艾亮 張盛 王強 李夏 成柯

愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein-Barr virus，EBV）相關(guān)性移植后淋巴組織增生性疾病（posttransplant lymphoproliferative disease，PTLD）是造血干細胞及實體器官移植術(shù)后因免疫功能障礙導(dǎo)致從多克隆增生到非霍奇金淋巴瘤的一組疾病[1]。EBV是隸屬于γ皰疹病毒的DNA病毒，人類是其唯一宿主，主要侵襲人B細胞與口咽部上皮細胞。EBV人群易感性高，主要通過飛沫傳播，實體器官移植受者還可能經(jīng)由EBV血清學(xué)陽性的供者或輸注未去除白細胞成分的血制品感染。PTLD是一系列異質(zhì)性疾病病變，包括病理類型、臨床特征和預(yù)后異質(zhì)性等。病理學(xué)類型表現(xiàn)可以從反應(yīng)性多克隆B細胞良性增生到惡性侵襲性的淋巴瘤，超過70%與EBV感染相關(guān)[1-2]。

EBV相關(guān)性PTLD是兒童器官移植受者中最常見的惡性腫瘤，在兒童腎移植受者中發(fā)生率為3%～7%，其發(fā)展迅速并可能致命，病死率約為50%[3-4]。EBV相關(guān)性PTLD的治療方案包括減少或撤除免疫抑制劑、化學(xué)藥物治療、放射治療、抗CD20抗體利妥昔單抗治療及手術(shù)切除等[5]。 然而， 這些方法的療效尚未確定，復(fù)發(fā)率和治療相關(guān)的病死率高是目前臨床面臨的主要問題，且缺乏個體化治療方案，最佳治療方案尚沒有形成共識。鑒于這些挑戰(zhàn)，迫切需要開發(fā)微創(chuàng)生物標(biāo)志物，以改善器官移植受者EBV相關(guān)性PTLD的早期診斷、個性化管理和治療。本綜述旨在闡明實體器官移植術(shù)后EBV相關(guān)性PTLD的細胞、分子和遺傳特征，并討論其作為潛在生物標(biāo)志物的可能性。

1 EBV的生命周期和免疫反應(yīng)

1.1 EBV的生命周期

EBV通常通過唾液從被感染的個體傳播到宿主，但在器官移植特別是兒童器官移植中，EBV可通過移植物進行傳播，如受者EBV血清學(xué)陰性，但接受了EBV血清學(xué)陽性供者的器官。EBV感染后，首先進入裂解階段，在口咽部復(fù)制，涉及上皮細胞和B細胞，并在產(chǎn)生新病毒子代時達到頂峰。病毒顆粒會脫落并繼續(xù)感染其他細胞，或被傳播到另一個宿主。在免疫功能正常的個體中，裂解階段一般無癥狀，但青少年和年輕人可發(fā)生傳染性單核細胞增多癥（infectious mononucleosis，IM），通常為自限性。最終，EBV過渡到一個慢性的潛伏階段，隱藏在宿主的記憶性B細胞中。EBV可以周期性地重新激活，可能是由感染細胞的B細胞受體的抗原接觸所觸發(fā)，但這一過程的確切機制仍不清楚。

1.2 EBV的免疫反應(yīng)

個體感染EBV后，EBV囊膜上的gp350/220蛋白與B細胞上的CD21結(jié)合，通過細胞內(nèi)吞作用進入B細胞，導(dǎo)致B細胞感染。這些EBV感染的B細胞可以表達潛伏膜蛋白（latent membrane proteins，LMP）和EBV核抗原，進而被宿主識別，通過CD8+細胞毒T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）對其進行殺傷和清除[6]。這種細胞毒性效應(yīng)可以減少EBV感染的B細胞數(shù)量，但是卻不能將其徹底清除，因為EBV還能感染記憶性B細胞，并且表達的LMP1可以上調(diào)抗凋亡基因的表達，以及誘導(dǎo)B細胞進入潛伏感染狀態(tài)，從而減少病毒抗原的表達，避免CTL的殺傷[6]。因此，EBV感染的B細胞與宿主的免疫系統(tǒng)處于動態(tài)平衡的狀態(tài)。但對于接受免疫抑制治療的實體器官移植受者，B細胞凋亡觸發(fā)過程受到抑制，使得EBV誘發(fā)的B細胞增殖與免疫系統(tǒng)（增殖、凋亡）間的平衡被破壞，異常B細胞克隆性增生，導(dǎo)致PTLD。

