王樹和，張佳正，何金鶴

(河南科技大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471000)

臭椿（Ailanthus altissima（Mill.）Swingle）為苦木科（Simaroubaceae）臭椿屬落葉喬木，原產(chǎn)于中國(guó)北部及中部，全國(guó)各省區(qū)幾乎都有分布[1]。臭椿樹干高大挺拔，樹皮光滑，樹冠如傘狀，極具觀賞價(jià)值；而且該樹種耐鹽堿和干旱、抗煙塵和病蟲害，是一種抗性極強(qiáng)的優(yōu)良綠化樹種[2-3]。因此，臭椿被廣泛用于城市園林建設(shè)、山區(qū)植樹造林和工礦區(qū)綠化，單獨(dú)種植或與其它樹種一起混種均可。除用于觀賞綠化外，臭椿還是藥用植物，其樹皮、根皮及果實(shí)均可入藥，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[4-5]。

2018 年9 月筆者在河南省洛陽(yáng)市嵩縣天池山國(guó)家森林公園進(jìn)行病害調(diào)查，發(fā)現(xiàn)臭椿炭疽病嚴(yán)重發(fā)生，一些植株病葉率達(dá)到70%以上。該病主要危害葉片，病斑褐色呈圓形或近圓形，邊緣顏色較深，病斑中央壞死組織常脫落形成穿孔，后期造成臭椿大量落葉，嚴(yán)重影響樹木生長(zhǎng)和景觀價(jià)值。王教敏[6]于2009 報(bào)道了青島地區(qū)發(fā)生的臭椿炭疽病，基于形態(tài)學(xué)和rDNA-ITS 序列，鑒定分離菌株SQD-107 為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioidesPenz.）。本次調(diào)查觀察到的臭椿炭疽病與王教敏[6]描述的癥狀存在著較為明顯的差異，發(fā)病后期多數(shù)病斑形成穿孔。本研究擬采用形態(tài)學(xué)與多基因系統(tǒng)發(fā)育分析相結(jié)合的方法，對(duì)該地區(qū)臭椿炭疽病病原菌鑒定，并經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證，以期為該病害防治策略的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

臭椿炭疽病病葉采集于河南省洛陽(yáng)市嵩縣天池山國(guó)家森林公園。致病性測(cè)定的臭椿健康葉片采集于河南科技大學(xué)校園。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離純化 參照Chen 等[7]病原組織分離法分離病原菌，分離的菌株單孢純化后，保存于PDA 斜面上，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性測(cè)定 分離菌株CH-1 和CH-3 用于接種試驗(yàn)，參照Torres-Calzada 等[8]的方法進(jìn)行有傷和無(wú)傷接種（圖1），將采集的臭椿健康葉片用0.5% NaClO 表面消毒，無(wú)菌水沖洗3 次，葉面水分晾干后進(jìn)行接種。有傷接種時(shí)用無(wú)菌接種針刺傷葉片，移液槍吸取供試菌株分生孢子懸浮液20 μL（濃度為1×106個(gè)·mL?1）滴在葉片刺傷部位，對(duì)照處理接種20 μL 無(wú)菌水；無(wú)傷接種對(duì)健葉未進(jìn)行刺傷，其余操作同有傷接種。每個(gè)處理接種10 片葉子，試驗(yàn)重復(fù)2 次。接種后的葉片放置于加有濕潤(rùn)濾紙的保鮮盒內(nèi)，在葉柄處包裹脫脂棉并滴加無(wú)菌水，將裝有葉片保鮮盒置于培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)條件為：溫度25℃，12 h 光暗交替。逐日觀察葉片的發(fā)病情況，接種葉片發(fā)病后再進(jìn)行分離培養(yǎng)，完成柯赫氏法則的驗(yàn)證。

圖1 葉片接種示意圖Fig.1 Schematic diagram of the protocol used to leaf inoculation

1.3 病原菌的形態(tài)觀察

參照Yan 等[9]描述的方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。在光學(xué)顯微鏡（Leica DM2500，Germany）下觀察分生孢子梗、分生孢子、子囊、子囊孢子等微觀形態(tài)，并測(cè)量分生孢子和子囊孢子（n=50）的大小。依照Yang 等[10]描述的方法誘導(dǎo)分生孢子附著胞的產(chǎn)生，觀察記錄附著胞形態(tài)特征并測(cè)量其大?。╪=30）。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

