田霄 田云霞 汪威 薛治峰 薛笑然 龔禹瑞 姬夢琳 田青霖 張樹竹*

(1 昆明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650000；2云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院資源植物研究院，云南 昆明 650000）

牛肝菌Boletus是擔(dān)子菌亞門Basidiomycotina、層菌綱Hymenomycetes、傘菌目Agaricases、牛肝菌科Boletaceae、牛肝菌屬Boletus真菌，在生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)和能量循環(huán)中扮演著重要角色，對(duì)維護(hù)生態(tài)平衡和保護(hù)生物多樣性起著至關(guān)重要的作用[1]。牛肝菌少數(shù)有毒或有苦味，大多數(shù)可以食用，并富含人體所必需的氨基酸、維生素、微量元素和生物堿(如腺嘌呤、膽堿和腐胺）。牛肝菌還具有很高的藥用價(jià)值，具有散熱排毒、補(bǔ)血養(yǎng)氣、追風(fēng)散寒、放松筋骨等功效，對(duì)貧血、頭昏等癥狀也有治療作用。但只有極少數(shù)牛肝菌可以在實(shí)驗(yàn)室條件下成功培養(yǎng)，絕大多數(shù)都無法在人工環(huán)境中生長，因此，探究牛肝菌的環(huán)境適應(yīng)性和營養(yǎng)品質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)，對(duì)牛肝菌的栽培和利用具有重要意義。

真菌的碳水化合物活性酶(carbonhydrateactive enzymes，CAZymes）組分及含量與其生活方式密切相關(guān)。不同家族的CAZymes可以催化不同類型的碳水化合物的合成與代謝，其中一些直接參與寄主植物細(xì)胞壁的降解[2]。真菌通過分泌細(xì)胞壁降解酶(cell wall degrading enzymes，CWDEs）分解植物細(xì)胞壁組分，從而獲取生長和繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)[3]，其中纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和木質(zhì)素酶屬于碳水化合物活性酶家族中的糖苷水解酶(GHs）、碳水化合物酯酶(CEs）、多糖裂解酶(PLs）和輔助活性(AAs）家族[4]。已有研究表明，真菌的CAZymes和CWDEs的種類和數(shù)量可以體現(xiàn)出真菌對(duì)于不同類型的植物生物量和生活方式的適應(yīng)和偏好[5]。牛肝菌屬于共生營養(yǎng)模式真菌，通過降解寄主中的木質(zhì)纖維素獲取主要碳源營養(yǎng)，其CWDEs以木質(zhì)纖維素降解酶為主[6]。盡管牛肝菌的基因組已公布，但對(duì)其CAZymes和CWDEs基因數(shù)量和種類并未進(jìn)行具體分析[7]。明確牛肝菌CAZymes和CWDEs的編碼基因的數(shù)量和類型可以從基因組水平解釋牛肝菌碳源環(huán)境適應(yīng)性，進(jìn)而為人工馴化和模擬自然環(huán)境栽培牛肝菌提供理論依據(jù)[8]。

真菌的次生代謝物主要由聚酮合成酶(polyketide synthase，PKS）、非核糖體多肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase，NRPS）、氫化酶、氧化酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等共同調(diào)控合成[9]。目前已知的真菌次生代謝物有苯丙素類、醌類、萜類、甾體、有機(jī)酸、生物堿等，具有食藥用活性[10]。牛肝菌作為重要食藥用真菌，已分離到的次生代謝產(chǎn)物有黃酮、多酚、甾體及萜類化合物等[11]。除了具有食藥用活性，這些次生代謝物還可幫助食用菌響應(yīng)環(huán)境變化，促進(jìn)寄主植物快速生長，提高寄主植物的環(huán)境適應(yīng)能力，在環(huán)境保護(hù)和生態(tài)修復(fù)方面也有著廣闊的研究價(jià)值[12]。因此，挖掘牛肝菌基因組中蘊(yùn)藏的次生代謝物合成的基因信息，可為研發(fā)具有潛在食藥用價(jià)值的新活性化合物提供參考[13]。

1 材料與方法

1.1 牛肝菌的基因組數(shù)據(jù)獲取和基因預(yù)測

研究所用的9種牛肝菌的基因組數(shù)據(jù)均從美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫下載所得，具體基因組ID和組裝信息見表1。所選9種牛肝菌已涵蓋目前NCBI和美國能源部聯(lián)合基因組研究中心(Joint Genomelnstitute，JGI）數(shù)據(jù)庫中已公布的牛肝菌屬基因組數(shù)據(jù)，且在我國滇黔桂地區(qū)皆有生長。利用GeneMark-ES軟件對(duì)基因組序列進(jìn)行基因預(yù)測，得到對(duì)應(yīng)基因組gtf、cds和pep文件[14]。