另外，亦有文獻報道T細胞與EBV的免疫應(yīng)答有關(guān)[7]。病毒生命周期的每個階段都與特定病毒蛋白的表達相關(guān)，這些病毒蛋白能夠引發(fā)由T細胞（主要是CD8+T細胞）介導(dǎo)的細胞免疫反應(yīng)，CD4+T細胞也發(fā)揮了一定的作用[8]。但受者感染EBV后，機體所發(fā)生的免疫應(yīng)答過程，特別是繼續(xù)發(fā)展為EBV相關(guān)性PTLD的過程，目前尚不清楚。在這個過程中，免疫抑制劑對T細胞功能的抑制被認(rèn)為是EBV相關(guān)性PTLD發(fā)展的主要因素。

2 EBV監(jiān)測的方法及臨床意義

2.1 EBV監(jiān)測的方法

EBV血清學(xué)檢測通常用于評估病毒感染狀態(tài)，并且可以針對EBV編碼的潛伏周期蛋白特異性抗體[9]。然而，由于免疫狀態(tài)的改變，移植受者血清學(xué)的變化更為復(fù)雜。因此，基于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）直接定量EBV DNA的方法被廣泛用于監(jiān)測移植術(shù)后病毒載量，特別是在EBV陰性兒童受者接受來自EBV陽性供者的移植物中。雖然EBV相關(guān)性PTLD可以在移植術(shù)后的任何時候出現(xiàn)，但在移植術(shù)后1年內(nèi)，即免疫抑制最強的時期，發(fā)生率最高，因此在這一時期監(jiān)測最為重要。此外，PCR可用于EBV相關(guān)性PTLD出現(xiàn)癥狀時的EBV監(jiān)測，也可用于監(jiān)測EBV相關(guān)性PTLD的治療反應(yīng)。通常EBV DNA載量的閾值由各實驗室確定，不利于跨中心比較。世界衛(wèi)生組織對于EBV國際標(biāo)準(zhǔn)的制定將有助于各中心基于PCR的EBV DNA定量的協(xié)調(diào)統(tǒng)一[10]。然而，目前尚不清楚哪種方式對病毒定量分析最有效。大多數(shù)研究采用全血或血漿，但也有少量研究利用血清、外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）或分離的B細胞來評估EBV DNA載量。有研究發(fā)現(xiàn)在不同器官樣本中，EBV DNA載量閾值、使用的檢測量有顯著差異[11]。因此，當(dāng)早期診斷PTLD時，評估這些信息對于監(jiān)測EBV DNA載量具有重要意義。

2.2 EBV監(jiān)測的臨床意義

由于EBV相關(guān)性PTLD的臨床表現(xiàn)多樣，缺乏特異性，而EBV DNA載量與EBV相關(guān)性PTLD 的發(fā)生發(fā)展及演化過程變化相一致，實驗室血清學(xué)檢測EBV抗體靈敏度不高，因此，EBV特異性抗體可用于判斷移植前供、受者EBV血清學(xué)狀態(tài)，以評估PTLD的發(fā)生風(fēng)險；而動態(tài)測定EBV DNA載量對于高危患者術(shù)后早期PTLD的診斷以及治療具有重要的指導(dǎo)意義。

