張疏雨 于婷婷 郝捷* 李劍梅 謝存一 柴林山 朱萬琴 馬征遠(yuǎn)

(1 遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧 朝陽 122000；2 內(nèi)蒙古昆明卷煙有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

蛹蟲草作為蟲草屬模式種，在1727年巴黎科學(xué)院院士會(huì)上，以屬種名Cordyceps militarys發(fā)表[1]。根據(jù)Sung的分類系統(tǒng)(2007），蛹蟲草隸屬于真菌界Fungi、子囊菌亞門Ascomycotina、子囊菌綱Ascomycetes、糞殼菌亞綱Sordariomy、肉座菌目Hypocreales、艷蟲草菌科Cordycipitaceae、狹義蟲草屬Cordyceps[2]。蛹蟲草中的主要活性物質(zhì)有蟲草素、蟲草酸、多糖等[3]，具有抗腫瘤[4]、抗病毒[5]、抗疲勞[6]、抗菌消炎[7]、提高免疫力[8]、調(diào)節(jié)腸道微生物菌群、降血糖等功效[9]。培養(yǎng)基組成成分為影響蛹蟲草發(fā)酵培養(yǎng)主要因素，接種量、搖床轉(zhuǎn)速、搖瓶裝液量、發(fā)酵周期和搖瓶時(shí)間等，對(duì)其菌絲體的繁殖和代謝產(chǎn)物的累積有直接影響。為此筆者進(jìn)行接種量、搖床轉(zhuǎn)速、搖瓶裝液量、發(fā)酵周期等蛹蟲草發(fā)酵相關(guān)條件試驗(yàn)，以期確定蛹蟲草液體菌種培養(yǎng)條件，為實(shí)現(xiàn)規(guī)?；斯ぴ耘嘤枷x草提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

蛹蟲草CMC33、L1-2和AoJ1-7菌株，均由遼寧省微生物科學(xué)研究院藥用蕈菌研究室提供。供試培養(yǎng)基有①PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋 白 胨10 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，維 生 素B110 mg，瓊脂15 g，pH自然，水1 000 mL；②液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，維生素B110 mg，pH自然，水1 000 mL；③加入培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)液：MgSO41.0 g，KH2PO42.0 g，維生素B15 mg，配制成1 000 mL溶液，備用；④麥粒培養(yǎng)基：650 mL罐頭瓶每瓶裝小麥35 g，按照1∶1.7的比例添加營(yíng)養(yǎng)液，用聚乙烯膜包裹瓶口，再用橡皮筋扎緊，于121℃下滅菌1 h，冷卻，備用。

1.2 試劑及儀器設(shè)備

1.2.1 試劑

標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品：蟲草素(北京索萊寶生物科技有限公司，純度≥98%）。試劑：色譜乙腈、色譜甲醇、去離子水、乙醇、葡萄糖、蛋白胨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、維生素B1、玉米粉、甘氨酸等(北京化工廠有限公司，分析純）。

1.2.2 主要儀器設(shè)備

HFsafe-1200生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司），SPH-2102立式雙層大容量恒溫培養(yǎng)搖床(上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），BCD-649 WADV冰箱(青島海爾股份有限公司），SPX-450生化培養(yǎng)箱[中儀國(guó)科(北京）科技有限公司]，LDZX-75KBS立式高壓蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠），Waters2695型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司），Waters2489型二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司），色譜柱Luna 5u C18(2）100A(250 mm×4.6 mm）(美國(guó)安捷倫科技有限公司），KQ-50DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛹蟲草菌絲體中蟲草素含量測(cè)定

依據(jù)農(nóng)業(yè)部(現(xiàn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部）標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2116—2012測(cè)定菌絲體中蟲草素含量。

①標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，去離子水溶解，用流動(dòng)相定容至100 mL搖勻，配制成100 μg/mL蟲草標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，4℃儲(chǔ)存，備用。

②色譜條件：柱溫35℃；流動(dòng)相，5%乙腈，95%水；流速1.0 mL/min；檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)20 min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；進(jìn)樣量10 μL。

③制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確吸取配置好的蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品母液0.25 mL、0.5 mL、1.25 mL、2.5 mL、5 mL、12.5 mL于25 mL容量瓶中，用去離子水定容，搖勻，得到1.00 μg/mL、2.00 μg/mL、5.00 μg/mL、10.00 μg/mL、20.00 μg/mL、50.0 μg/mL的溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾。每個(gè)體積濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)進(jìn)樣3次，得到相應(yīng)峰面積，計(jì)算平均值。以蟲草素體積濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