表1 9種牛肝菌基因組信息

1.2 生物信息學(xué)分析方法

1.2.1 CAZymes注釋

利用碳水化合物活性酶Carbohydrate-Active enZYmes Database(CAZy）數(shù)據(jù)庫對(duì)9種牛肝菌基因組進(jìn)行CAZymes注釋，BLAST比 對(duì)E value閾值為1e-5[15]。比對(duì)成功的基因根據(jù)CAZymes催化活性分屬到糖苷水解酶(glycoside hydrolases，GHs）、碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases，CEs）、多糖裂解酶(polysaccharide lyases，PLs）、糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyl transferases，GTs）、輔 助 活 性(auxiliary activities，AAs）和碳水化合物結(jié)合域(carbohydrate-binding modules，CBMs）6個(gè)家族。

1.2.2 CWDEs分析

根據(jù)CAZymes based ranking of fungi(CBRF）網(wǎng)站[16]中對(duì)植物細(xì)胞壁降解酶的分類，并結(jié)合CAZymes家族和注釋信息，對(duì)牛肝菌細(xì)胞壁降解酶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

1.2.3 次生代謝產(chǎn)物合成基因的預(yù)測

利用微生物次級(jí)代謝物合成基因簇注釋數(shù)據(jù)庫antiSMASH 5.0(https：//antismash-db.secondarymet abolites.org/）對(duì)9種牛肝菌次生代謝物合成基因簇進(jìn) 行 注 釋[17]。Cluster Blast、Known Cluster Blast、SubCluster Blast、Active Site Finder、TTA codon detection、TTA密碼子檢測、次級(jí)代謝物簇同源組預(yù)測和特定簇等注釋采用默認(rèn)比對(duì)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛肝菌CAZymes基因的注釋與分析

通過CAZy數(shù)據(jù)庫的注釋得知，9種牛肝菌的CAZymes基因數(shù)量分別為296(BBi）、315(BBr）、302(BC）、347(BE）、327(BM）、314(BO）、327(BSp）、43(BSu）、302(BR），分別分類到GHs、CEs、GTs、AAs、CBMs、PLs家族中(圖1）。9種牛肝菌根據(jù)CAZymes基因數(shù)量從高到低排序：BE＞BM＞BSp＞BBr＞BO＞BR＞BC＞BBi＞BSu。BE的CAZymes基因數(shù)量最多，其降解碳源能力最強(qiáng)，對(duì)不同碳源環(huán)境適應(yīng)性最高，可能更容易被人工馴化，而BSu的CAZymes基因數(shù)量最少，其降解碳源能力最弱，對(duì)不同碳源環(huán)境適應(yīng)性最差，可能較難被人工馴化。

9種牛肝菌CAZymes家族中，GHs和GTs家族基因數(shù)量最多，每種牛肝菌GHs家族基因數(shù)量分別占整個(gè)CAZymes基因數(shù)的37.46%～42.23%；GTs家族基因數(shù)量分別占整個(gè)CAZymes基因數(shù)的33.43%～44.19%；其次為CBMs家族，分別占整個(gè)CAZymes基因數(shù)的6.98%～16.71%；PLs家族基因數(shù)量最少，分別占整個(gè)CAZymes基因數(shù)的0%～0.34%(圖1）。不同牛肝菌的CAZymes家族基因數(shù)量均存在較大差異，其中AAs和CBMs家族基因數(shù)量差異明顯(圖1），這可能是由于不同牛肝菌品種對(duì)生境碳源適應(yīng)性差異造成的。

圖1 牛肝菌的碳水化合物活性酶（CAZymes）家族的基因數(shù)量比較

2.2 牛肝菌細(xì)胞壁降解酶基因的預(yù)測

真菌分泌的CWDEs均屬于CAZymes。根據(jù)降解底物和所屬CAZymes家族，將9種牛肝菌CWDE基因分屬于17種CWDEs，包括8個(gè)GH家族、1個(gè)CE家族、1個(gè)CBM家族、2個(gè)AA家族、1個(gè)GT家族(表2）。牛肝菌CWDEs主要為纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶，并存在少量的木質(zhì)素酶、淀粉酶、菊粉酶。其中，β-葡聚糖苷酶(β-glucosidase）和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase）的基因數(shù)量最多，說明牛肝菌降解纖維素主要依靠β-葡聚糖苷酶，而降解果膠主要依靠β-半乳糖苷酶。推測牛肝菌主要以寄主細(xì)胞壁的纖維素和果膠作為主要碳源(圖2）。

