吳海峰 李 曼 李玉靜 江 乾 李 亮 趙世彬 乜照燕**

1. 河北省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科（河北石家莊 050021）；2. 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科（河北石家莊 050011）

過度氧化應(yīng)激可以對精子細(xì)胞造成損傷，影響精子活力，導(dǎo)致精子DNA 完整性降低，影響男性生育力[1]。白藜蘆醇（Resveratrol，RES）是一種天然多酚類物質(zhì)，主要存在于虎杖、葡萄和紅酒中[2]。RES 具有多種生物學(xué)活性如抗腫瘤、抗炎、抗氧化等[3]。RES 化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在酚羥基，具有抗氧化作用，可以清除過氧化物減輕細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化和各種活性氧產(chǎn)物對細(xì)胞的損傷[4]。鑒于此，本研究利用過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）建立精子氧化應(yīng)激損傷模型，探討RES 對H2O2誘導(dǎo)精子氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，為男性不育抗氧化治療提供依據(jù)。

材料和方法

一、試劑和儀器

Percoll 細(xì)胞分離液購自Solarbio 公司 （Lot. No.5111042）；白藜蘆醇( VETEC，900386-5 G) 購自Vetec公司；伊紅- 苯胺黑染液(20201201)、精子吖啶橙購自華康生物工程公司。離心機(jī)購自eppendorf 公司，相差顯微鏡購自O(shè)lympus 公司，熒光顯微鏡購自O(shè)lympus公司，酶標(biāo)分析儀購自Biotek 公司。

二、精液收集和處理

收集2019 年12 月于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科精液常規(guī)檢查正常精液標(biāo)本?；颊吣挲g25～32歲，平均年齡(29.0±2.4) 歲。所有樣本均在禁欲2-7 天后通過手淫法收集，收集精液于干凈容器后立即送精液檢查室，在室溫下放置30 min，待精液液化后，依據(jù)WHO 人類精液實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊第五版進(jìn)行精液參數(shù)常規(guī)分析[5]，本項(xiàng)研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理編號：2020KSO29）。

三、H2O2 誘導(dǎo)精子毒性作用和RES 保護(hù)作用

取上述精液標(biāo)本進(jìn)行Percoll 密度梯度離心。具體操作如下：準(zhǔn)備梯度液，40% Percoll 液1.5 ml+80% Percoll 液1.5 ml，將精液2 ml 緩慢加入15 ml 尖底離心管，1 200 r/min 離心15 min，棄上清，底層白色沉淀即為分離出精子。棄上清后底層精子加入2 ml 培養(yǎng)液，1 200 r/min 離心5 min，洗滌1 次后加入培養(yǎng)液調(diào)整精子濃度為20×106/ ml，處理后精液每份取0.1 ml，加入終濃度0、25、50、75、100 μmol/L H2O2置5% CO2，37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每組設(shè)5 個標(biāo)本，計(jì)數(shù)前向運(yùn)動精子和總活力精子百分比，選擇H2O2濃度建立精子氧化應(yīng)激損傷模型。

選用不同濃度5、10、25、50、75 μmol/L RES 和上述三中確定H2O2濃度，置5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱共培養(yǎng)24 h，每組設(shè)5 個標(biāo)本，計(jì)數(shù)精子前向運(yùn)動和總活力精子百分比，確定RES 最佳改善濃度。

四、實(shí)驗(yàn)分組和各項(xiàng)相關(guān)指標(biāo)測定

根據(jù)上述確立H2O2和RES 濃度將實(shí)驗(yàn)分為3 組：對照組(CON)：處理后精液不做處理，置5% CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；H2O2模型組(H2O2)： 加入H2O2（H2O2濃度按三確定），置5% CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；RES+H2O2改善組(RES+H2O2)，加入H2O2和RES（H2O2和RES 濃度按三確定），5% CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；待處理后檢測各組精子膜完整性、精子氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA 和精子DNA 損傷。

（一）伊紅- 苯胺黑法評估精子膜完整性

使用移液器吸取10 μl 各組精液樣本于干凈EP管，加入10 μl 伊紅- 苯胺黑溶液在EP 管內(nèi)充分?jǐn)嚢杌靹?，放?0 s。滴加上述精液和伊紅- 苯胺黑染色液混合液10 μl 于載玻片上，制成涂片，自然干燥后100×油鏡下觀察。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器來計(jì)數(shù)染色（精子膜不完整，淡紅色）和不染色（精子膜完整，白色）細(xì)胞數(shù)目。為了降低誤差，每張玻片評估200 個精子。

（二）氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛測定

精子膜脂類過氧化反應(yīng)的程度一般用氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)表示，MDA 測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法，本研究采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒(KGT004-1)測定。測定管為0.1 ml 取待測精液，按照說明書操作設(shè)空白管、標(biāo)準(zhǔn)管及標(biāo)準(zhǔn)空白管，分別加入相應(yīng)試劑，450 nm 處BioTek 酶標(biāo)儀測定。結(jié)果用nmol/ml 表示。