④樣品蟲草素含量測(cè)定：采用超聲波提取法。稱取待測(cè)菌絲體粉末1.0 g，置于25 mL容量瓶中，加入去離子水20 mL，置于超聲波儀中提取3 h，取出后用去離子水定容，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，濾液用高效液相色譜法分析。

1.3.2 菌絲生物量測(cè)定

培養(yǎng)液經(jīng)3層紗布過濾去上清液，收集用清水淋洗后的菌絲體，置于55℃熱風(fēng)循環(huán)烘箱中干燥至恒重，在干燥器中冷卻到常溫，稱重(g），計(jì)算單位培養(yǎng)液中菌絲生物量：

式中：X為單位培養(yǎng)液中菌絲生物量，g/L；W為菌絲干重，g；V為取樣體積，mL。

1.3.3 菌種活化及培養(yǎng)

將蛹蟲草CMC33(F1）菌株無菌接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，于18℃避光培養(yǎng)7 d，獲得F2代菌株。平板培養(yǎng)基中接入F2代菌株，(18±1）℃條件下黑暗培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿平板。制備搖瓶培養(yǎng)基：按200 mL/500 mL分裝，滅菌冷卻后每瓶接種直徑為6 mm的菌餅3塊，在培養(yǎng)溫度18℃、搖床轉(zhuǎn)速140 r/min條件下培養(yǎng)6 d，得到蛹蟲草初始液體菌種。

1.3.4 液體發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 搖床轉(zhuǎn)速試驗(yàn)

液體菌種接種量為4%，裝液量為200 mL/500 mL，設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min、120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min，18℃恒溫避光培養(yǎng)6 d，每個(gè)處理重復(fù)3次。發(fā)酵結(jié)束后，按照1.3.2方法收集菌絲體，烘干稱重。計(jì)算單位培養(yǎng)液中菌絲生物量，測(cè)定蟲草素含量。

1.3.4.2 接種量試驗(yàn)

在優(yōu)化的搖床轉(zhuǎn)速條件下，試驗(yàn)液體菌種接種量分別為1%、2%、4%、6%、8%、10%，裝液量為200 mL/500 mL，18℃恒溫避光培養(yǎng)6 d，每個(gè)處理重復(fù)3次。發(fā)酵結(jié)束后，按照1.3.2方法收集菌絲體，烘干稱重，計(jì)算單位培養(yǎng)液中菌絲生物量，測(cè)定蟲草素含量。

1.3.4.3 搖瓶裝液量試驗(yàn)

在優(yōu)化的接種量及搖床轉(zhuǎn)速條件下，將500 mL搖瓶裝液量設(shè)為80 mL、100 mL、120 mL、140 mL、160 mL、180 mL、200 mL，18℃恒溫避光培養(yǎng)6 d，每個(gè)處理重復(fù)3次。發(fā)酵結(jié)束后，按照1.3.2方法收集菌絲體，烘干稱重。計(jì)算單位(L）培養(yǎng)液中菌絲生物量，測(cè)定蟲草素含量。

1.3.4.4 液體菌種最佳發(fā)酵周期試驗(yàn)

在優(yōu)化的接種量、搖床轉(zhuǎn)速、搖瓶裝液量條件下，設(shè)液體培養(yǎng)時(shí)間分別為24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h、120 h，每個(gè)處理重復(fù)3次。觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)，收集菌絲體，烘干稱重。計(jì)算單位(L）培養(yǎng)液中菌絲生物量，測(cè)定蟲草素含量。

1.3.5 栽培驗(yàn)證試驗(yàn)

將供試菌種CMC33、Y6～1、L1-2和AoJ1-7按照優(yōu)化工藝條件培養(yǎng)液體菌種，并進(jìn)行室內(nèi)栽培驗(yàn)證試驗(yàn)。測(cè)定蛹蟲草子實(shí)體生物性狀。計(jì)算生物轉(zhuǎn)化率，測(cè)定蟲草素含量。每個(gè)菌株重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1、圖2可知，在試驗(yàn)條件下，蟲草素在12 min左右出現(xiàn)峰面積，0.01～50.00 mg/mL樣品與峰面積呈良好的線性關(guān)系，蟲草素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=33 477x+13 493(R2=0.999 9）。由圖2可知，所獲得的菌絲體與蟲草素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品在相同的時(shí)間出現(xiàn)蟲草素的特征吸收峰。