一項單中心研究提示，兒童肝移植術(shù)后PTLD患者的EBV DNA載量≥10 000 copies/mL是有臨床意義的，EBV DNA載量=10 875 copies/mL可作為臨界值，靈敏度為0.929，特異度為0.379，密切監(jiān)測EBV DNA載量對兒童肝移植受者PTLD的早期診斷和正確治療至關(guān)重要[12]。另一項單中心研究提示，兒童腎移植術(shù)后PTLD患者EBV DNA載量的最大峰值高于整體觀察到的中位數(shù)（59 909 copies/mL）是非早期病變PTLD和所有PTLD發(fā)病的獨立危險因素，高EBV DNA載量與PTLD的發(fā)生有關(guān)[13]。

3 EBV相關(guān)性PTLD的生物標(biāo)志物

美國國立衛(wèi)生研究所于2001年將生物標(biāo)志物定義為一種能客觀測量并評價正常生物過程、病理過程或?qū)λ幬锔深A(yù)反應(yīng)的指示物[14]。生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、驗證和可重復(fù)性測試是一個嚴(yán)格的、多步驟的過程，必須應(yīng)用各種統(tǒng)計測試來建立[15]。雖然目前已有關(guān)于EBV相關(guān)性PTLD腫瘤標(biāo)本的研究，但還沒有確定的用于EBV相關(guān)性PTLD的生物標(biāo)志物。

3.1 病毒核酸和蛋白質(zhì)

組織中病毒核酸和蛋白質(zhì)檢測可用于確定組織中EBV的存在。Epstein-Barr編碼區(qū)（Epstein-Barr encoding region，EBER）的原位雜交是檢測組織切片中EBV的標(biāo)準(zhǔn)方法。EBER檢測可用于提示潛伏性EBV感染，并有助于將病毒定位于病變內(nèi)的特定細胞類型。LMP1是一種EBV編碼的潛伏周期蛋白，可通過免疫組織化學(xué)染色鑒別組織標(biāo)本中EBV感染的細胞。但也有專家認(rèn)為，鑒于抗LMP1抗體在腫瘤中的表達具有潛在可變性，所以該方法的可靠性有待證實[16]。

微小核糖核酸（micro RNA，miRNA，miR）是一種微小非編碼RNA，在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起重要作用，且在血液中穩(wěn)定表達，已成為生物標(biāo)志物方面的研究熱點。研究表明，EBV是第一個被發(fā)現(xiàn)可以編碼miRNA的病毒[17]。盡管關(guān)于EBV miRNA在B細胞轉(zhuǎn)化和增殖過程中作用的研究眾多，但涉及其作為EBV相關(guān)性PTLD生物標(biāo)志物的研究相對較少。Hassan等[18]檢測了42例兒童腎移植受者BART和BHRF病毒開放閱讀框的EBV miRNA，發(fā)現(xiàn)幾個衍生的miRNA，包括BART7-3p、15、9-3p、1-3p和3-3p僅在經(jīng)典的霍奇金淋巴瘤和IM受者中檢測到。Navari等[19]發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤組織中的表達主要是細胞起源的，EBV miRNA的表達因EBV相關(guān)性PTLD的異質(zhì)性而不同，如與EBV相關(guān)性Burkitt淋巴瘤組織不同，彌漫性大B細胞淋巴瘤型PTLD中能檢測到EBV miR-BHRF-1-2。Zimmermann等[20]發(fā)現(xiàn)大多數(shù)EBV相關(guān)性PTLD標(biāo)本中存在BART編碼和BHRF1編碼的miRNA，但不同類型的PTLD中miRNA表達不同。

EBV不僅可編碼自身miRNA，也可以調(diào)節(jié)其感染的宿主細胞miRNA。Sang等[21]的研究表明，EBV在人B細胞中潛伏感染的建立顯著改變了宿主細胞miRNA的表達。已有研究證實，miR-155可加速B細胞惡性腫瘤的發(fā)展[22]，miR-194參與白細胞介素（interleukin，IL）-10的調(diào)節(jié)[23]。近期研究證明，EBV感染的細胞可以釋放含有miRNA的外泌體到細胞外環(huán)境，這表明外泌體可能是血液中EBV相關(guān)miRNA的來源[24]。EBV感染B細胞來源的miRNA，在EBV相關(guān)惡性腫瘤（如鼻咽癌）中具有作為生物標(biāo)志物的潛力[25]。

