魯燕，陳永權(quán)

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，安徽 蕪湖 241000)

慢性疼痛定義為“一種不愉快的感覺和情緒上的感受,伴有或潛在的組織損傷”，疼痛如果持續(xù)3～6個(gè)月以上則稱為慢性疼痛,慢性疼痛常伴有心理或精神改變甚至功能障礙，但其具體機(jī)制不明。研究發(fā)現(xiàn)[1]，神經(jīng)病理性疼痛導(dǎo)致海馬突觸結(jié)構(gòu)和功能受損是認(rèn)知障礙的重要病理基礎(chǔ)。而血管內(nèi)皮生長因子C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)在調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞分化、軸突發(fā)育等方面發(fā)揮著重要功能。VEGF-C的主要分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞上，在神經(jīng)損傷大鼠模型中其在大鼠海馬組織中常呈低表達(dá)[2]。

本研究通過大鼠在體實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建慢性疼痛認(rèn)知功能障礙模型，檢測慢性疼痛所致認(rèn)知功能障礙時(shí)大鼠VEGF-C分泌情況，同時(shí)檢測GFAP、Nestin、NeuN的表達(dá)情況。體外干預(yù)星形膠質(zhì)細(xì)胞中VEGF-C的分泌水平，檢測其對共培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的分化以及軸突發(fā)育的影響，同時(shí)檢測共培養(yǎng)體系GFAP、Nestin、NeuN的表達(dá)水平，旨在通過體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)深入闡述VEGF-C在介導(dǎo)慢性疼痛認(rèn)知功能障礙發(fā)生發(fā)展過程中的作用，為慢性疼痛認(rèn)知功能障礙的臨床診斷和治療應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

BCA試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，兔抗GFAP、兔抗Nestin、兔抗NeuN 一抗(均為美國LSBio)，通用型二抗試劑盒(上海博蘊(yùn)生物科技有限公司)，離心機(jī)( JW3021HR，安徽嘉文儀器裝備有限公司)，酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司)，倒置顯微鏡(德國徠卡公司)，電子顯微鏡(日本Hitachi公司)，SM2010R型切片機(jī)(德國徠卡公司)，F(xiàn)ACSVantage SE分選型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，引物由上海桑貢合成生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(中國上海)制作及合成，重組載體和病毒包裝質(zhì)粒購自愛康得生物科技有限公司(中國蘇州)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只8周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量為180～220 g，購自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SLAC)，所有實(shí)驗(yàn)大鼠置于通風(fēng)的動(dòng)物室內(nèi)，保持22 ℃，正常飲水，維持正常的晝夜節(jié)律。該實(shí)驗(yàn)已獲得動(dòng)物倫理審批，審批編號(hào)為20191287。

1.3 大鼠慢性疼痛認(rèn)知功能障礙模型制造

60只大鼠隨機(jī)分為兩組(n=30)：對照組與實(shí)驗(yàn)組。按照Decosterd等[3]的方法，實(shí)驗(yàn)通過手術(shù)暴露大鼠的坐骨神經(jīng)，同時(shí)結(jié)扎脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)，對坐骨神經(jīng)分別進(jìn)行機(jī)械性疼痛刺激、針刺刺激、冷痛覺刺激及熱痛覺刺激，術(shù)后24 h內(nèi)即可出現(xiàn)痛覺超敏反應(yīng)。

1.4 Morris水迷宮測試認(rèn)知功能

采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測定大鼠的空間記憶和學(xué)習(xí)記憶能力，進(jìn)而分析大鼠的認(rèn)知功能。定向航行實(shí)驗(yàn)測量大鼠獲取學(xué)習(xí)記憶的能力。根據(jù)目前國內(nèi)主流的設(shè)計(jì)方法[4]，設(shè)計(jì)特制的水迷宮。大鼠完成定向航行訓(xùn)練后，對實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行相應(yīng)處理干預(yù)?？臻g搜索實(shí)驗(yàn)用于測量學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后，保持對平臺(tái)空間位置記憶的能力。選取大鼠在定位航行術(shù)后1、3、5 d的逃避潛伏期作為學(xué)習(xí)能力監(jiān)測指標(biāo)，并在空間搜索中的術(shù)后第6天穿環(huán)次數(shù)作為空間記憶能力監(jiān)測指標(biāo)。

1.5 ELISA法檢測血清VEGF-C濃度

處死大鼠前用非抗凝真空管取尾靜脈血2 mL。獲取血樣后，采用ELISA法檢測血清VEGF-C濃度。

1.6 蛋白印跡法檢測Nestin、GFAP、NeuN蛋白表達(dá)情況

處死大鼠并取大鼠腦組織，提取組織蛋白，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度定量。將蛋白質(zhì)提取物在樣品中煮沸緩沖液10 min，在10%聚丙烯酰胺上分離凝膠，并轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜。膜用5%牛血清白蛋白，并與稀釋后的Nestin(1∶1000)、GFAP(1∶10 000)、NeuN(1∶1500)一抗孵育。然后膜在 TBST 中洗滌并與相應(yīng)的溫育二抗。GAPDH被用作內(nèi)部參考。使用WB曝光儀檢測膜。評估圖像使用Image J 軟件。