圖1 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品及供試樣品HPLC圖

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 搖床轉(zhuǎn)速試驗(yàn)結(jié)果

用搖瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速的快慢間接影響著發(fā)酵液中氧氣溶解量。由表1、圖3、圖4可知，隨著搖床轉(zhuǎn)速的加快，菌絲生物量(干重，下同）呈先升高后降低的趨勢(shì)：當(dāng)轉(zhuǎn)速從100 r/min上升到120 r/min時(shí)，菌絲生物量升幅不大；當(dāng)轉(zhuǎn)速從120 r/min上升到140 r/min時(shí)，菌絲生物量升幅較大；當(dāng)轉(zhuǎn)速從140 r/min上升到180 r/min時(shí)，菌絲生物量下降。搖床轉(zhuǎn)速為140 r/min時(shí)，菌絲生物量、蟲草素含量達(dá)最大值，因此選擇140 r/min為最適宜搖床轉(zhuǎn)速。

表1 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵效果的影響

圖3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌絲生物量（干）影響

圖4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)蟲草素含量的影響

經(jīng)計(jì)算得菌絲生物量(y）與搖床轉(zhuǎn)速(x）之間的函數(shù)關(guān)系式：y=7E-06x4-0.004x3+0.852 2x2-78.598x+2 659.5，R2=1(1），模型擬合較好。蟲草素含量(y）與搖床轉(zhuǎn)速(x）之間的函數(shù)關(guān)系式：y=4E-07x4-0.000 2x3+0.049 6x2-4.367 1x+141.66，R2=1，模型擬合較好。

2.2.2 接種量試驗(yàn)結(jié)果

由表2和圖5、圖6可知，菌絲生物量隨接種量的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)。其原因可能是菌種在有限的營(yíng)養(yǎng)條件下，適宜的接種量可使菌絲體生長(zhǎng)旺盛，各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝與轉(zhuǎn)化主要為菌絲體生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)。隨后，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分幾乎完全被利用，菌絲體達(dá)最大生長(zhǎng)限度，開始產(chǎn)生或外溢一些代謝副產(chǎn)物和中間體，其蛋白水解酶的活力逐漸升高，并出現(xiàn)菌絲體自溶現(xiàn)象，菌絲生物量降低。當(dāng)接種量為8%時(shí)，菌絲生物量達(dá)最高值(22 g/L），因此選擇適宜接種量為8%。

表2 接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響

圖6 接種量對(duì)蟲草素含量的影響

圖5 接種量對(duì)菌絲生物量（干）影響

經(jīng)計(jì)算得菌絲干重(y）與接種量(x）之間的函數(shù)關(guān)系式：y=-0.031 8x4+0.651x3-4.338 2x2+11.991x，R2=0.975 9(3），模型擬合較好。蟲草素含量(y）與接種量(x）之間的函數(shù)關(guān)系式：y=0.000 7x5-0.018 7x4+0.198 7x3-0.950 7x2+1.926 8x-0.767 8，R2=1，模型擬合較好。

2.2.3 搖瓶裝液量試驗(yàn)結(jié)果

裝液量的多少?zèng)Q定了搖瓶中的通氣量，從而影響菌絲體生長(zhǎng)所需氧氣的供給和發(fā)酵過程中廢氣的排放，搖瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基裝液量過多或過少，都不利于蛹蟲草菌絲體的富集培養(yǎng)，影響發(fā)酵結(jié)果。由表3、圖7、圖8可知，菌絲生物量隨搖瓶裝液量的增加而增加，當(dāng)裝液量為180 mL或200 mL時(shí)菌絲生物量相差不大，結(jié)合蟲草素含量，選擇裝液量200 mL為最適裝液量。

表3 裝液量對(duì)發(fā)酵效果的影響

圖7 裝液量對(duì)菌絲生物量（干）影響

圖8 裝液量對(duì)蟲草素含量的影響

經(jīng)計(jì)算得菌絲干重(y）與裝液量(x）之間的函數(shù)關(guān)系式：y=-7E-08x4+3E-05x3-0.003x2+0.241 7x，R2=0.981 4，模型擬合較好。蟲草素含量(y）與裝液量(x）之間的函數(shù)關(guān)系式：y=1E-08x4-5E-06x3+0.001 1x2-0.089 5x+2.900 4，R2=0.993，模 型 擬 合較好。