（三）精子DNA 損傷測定

采用精子吖啶橙(acridine orange，AO) 染色法，取10 μl 各組精子凃片，室溫自然晾干后甲醇固定。AO 染液新鮮配制，染色5 min 后緩慢流水沖洗，室溫干燥后用熒光顯微鏡于×400 觀察，激發(fā)濾光片使用波長460～490 nm，快速計(jì)數(shù)，每個視野下觀察時間不超過40 s。每個樣本觀察計(jì)數(shù)不少于10 個視野。判斷標(biāo)準(zhǔn)：正常精子為正常雙鏈DNA，呈綠色，損傷精子呈紅色或黃色。計(jì)數(shù)200 條精子中綠色(G)、紅色(R)和黃色(Y)精子數(shù)，計(jì)算出DNA 完整精子百分率。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用Excel 表格錄入數(shù)據(jù)，采用雙錄入法核實(shí)無誤后，將數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差x±s表示，均值比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法，以P＜0.05 表示組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、H2O2 導(dǎo)致精子前向運(yùn)動精子和總活力下降

不同濃度H2O20、25、50、75、100 μmol/L 處理后，結(jié)果顯示：與對照組比較，隨著H2O2濃度增加，精子前向運(yùn)動和總活力隨著H2O2濃度增加逐漸降低，呈劑量依賴關(guān)系。與未加H2O2組相比，50、75、100 μmol/L 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1），選擇100 μmol/L 為后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度。

表1 H2O2 對處理后精子前向運(yùn)動和總活力影響(x±s)

二、RES 改善H2O2 導(dǎo)致精子活力下降

加入不同濃度RES 和H2O2共同作用后，結(jié)果顯示：隨著RES 濃度增加，精子前向運(yùn)動和總活力百分比逐漸增加，RES 濃度50 μmol/L 時，精子前向運(yùn)動和總活力逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示RES預(yù)處理對H2O2損傷后精子活力有改善作用。在RES 濃度50 μmol/L 效果最佳。選擇50.0 μmol/L 為后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度（P＜0.05），見表2。

表2 RES 預(yù)處理對H2O2 誘導(dǎo)處理對精子前向運(yùn)動和總活力影響(x±s)

三、RES 改善H2O2 導(dǎo)致精子氧化應(yīng)激、精子膜完整性改變和精子DNA 完整性

與RES+H2O2相比，H2O2組MDA 水平增高，精子膜完整性百分比降低，精子DNA 完整性百分比降低，結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 RES 預(yù)處理對H2O2 誘導(dǎo)精子氧化應(yīng)激水平影響(x±s)

討 論

活性氧(reactive oxygen species, ROS)是機(jī)體正常有氧代謝的中間產(chǎn)物，在正常條件下，機(jī)體保持氧化與抗氧化系統(tǒng)平衡，當(dāng)機(jī)體遭受各種內(nèi)外環(huán)境有害刺激時，機(jī)體可產(chǎn)生氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。氧化應(yīng)激損傷可以造成精子結(jié)構(gòu)和精子功能損害，是引起男性不育病因之一[6]。男性不育與其精漿中活性氧水平密切相關(guān)，過量活性氧會對精子細(xì)胞膜和精子DNA 造成嚴(yán)重的氧化損傷，從而引起精子膜脂質(zhì)、超微結(jié)構(gòu)損傷，導(dǎo)致精子運(yùn)動能力下降[7]。此外，在輔助生殖技術(shù)（Assisted Reproductive Technology，ART）精子優(yōu)選過程多次離心會刺激精子產(chǎn)生大量ROS 誘發(fā)氧化應(yīng)激。因此如何防范氧化應(yīng)激導(dǎo)致男性生育力降低和減少離心過程中過量ROS 生成，對改善男性精子水平和提高ART 妊娠結(jié)局意義重大。目前應(yīng)用抗氧化劑主要有維生素C、維生素E、輔酶Q10、蝦青素等，這些人工合成抗氧化劑具有相對分子質(zhì)量大、不易吸收的缺點(diǎn)。因此我們需要尋找一種新的天然的、無生物危害、易于吸收抗氧化劑，以保護(hù)精子免受氧化應(yīng)激損傷。

RES 是在葡萄皮、虎杖等植物提取到的非黃酮類多酚化合物，分子式C12H14O3，分子質(zhì)量228.25ku，它在葡萄籽提取物、葡萄汁和葡萄皮中含量豐富。目前，以其來源廣泛、高效、低毒等特性受到研究者重視。RES能有效清除過氧化物和羥基，具有強(qiáng)大抗氧化作用，防止氧化應(yīng)激對細(xì)胞造成損傷[8]。RES 能夠激活體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）等，具有細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性[9]。另外研究發(fā)現(xiàn)RES 具有增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化功能，可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷而減少細(xì)胞死亡[10]。RES在人類心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病等發(fā)揮重要作用[11]，但在精子方面作用研究較少。