采用改良CTAB 法[11]提取菌株CH-1 和CH-3 基因組DNA。使用rDNA-ITS 通用引物ITS5/ITS4[12]、肌動(dòng)蛋白（actin，ACT）引物ACT-512F/ACT-783R[13]、β-微管蛋白（beta-tubulin 2，TUB2）引物TUBT1/TUB2b[14-15]、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物GDF1/GDR1[16]和幾丁質(zhì)合成酶（chitin synthase，CHS-1）引 物CHS-79F/CHS-345R[13]對(duì)病原菌基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR 擴(kuò)增得到的目的片段通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后委托北京擎科生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI（http://www.ncbi.nlm.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果下載參比序列（表1），使用PhyloSuite 軟件中MAFFA 插件對(duì)建樹序列進(jìn)行多重比對(duì)[17]，必要時(shí)進(jìn)行手工校正。比對(duì)后的基因序列在PhyloSuite 軟件中按照ACT、TUB2、CHS-1、GAPDH和ITS的順序串聯(lián)整合成一個(gè)多基因數(shù)據(jù)集[17]，基因序列合并的數(shù)據(jù)集在MEGA X 軟件中采用最大似然法（maximum likelihood，ML）并選用TN93+G 核苷酸替代模型構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，各分支節(jié)點(diǎn)的置信值通過(guò)1000 次自舉（Bootstrap）抽樣進(jìn)行評(píng)估[18]。

表1 本研究中用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的菌株信息及基因序列登記號(hào)Table 1 Collection details and GenBank accession numbers of isolates used for phylogenetic analysis in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀與致病性測(cè)定

該病害主要危害葉片，發(fā)病初期在葉片上可見(jiàn)褐色小點(diǎn)，擴(kuò)展以后形成淺褐色圓形或近圓形病斑，病斑邊緣顏色較深，發(fā)病后期在葉片病健交界處產(chǎn)生一圈裂紋，病斑中央組織脫落可形成穿孔。有時(shí)多個(gè)病斑相互愈合形成大斑，脫落后形成大的穿孔（圖2A）。

致病性測(cè)定結(jié)果顯示，有傷接種條件下供試菌株CH-1 和CH-3 均可使臭椿葉片發(fā)?。▓D2B，2C），接種1～2 d 后在接種部位可見(jiàn)褐色斑點(diǎn)，接種5～7 d 后一些病斑在病健交接處產(chǎn)生離層，進(jìn)一步發(fā)展形成穿孔癥狀（圖2B，2C），與自然發(fā)病癥狀完全相同。發(fā)病組織再分離，獲得分離物經(jīng)鑒定與接種菌株相同，由此證明分離獲得的菌株為致病菌。無(wú)傷接種和對(duì)照未見(jiàn)發(fā)病。

圖2 臭椿炭疽病癥狀Fig.2 Symptoms of anthracnose on Ailanthus altissima

2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

從河南省洛陽(yáng)市嵩縣天池山國(guó)家森林公園采集的臭椿病葉樣品中分離獲得11 個(gè)菌株，所有菌株在PDA 上菌落表現(xiàn)一致，菌落平整且邊緣整齊，氣生菌絲較密，棉絮狀，菌落初始為白色，幾天后菌落中間出現(xiàn)灰綠色（圖3A），背面有黑色素沉積（圖3B）。25℃培養(yǎng)5 d 的菌落直徑為6.18 ± 0.67 cm。菌落上產(chǎn)生的分生孢子堆白色到淺黃色，顯微鏡檢可見(jiàn)分生孢子為圓柱狀，兩端鈍圓，單孢，無(wú)色（圖3C），孢子大?。?2.01～18.10）μm×（4.66～6.90）μm，平均長(zhǎng)14.55 ± 1.22 μm，寬5.79 ± 0.44 μm。附著胞淺至深棕色，橢圓形或近球形（圖3D，3E），大?。?.20～7.96）μm×（4.68～6.79）μm，平均長(zhǎng)7.85 ± 1.12 μm，寬5.62 ± 0.49 μm。在PDA 上培養(yǎng)15 d 左右可形成子囊殼，子囊棍棒狀，內(nèi)含8 個(gè)子囊孢子，子囊孢子梭狀，兩端鈍圓，稍彎曲（圖3F，3G），子囊孢子大?。?3.83～22.53）μm×（4.05～6.29）μm，平均長(zhǎng)18.35 ± 1.65 μm，寬5.20 ± 0.53 μm。根據(jù)形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)特征初步鑒定分離菌株為炭疽菌（Colletotrichumspp.）。[19-20]

圖3 臭椿炭疽病病原菌的純培養(yǎng)和形態(tài)特征Fig.3 Morphology and cultural characteristics of Colletotrichum fructicola from Ailanthus altissima

2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)菌株CH-1 和CH-3 的ITS、ACT、TUB2、GAPDH和CHS-1基因進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，得到大小分別為557 bp、289 bp、722 bp、280 bp 和299 bp的特異性片段。將序列提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（表1），通過(guò)BLAST 搜索和比對(duì)，結(jié)果顯示菌株CH-1 和CH-3 的ITS 和ACT基因序列與膠孢炭疽菌復(fù)合種（C.gloeosporioidesspecies complex）內(nèi)的多個(gè)種序列相似性達(dá)到99%以上；菌株CH-1 和CH-3 的TUB2、GAPDH和CHS-1基因序列與果生炭疽菌（C.fructicola）序列相似性達(dá)到99%以上。從NCBI 上選取相關(guān)序列聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以C.boninense為外群，進(jìn)行多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示，供試菌株CH-1 和CH-3 與果生炭疽菌（C.fructicola）聚于同一分支，自展支持率為99%（圖4）。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，最終鑒定在河南省洛陽(yáng)市嵩縣天池山國(guó)家森林公園發(fā)生的臭椿炭疽病病原菌為果生炭疽菌（C.fructicola）[21-22]。