表2 牛肝菌細(xì)胞壁降解酶（CWDEs）的預(yù)測結(jié)果

圖2 牛肝菌的細(xì)胞壁降解酶（CWDEs）數(shù)量比較

9種牛肝菌中果膠酶、半纖維素酶和纖維素的基因數(shù)量存在明顯差異(表2，圖2）。BBi、BBr、BC、BE、BM、BO和BSp中CWDEs數(shù)量由高到低排序：半纖維素酶＞纖維素酶＞果膠酶；而BSu中CWDEs數(shù)量由高到低排序：纖維素酶＞半纖維素酶＞果膠酶，BR中CWDEs數(shù)量由高到低排序：半纖維素酶＞果膠酶＞纖維素酶(圖2）。由此可以看出，不同牛肝菌對(duì)寄主細(xì)胞壁碳源類型具有不同偏好性，BBr、BC、BE、BM、BO、BSp和BSu傾向于與纖維素含量高的植物共生，而BR傾向于與半纖維素、果膠含量高的植物共生。另外，9種牛肝菌中木質(zhì)素酶種類和數(shù)量基本一致，說明9種牛肝菌對(duì)木質(zhì)素降解能力相近。

2.3 牛肝菌次生代謝物合成基因的注釋和分析

通過antiSMASH數(shù)據(jù)庫[18]注釋，分別鑒定了9種牛肝菌的次生代謝物合成(secondary metabolismbiosynthesis，SMB）基因(表4，圖3），分別為136(BBi）、187(BBr）、217(BC）、314(BE）、186(BM）、112(BO）、199(BSp）、151(BSu）、489(BR）(圖3）。SMB基因類型包括了核心合成基因(表3）、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和調(diào)控因子以及其他調(diào)控基因(圖3），分別分類到6～11個(gè)次生代謝產(chǎn)物合成基因簇(Secondary metabolite gene clusters，SMC）(圖3）。9種牛肝菌SMC類型分為萜類(Terpene）、非核糖體多肽合成酶(NRPS；NRPS-like）和I型聚酮類(T1PKS）(表4）。萜類和非核糖體多肽合成酶類化合物、9種牛肝菌中除了BM和BO，其他7種牛肝菌均能合成I型聚酮類化合物。

表3 9種牛肝菌的次生代謝物核心合成基因注釋信息

表4 9種牛肝菌的次生代謝物合成基因簇類型預(yù)測結(jié)果

圖3 牛肝菌的次生代謝物合成基因數(shù)量

9種牛肝菌的SMB和SMC數(shù)量及類型均存在明顯差異。BBi、BR、BBr和BSu的SMC合成次生代謝物種類較多(表4），說明這4種牛肝菌有更多種類的生物活性物質(zhì)。BR的SMB基因數(shù)量最多(圖3），說明其次生代謝物合成機(jī)制最為復(fù)雜。根據(jù)鑒定出的類似次生代謝物發(fā)現(xiàn)，除了BE，其他8種牛肝菌均能合成Basidioferrin；BC、BE和BSp均合成1，3，6，8-tetrahydroxynaphthalene；BBi能夠合成萘并吡喃酮(Naphthopyrone）；BE能夠合成Cryptophycin、擬南芥比醇(Arabidiol）和利迪卡霉素(Lydicamycin）；BR還能合成鐮刀菌素(Fusarin）。說明9種牛肝菌可能具有各自特有的生物活性物質(zhì)(表3）。

3 小結(jié)與討論

牛肝菌是全球著名的野生食用菌之一，隨著人們社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、生活水平的提高，牛肝菌的食藥用價(jià)值及生態(tài)效益越發(fā)受到重視[19]。目前盡管已有人工栽培的牛肝菌，但尚不能滿足龐大的消費(fèi)市場，并且由于牛肝菌天然產(chǎn)物的產(chǎn)量低，藥用研發(fā)和應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)成本極高。多種牛肝菌基因組的公布，將為牛肝菌有益資源的利用提供一個(gè)新的途徑[7]。

牛肝菌種類多樣，不同的生態(tài)環(huán)境中生長的牛肝菌基因組遺傳變異較大[20]。研究根據(jù)CAZymes家族分類信息，補(bǔ)充了9種牛肝菌基因組CAZymes家族基因和CWDEs種類等信息，結(jié)果表明，牛肝菌的GTs、GHs、CBMs基因數(shù)量較多；CWDEs主要為纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶，其中多聚半乳糖醛酸酶和β-1，4-葡聚糖酶基因數(shù)量較多。9種牛肝菌的CAZymes、CWDEs基因數(shù)量存在一定差異，與牛肝菌的生長方式及營養(yǎng)偏好性密切相關(guān)，說明不同牛肝菌品種對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)的要求可能存在明顯差異，因而在牛肝菌馴化試驗(yàn)中，需要根據(jù)寄主植物細(xì)胞壁成分的差別來調(diào)整基質(zhì)添加物的成分及配比。已公布的其他食用菌基因組比較研究結(jié)果表明，因寄生環(huán)境的差異，其分泌的CAZymes、CWDEs含量和種類不同[2，20-21]。若食用菌傾向于寄生富含果膠的植物組織，其基因組中果膠酶和半纖維素酶基因較多，而纖維素酶基因較少；食用菌傾向于寄生木質(zhì)或禾本科植物(寄主細(xì)胞壁果膠含量少），其基因組中纖維素酶和半纖維素酶基因較多，而果膠酶基因數(shù)量較少[22]。研究表明，根據(jù)不同食用菌生長所需的碳源、氮源及微量元素，在栽培基質(zhì)中添加相應(yīng)的成分，可提高其菌絲體產(chǎn)量[23]。在哈根培養(yǎng)基中加入蜀葵浸出液，可培養(yǎng)出白牛肝菌(Boletus griseusForst）子實(shí)體[24]；在果膠精氨酸培養(yǎng)基中加入特殊誘導(dǎo)物(環(huán)3’-5’-AMP和茶堿），也能夠培育出白牛肝菌子實(shí)體[25]。因此，栽培BR的培養(yǎng)基應(yīng)富含半纖維素和果膠的植物組織，而BBr、BC、BE、BM、BO、BSp、BSu須選用木質(zhì)纖維素含量高的植物材料作為基質(zhì)的輔助成分。