Evens等[26]對PTLD受者、非PTLD受者和EBV血癥的非移植受試者血液中裂解周期基因BZLF1和潛伏周期基因LMP2A的表達進行了分析，結(jié)果表明PTLD和非PTLD受者LMP2A/BZLF1比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但均低于EBV血癥的非移植受試者。Habib等[27]對35例PTLD受者的血清進行檢測發(fā)現(xiàn)，60%的PTLD受者檢測到可溶性EBV BZLF1基因的產(chǎn)物ZEBRA蛋白，且早發(fā)PTLD受者ZEBRA蛋白水平明顯高于晚發(fā)PTLD受者。

研究表明潛伏期基因EBNA3c、LMP1和LMP2A/B以及溶解期相關(guān)基因gp350在PTLD心臟移植受者血液中的表達是可變的，具有溶解期和潛伏期的混合模式[28]。最常見的特征是潛伏期3和溶解期混合活動，可在病毒水平升高的未發(fā)病受試者（病毒攜帶者）中觀察到，但PTLD受者中尚未發(fā)現(xiàn)[29]。

以上研究表明單純的病毒基因表達與EBV相關(guān)性PTLD的發(fā)生無關(guān)。因此，需要更多的研究來確定病毒基因表達是否可以用來預(yù)測EBV相關(guān)性PTLD的癥狀和發(fā)病情況。一項針對兒童移植受者的多中心前瞻性臨床研究正在進行，主要評估LMP1中兩個功能增益突變的存在是否與EBV相關(guān)性PTLD風(fēng)險增加有關(guān)[30]?？深A(yù)見地說，下一代測序方法可能有助于識別與EBV相關(guān)性PTLD發(fā)展相關(guān)的病毒基因組變異和（或）突變，并可能產(chǎn)生新的候選生物標(biāo)志物。

3.2 基因多態(tài)性和人類白細胞抗原

細胞因子在介導(dǎo)和調(diào)節(jié)病毒和腫瘤細胞免疫應(yīng)答中起著重要作用，而單核苷酸多態(tài)性與細胞因子水平相關(guān)。有研究檢測了移植受者細胞因子基因多態(tài)性，以確定特定細胞因子水平與EBV相關(guān)性PTLD的關(guān)系。雖然研究者發(fā)現(xiàn)二者存在一定的關(guān)聯(lián)，但同時存在一些非確定性或相互矛盾的結(jié)果，導(dǎo)致細胞因子基因多態(tài)性作為預(yù)測EBV相關(guān)性PTLD風(fēng)險的潛在生物標(biāo)志物尚未達成共識。

T細胞和自然殺傷細胞產(chǎn)生的干擾素（interferon，IFN）-γ在抗病毒應(yīng)答中非常重要，低水平IFN-γ與EBV相關(guān)性PTLD的早期發(fā)病有關(guān)[31]。Toyoda等[32]和Lee等[33]在PTLD受者中發(fā)現(xiàn)IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β低基因型之間存在關(guān)聯(lián)。此外，McAulay等[34]報道，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α啟動子內(nèi)的一種特定變異等位基因在EBV相關(guān)性PTLD受者中更為常見，而淋巴毒素、IL-1α、IL-6、IL-10、TNF受體Ⅰ或Ⅱ、IL-1受體和IL-10受體的多態(tài)區(qū)域中未見差異。因此，目前還沒有明確的某一個細胞因子基因多態(tài)性或某一組基因多態(tài)性提示EBV相關(guān)性PTLD發(fā)生風(fēng)險的增加。