故本研究建立了H2O2誘導(dǎo)精子氧化應(yīng)激模型，探討了白藜蘆醇對H2O2誘導(dǎo)精子氧化應(yīng)激模型的保護(hù)作用。本研究所用精子為處理后精子，經(jīng)過梯度離心處理，精子前向運(yùn)動精子一般都在90%以上。

有研究認(rèn)為精子運(yùn)動是精子氧化應(yīng)激損傷最早而且最敏感的指標(biāo)[12]。本研究結(jié)果顯示，H2O2添加抑制精子活力。隨H2O2濃度增加精子活力不斷下降，在100 μmo1/L 精子活力下降最明顯，由于精液計(jì)數(shù)存在一定誤差，本研究選用了一個使前向運(yùn)動精子和精子總活力下降最大濃度100 μmo1/L H2O2作為精子氧化應(yīng)激模型研究濃度。在RES+H2O2組，隨著RES 濃度升高，精子前向運(yùn)動和總活力百分比得到提升，這一結(jié)果提示我們，適宜濃度RES 可提高H2O2誘導(dǎo)精子活力下降，其中50 μmol/L RES 濃度效果最佳，故選擇50.0 μmol/L 為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中最佳濃度。此外，研究還發(fā)現(xiàn)75 μmol/LRES 精子前向運(yùn)動百分比和總活力百分比有稍微下降，是否RES 在高濃度會對精子活力產(chǎn)生抑制作用尚需進(jìn)一步研究。

精子膜表面富含多聚不飽和脂肪酸，容易受到氧化應(yīng)激攻擊，使精子膜結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷進(jìn)而影響精子活力和功能。RES 作為一種自由基清除劑，能有效地與脂質(zhì)雙分子層中的自由基相互作用，并增強(qiáng)過膜流動性，穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)[13]，本研究顯示，H2O2處理后，導(dǎo)致精子膜完整性降低，RES 處理顯著抑制了H2O2誘導(dǎo)精子膜完整性降低，由此可見，RES 具有穩(wěn)定精子細(xì)胞膜作用。

精子細(xì)胞質(zhì)含量少，含有清除作用的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)抗氧化酶含量低，對活性氧誘導(dǎo)的損傷極為敏感[14]。MDA 是氧化應(yīng)激損傷過程中產(chǎn)生的主要產(chǎn)物之一，對精子細(xì)胞有明顯損傷作用，是引起不育常見代謝產(chǎn)物[15]。本研究顯示，H2O2處理后，MDA 明顯升高。與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。RES 加入抑制了H2O2誘導(dǎo)MDA產(chǎn)生，由此可見RES 添加抑制了H2O2誘導(dǎo)ROS 產(chǎn)生。

此外，精子DNA 完整性對于受精及胚胎發(fā)育是十分重要。本研究結(jié)果顯示H2O2處理后，精子DNA 損傷增加。精子DNA 外包被有魚精蛋白，染色質(zhì)狀態(tài)高度致密，過量ROS 可以與DNA 親核基團(tuán)反應(yīng)，導(dǎo)致DNA鏈聚集并改變DNA 正常結(jié)構(gòu)。有研究顯示氧化應(yīng)激造可成精子核結(jié)構(gòu)損傷，破壞DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)，精子DNA碎片化指數(shù)升高[16-17]。本研究顯示RES 加入顯著降低了H2O2誘導(dǎo)精子DNA 損傷升高。這可能與RES 降低氧化應(yīng)激產(chǎn)物水平，避免了活性氧對精子的攻擊有關(guān)。已有研究證實(shí)精液冷凍保護(hù)液中添加RES 可以通過降低精子內(nèi)ROS 水平，減少精子冷凍損傷，從而改善解凍后精子質(zhì)量[18]。亦有研究證實(shí)RES 改善了弱精子癥患者精子活力、精漿鋅含量、精漿硬彈性蛋白酶以及精子頂體酶活性，推測可能與RES 的抗氧化作用有關(guān)[19]。此外，RES 可以減少化療藥物導(dǎo)致的精子氧化應(yīng)激水平增加，能預(yù)防和緩解化療藥物對人精子造成的損傷[20]。

綜上所述，本研究證實(shí)RES 通過抗氧化改善了H2O2誘導(dǎo)的精子損傷。這一作用可能與白藜蘆醇抗氧化作用有關(guān)，其作用機(jī)制也是我們下一步研究的重點(diǎn)。未來研究將進(jìn)一步闡明RES 改善氧化應(yīng)激對精子的損害的機(jī)制和RES 應(yīng)用安全性問題。由于RES 具有多種有益于人類健康的生物藥理活性，使其廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品和食品添加劑等領(lǐng)域。其在腫瘤、心腦血管疾病、炎癥等方面的治療及預(yù)防作用也越來越被人們認(rèn)可，RES 臨床應(yīng)用前景廣闊，有望成為一種男科領(lǐng)域抗氧化的新型藥物。