出現(xiàn)負(fù)科頓效應(yīng)，在250 nm處出現(xiàn)正科頓效應(yīng)，表明LPE-2在DMSO溶液中分子狀態(tài)發(fā)生改變，DMSO能使其構(gòu)象發(fā)生改變。因此，解旋劑DMSO能使LPE-1和LPE-2的溶液構(gòu)象發(fā)生顯著變化。

圖9 DMSO處理后LPE-1(a,b)和LPE-2 (c,d)的紫外光譜圖(a,c)和圓二色譜圖(b,d)

3 結(jié)論

本研究分析了植物乳桿菌AR307發(fā)酵產(chǎn)生的兩種酸性胞外多糖的物化性質(zhì)。LPE-1和LPE-2的固有黏度分別為3.32 dL/g和3.85 dL/g。LPE-1和LPE-2具有較高的降解溫度，分別為285 ℃和290 ℃左右。LPE-1固體粉末呈分支化鏈狀的表觀形貌，LPE-2則為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。兩個(gè)酸性多糖都不具有三螺旋結(jié)構(gòu)，且在溶液中均以不規(guī)則、不穩(wěn)定的的狀態(tài)存在，因此容易受到溫度、金屬離子、絡(luò)合劑和解旋劑等外界環(huán)境的影響而發(fā)生相應(yīng)的改變。多糖的物化性質(zhì)為深入理解其生物功能特性，將其利用到生產(chǎn)生活中提供了理論基礎(chǔ)。