圖4 基于最大似然法構(gòu)建臭椿炭疽病病原菌及其相關(guān)種的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on sequences of Colletotrichum isolates from Ailanthus altissima and related species using maximum likelihood method

3 討論

本研究在河南省洛陽(yáng)市嵩縣天池山國(guó)家森林公園進(jìn)行病害調(diào)查，發(fā)現(xiàn)臭椿炭疽病嚴(yán)重發(fā)生，對(duì)發(fā)病葉片進(jìn)行病原菌分離，共獲得到11 個(gè)分離物，它們?cè)赑DA 上菌落特征表現(xiàn)一致，正面菌落先白色后灰色，背面黑色。菌落上產(chǎn)生的分生孢子堆白色到淺黃色，分生孢子圓柱狀，兩端鈍圓，單孢，無(wú)色。由于炭疽菌屬（Colletotrichum）內(nèi)種類繁多、形態(tài)簡(jiǎn)單，能夠用于形態(tài)鑒定的特征較少，造成其種間界限不明確、分類鑒定困難[19,23]。通過(guò)形態(tài)學(xué)難以確認(rèn)11 個(gè)分離物確切的種，初步鑒定為炭疽菌（Colletotrichumspp.）。

近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)在真菌分類鑒定中的應(yīng)用，對(duì)炭疽菌屬的分類鑒定方法產(chǎn)生了深刻影響[19,24]。rDNA-ITS 序列分析是炭疽菌分子鑒定中應(yīng)用最早、最多的方法，為許多物種的鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析提供了有力工具[23-24]。研究發(fā)現(xiàn)，僅基于rDNA-ITS 序列并結(jié)合形態(tài)特征進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析或物種鑒定存在一定的局限性，對(duì)于一些近緣相似種和復(fù)合種，仍不能準(zhǔn)確反映和有效識(shí)別其親緣關(guān)系[19,24]。目前，基于形態(tài)學(xué)和多基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析方法被眾多研究者接受[25-27]。隨著炭疽菌多基因系統(tǒng)學(xué)研究的深入，將炭疽菌屬真菌劃分為14 個(gè)復(fù)合種（C.acutatum、C.boninense、C.caudatum、C.dematium、C.destructivum、C.dracaenophilu、C.gigasporum、C.gloeosporioides、C.graminicola、C.magnum、C.orbiculare、C.orchidearum、C.spaethianum和C.truncatum）和部分獨(dú)立種[19,28-29]。Weir 等采用ITS、ACT、CAL、CHS-1和GAPDH基因?qū)Υ罅刻烤揖赀M(jìn)行多基因序列分析和形態(tài)學(xué)鑒定，明確了C.gloeosporioides復(fù)合種內(nèi)包含了22 個(gè)種和1 個(gè)亞種[21]。目前，C.gloeosporioides復(fù)合種已接受41 個(gè)合格種，其中大多數(shù)為植物病原菌[21,25,28,30]。本研究中對(duì)分離菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和多基因（ITS、ACT、TUB2、GAPDH和CHS-1）系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果顯示，它們均為C.gloeosporioides復(fù)合種內(nèi)的果生炭疽菌（C.fructicola）。

果生炭疽菌（C.fructicola）首次在泰國(guó)咖啡果實(shí)上發(fā)現(xiàn)[20]，之后陸續(xù)報(bào)道該病菌可侵染多種經(jīng)濟(jì)作物，如梨[21]、蘋果[22]、柑橘[31]、煙草[32]、木薯[33]和芒果[34]等，引起葉片壞死和果實(shí)腐爛。Weir等[21]研究發(fā)現(xiàn)果生炭疽菌具有明顯的地域多樣性和生物多樣性，僅依賴形態(tài)學(xué)特征或rDNA-ITS 序列均很難對(duì)其準(zhǔn)確鑒定。目前，推薦使用多基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定[21,27]。

4 結(jié)論

本研究對(duì)采自河南省洛陽(yáng)市嵩縣天池山國(guó)家森林公園的臭椿炭疽病樣品進(jìn)行了病原菌分離與純化，致病性測(cè)定證明分離物可侵染臭椿葉片，并引起與林間癥狀一致的炭疽??；病原菌形態(tài)特征觀察及多位點(diǎn)基因（ITS、ACT、TUB2、CHS-1和GAPDH）系統(tǒng)發(fā)育分析表明，引起該地區(qū)臭椿炭疽病的病原菌為果生炭疽菌（C.fructicola）。該研究結(jié)果可為深入研究臭椿炭疽病的發(fā)生流行規(guī)律以及制定防治策略奠定基礎(chǔ)。