研究發(fā)現(xiàn)，移植受者的人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）可能會影響EBV免疫應(yīng)答的程度，這是由于EBV衍生肽的抗原提呈和病毒效應(yīng)細胞識別的不同，供者或受者HLA不同亞型與EBV相關(guān)性PTLD易感性有關(guān)[35]。

3.3 其他可能對PTLD診斷有幫助的病毒

德國Quake實驗室檢測了96例心臟移植和肺移植受者血漿游離循環(huán)DNA中的人類病毒，并分析了免疫抑制和抗病毒預(yù)防對病毒水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)特定的病毒與不同水平的藥物治療相關(guān)[22]。當(dāng)免疫抑制和抗病毒藥物水平較低時，患者血漿皰疹病毒和有尾噬菌體的載量較高，反之則以指環(huán)病毒為主，活組織檢查證實發(fā)生排斥反應(yīng)的受者其細環(huán)病毒載量顯著低于無排斥反應(yīng)的受者[22]。在高水平的指環(huán)病毒提示過度免疫抑制的情況下，指環(huán)病毒載量可能是體現(xiàn)免疫能力的替代標(biāo)志物。另有研究對PTLD受者石蠟包埋淋巴瘤組織的鳥槍法宏基因組測序結(jié)果顯示，50%以上PTLD受者的標(biāo)本含有指環(huán)病毒序列，單因素變量分析顯示指環(huán)病毒水平（而非EBV水平）與受者5年內(nèi)死亡有關(guān)[35]。這些發(fā)現(xiàn)表明，病毒組的變化，甚至是特定的病毒組分變化如指環(huán)病毒，可間接提示免疫抑制水平和免疫狀態(tài)，同時影響EBV相關(guān)性PTLD的疾病發(fā)展。

4 EBV陰性PTLD的病因及PTLD預(yù)后情況

部分PTLD受者表現(xiàn)為EBV陰性，且近年來有增加趨勢，但病因不明。因此，診斷PTLD并不一定要依靠EBV監(jiān)測。EBV陰性PTLD在發(fā)病機制不同于EBV相關(guān)性PTLD，而是與EBV陰性的惡性淋巴瘤類似。EBV陰性PTLD只是恰巧發(fā)生于免疫抑制狀態(tài)下，而不是真正的EBV相關(guān)性PTLD。不考慮EBV相關(guān)與否，目前PTLD受者總體預(yù)后較差，總病死率為25%～60%，治療手段的進步可提高PTLD受者的總體生存率[36]。已有研究表明，降低免疫抑制水平可以使疾病消退，在沒有排斥反應(yīng)的情況下，可取得較好的治療效果，尤其是兒童受者。同時，PTLD的不良預(yù)后相關(guān)因素已有報道，高水平的乳酸脫氫酶、低蛋白血癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累及高齡等與不良預(yù)后相關(guān)[37]。

5 小 結(jié)

綜上所述，EBV相關(guān)性PTLD的診斷和治療仍然是臨床一大挑戰(zhàn)，尋找非侵入性、特異性和敏感性的生物標(biāo)志物指導(dǎo)臨床診斷和治療具有重要意義。目前，生物標(biāo)志物的焦點主要集中于可以在血液中檢測到的病毒核酸、蛋白質(zhì)和HLA。已有研究發(fā)現(xiàn)了一些很有潛力的候選分子，但在識別作為EBV相關(guān)性PTLD發(fā)生、診斷和治療反應(yīng)的特定風(fēng)險指標(biāo)的生物標(biāo)志物等方面仍存在重大挑戰(zhàn)，未來基于綜合分析候選分子和測量病毒載量，可能會獲得更好的分析結(jié)果。此外，目前大多數(shù)研究都是在樣本量較少的成年受試者中進行的，因此，建立以兒童受者為研究對象的隊列研究，對于探索和驗證高靈敏度生物標(biāo)志物是十分重要的。