次生代謝物是食用菌在長期進(jìn)化中與生態(tài)環(huán)境相互作用的產(chǎn)物，其與食用菌食藥用價(jià)值密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，牛肝菌次生代謝物質(zhì)具有防癌、止咳、補(bǔ)氣，清熱解煩、養(yǎng)血和中等功效，對(duì)高血壓、高膽固醇和高血脂等疾病有良好的調(diào)理功效[11]。真菌次生代謝產(chǎn)物的數(shù)量、種類與其合成的相關(guān)基因(基因簇）數(shù)量和類型顯著正相關(guān)[13]。研究對(duì)牛肝菌SMB和SMC進(jìn)行了注釋，發(fā)現(xiàn)9種牛肝菌SMC種類為萜類、非核糖體肽合成酶類和I型聚酮類化合物。大型真菌中分離的單萜、倍半萜、二萜和三萜類化合物具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗氧化、降血糖等藥理活性[26]。聚酮類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、免疫抑制、抗菌活性、抗炎癥和抗寄生蟲等生物活性[27]。非核糖體肽合成酶合成的非核糖體肽是抗生素、免疫抑制劑的重要化合物來源，具有抗菌、殺蟲，降低膽固醇和抗癌等活性[28]。

9種牛肝菌的SMB基因數(shù)量、SMC數(shù)量及類型均存在明顯差異，說明9種牛肝菌可能具有各自特有的生物活性物質(zhì)。通過相似化合物對(duì)比發(fā)現(xiàn)，除了BE，其他8種牛肝菌均能合成抗病毒和抗癌的Basidioferrin[29]。BC、BE、BSp均合成1，3，6，8-tetrahydroxynaphthalene。該酶在色素合成和提高菌株抗病力方面具有重要作用[30]。BBi能夠合成具有抗癌活性的萘并吡喃酮(Naphthopyrone）。萘并吡喃酮在絲狀子囊菌中還具有抵御昆蟲侵襲的作用[31-32]。

BE能夠合成Cryptophycin、擬南芥比醇(Arabidiol）和利迪卡霉素(Lydicamycin）。Cryptophycin屬于一種強(qiáng)效抗癌劑[33]；Arabidiol是一種三萜類化合物，可使擬南芥根據(jù)自身目的塑造和調(diào)整根內(nèi)和根周圍的微生物群落[34]，利迪卡霉素(Lydicamycin）是一種新型抗生素，對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌具有良好抑制效果[35]?？梢姡珺E的次生代謝產(chǎn)物不僅具有藥用活性，還具有潛在工業(yè)利用價(jià)值。

BR能夠合成植物毒素鐮刀菌素(Fusarin）。該毒素屬于非特異性的聚酮類植物毒素，能夠破壞植物細(xì)胞的代謝機(jī)能，還對(duì)哺乳動(dòng)物具有致癌性[36]。因此BR可能對(duì)人體具有潛在的毒性影響，在進(jìn)行其次生代謝活性成分發(fā)酵時(shí)，需優(yōu)化相關(guān)發(fā)酵條件，保證BR的食品安全性。

目前牛肝菌已分離到的次生代謝產(chǎn)物還有黃酮、多酚、甾體等[11]，但對(duì)這些代謝產(chǎn)物的生物合成途徑及機(jī)制的研究較少，未能與研究中未知功能的SMC及合成次生代謝物質(zhì)相匹配。深入研究牛肝菌SMB和次生代謝產(chǎn)物的合成途徑及機(jī)制，有助于進(jìn)行牛肝菌活性物質(zhì)的藥理分析和體外合成研究，對(duì)牛肝菌天然產(chǎn)物的應(yīng)用具有重要推動(dòng)作用[37]。