2.2.4 最佳發(fā)酵周期試驗(yàn)結(jié)果

由表4、圖9、圖10、圖11可知，蛹蟲草菌絲的生物量近似“S”形曲線。蛹蟲草菌種發(fā)酵18 h開始萌發(fā)，24 h新生菌絲明顯增多，發(fā)酵前48 h之內(nèi)為菌絲適應(yīng)期，生長(zhǎng)緩慢，顯微鏡下菌絲尖端鈍圓、無色、有隔，菌絲較少，長(zhǎng)勢(shì)粗壯旺盛。發(fā)酵48 h后菌絲進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌絲量急劇增加，且相互纏繞形成菌球，顯微鏡下菌絲生長(zhǎng)旺盛、多分枝。發(fā)酵72 h開始形成液態(tài)孢子，此時(shí)蟲草素含量(0.628 mg/g）最高。發(fā)酵84～96 h時(shí)菌絲生物量最高，為15 g/L，此時(shí)液體菌種呈淡黃、均一的溶液，菌絲生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期，菌絲生物量趨于平穩(wěn)，形成大量的液體孢子。發(fā)酵96 h后菌絲逐漸老化開始自溶，形成豐富的液體孢子，菌絲細(xì)胞內(nèi)成分流失，菌絲生物量及蟲草素含量逐漸下降。綜合考慮，選擇發(fā)酵時(shí)間為84～96 h為最適發(fā)酵周期。

表4 不同發(fā)酵時(shí)間液體菌種菌絲生物量（干）及蟲草素含量

圖9 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌絲生物量（干）的影響（生長(zhǎng)曲線）

圖10 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蟲草素含量的影響

圖11 顯微鏡下不同發(fā)酵時(shí)間的CMC33菌株液體菌種顯微鏡觀察菌絲體狀態(tài)（10×40倍數(shù)）

經(jīng)計(jì)算得菌絲干重(y）與發(fā)酵時(shí)間(x）之間的函數(shù)關(guān)系式：y=1E-06x4-0.000 4x3+0.038 9x2-1.507 1x+24.583，R2=0.989 4，模型擬合較好。蟲草素含量(y）與發(fā)酵時(shí)間(x）之間的函數(shù)關(guān)系式：y=-1E-10x6+5E-08x5-9E-06x4+0.000 7x3-0.031 5x2+0.677 6x-5.437 2，R2=0.998 6，模型擬合較好。

2.3 栽培驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

以優(yōu)化條件(搖床轉(zhuǎn)速140 r/min，接種量8%，裝液量200 mL，發(fā)酵周期84～96 h）培養(yǎng)試驗(yàn)菌株CMC33、L1-2和AoJ1-7液體菌種，結(jié)果表明(表5、圖12、圖13），供試3個(gè)菌株的液體菌種狀態(tài)良好，呈淡黃色的溶液，且菌球較均勻一致，分布均勻、量適中、流動(dòng)性好；優(yōu)化條件培養(yǎng)的液體菌種栽培所得的子實(shí)體色澤金黃，條形勻稱，頭部略膨大、飽滿，中等，子實(shí)體數(shù)適中，生物轉(zhuǎn)化率均在88%以上；采用高效液相法測(cè)定子實(shí)體的蟲草素含量，CMC33、L1-2和AoJ1-7蟲草素含量均在3 mg/g以上?？梢?，優(yōu)化后液體菌種發(fā)酵工藝適宜培養(yǎng)不同蛹蟲草菌株的液體菌種。

表5 供試蛹蟲草菌株優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)液體菌種應(yīng)用結(jié)果

圖12 供試蛹蟲草菌株液體培養(yǎng)的菌球狀態(tài)

圖13 栽培驗(yàn)證試驗(yàn)長(zhǎng)出蛹蟲草子實(shí)體

3 小結(jié)

采用單因素試驗(yàn)方法，對(duì)蛹蟲草液體菌種發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得蛹蟲草液體菌種最佳發(fā)酵條件：搖床轉(zhuǎn)速140 r/min，接種量8%，裝液量200 mL，發(fā)酵周期84～96 h。栽培驗(yàn)證試驗(yàn)表明，該工藝穩(wěn)定可靠，可用于蛹蟲草液體菌種的生產(chǎn)。