1.7 大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

取對照組大鼠,在無菌條件下斷頭取出腦組織，剪去腦干僅留大腦半球，充分剪碎腦組織,再移入50 mL含胰酶的PBS離心管中,用吸管反復(fù)吹打消化至肉眼觀察無明顯的腦組織團(tuán)塊；加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化,再次反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液,加定量完全培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，并置于5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并在鏡下觀察細(xì)胞的生長和存活情況。通過免疫熒光染色法鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞。

1.8 慢病毒轉(zhuǎn)染干預(yù)VEGF-C分泌水平

本實(shí)驗(yàn)選擇慢病毒過表達(dá)載體pLV-puro以及shRNA干擾載體pEco-Lenti-U6-shRNA-(Puro)，根據(jù)starbase數(shù)據(jù)庫中提供的VEGF-C的核酸序列，利用Primerpremier 5.0設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR得到VEGF-C的DNA序列，引物序列為左:5′-TCAAGGACAGAAGAGACTATAAAATTTGC-3′，右:5′-ACTCCAAACTCC-CCCCACAT-3′，雙酶切構(gòu)建過表達(dá)VEGF-C的過表達(dá)載體，構(gòu)建其shRNA的重組載體，用重組載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。根據(jù)是否轉(zhuǎn)染的重組載體，將細(xì)胞分為過表達(dá)組、敲減組和空載組。

1.9 細(xì)胞增殖成球?qū)嶒?yàn)檢測神經(jīng)干細(xì)胞分化

用細(xì)胞球形成效率(sphere formation efficiency，SFE)表示神經(jīng)干細(xì)胞在合適的條件培養(yǎng)基中自我更新的能力。將共培養(yǎng)的細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)，DMEM培養(yǎng)基，37 ℃孵育2 w后，用0.1%晶體紫的固定染色細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞團(tuán)的個(gè)數(shù)。

1.10 鏡檢軸突發(fā)育

全腦組織或者體外培養(yǎng)細(xì)胞，用鹽水洗凈并固定用2.5%戊二醛溶液。海馬在倒置顯微鏡下切下組織。海馬 CA1區(qū)1 mm 3組織切片用 2.5%戊二醛溶液固定，洗滌用磷酸緩沖鹽水(PBS)，脫水，嵌入，切片并用檸檬酸鉛和乙酸染色。用電子顯微鏡觀察海馬 CA1 區(qū)突觸體周圍的超微結(jié)構(gòu)，突觸體的數(shù)量由物理檢查員進(jìn)行計(jì)數(shù)和分析。

1.11 流式細(xì)胞儀檢測神經(jīng)干細(xì)胞周期

取培養(yǎng)細(xì)胞，用胰蛋白酶消化制備成細(xì)胞懸液，1000 r離心10 min，棄上清液。加入70%乙醇固定液重懸細(xì)胞，固定30 min。再次離心、洗滌后，用RNA酶消化細(xì)胞，用碘化丙錠作為染料，處理細(xì)胞20 min。在流式細(xì)胞儀488 nm激發(fā)波長下測定。觀察并記錄處于分裂期(含S期及G2/M期)的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

1.12 蛋白印跡法檢測Nestin、GFAP、NeuN蛋白表達(dá)情況

裂解并研磨細(xì)胞，提取細(xì)胞中蛋白，余處理同組織WB檢測。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組Morris水迷宮測試結(jié)果

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，逃避潛伏期隨著訓(xùn)練時(shí)間增加而縮短，但對照組和實(shí)驗(yàn)組兩組間逃避潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行處理后，實(shí)驗(yàn)組逃避潛伏期高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

*與對照組比較:*P<0.05

2.2 血清VEGF-C濃度比較

對照組血清VEGF-C值為(48.66±6.54)pg/mL，實(shí)驗(yàn)組為(27.08±2.60) pg/mL，兩者組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.25，P=0.016，0.05)。

2.3 兩組腦組織GFAP、Nestin、NeuN蛋白表達(dá)情況

實(shí)驗(yàn)組GFAP蛋白表達(dá)顯著高于對照組，而Nestin、NeuN表達(dá)量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖2。

圖2 對照組與實(shí)驗(yàn)組GFAP、Nestin、NeuN的WB表達(dá)情況

表1 對照組與實(shí)驗(yàn)組GFAP、Nestin、NeuN表達(dá)量

2.4 細(xì)胞增殖成球?qū)嶒?yàn)及軸突發(fā)育計(jì)數(shù)結(jié)果

3組間SFE及及軸突發(fā)育計(jì)數(shù)兩兩比較，敲減組的SFE及軸突發(fā)育計(jì)數(shù)均低于空載組級(jí)過表達(dá)組，過表達(dá)組SFE及軸突發(fā)育計(jì)數(shù)稍高于空載組，過表達(dá)組處于分裂期細(xì)胞顯著多于其余兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義、見表2。

表2 3組間SFE及軸突發(fā)育計(jì)數(shù)

2.5 3組細(xì)胞GFAP、Nestin、NeuN蛋白表達(dá)情況

3組間GFAP、Nestin、NeuN表達(dá)量兩兩比較，過表達(dá)組Nestin、NeuN表達(dá)量顯著高于空載組，GFAP低于空載組，敲減組Nestin、NeuN表達(dá)量顯著低于空載組，GFAP高于空載組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3、表3。

圖3 3組間GFAP、Nestin、NeuN的WB表達(dá)情況

表3 3組間GFAP、Nestin、NeuN表達(dá)量

3 討 論

一般疼痛持續(xù)3～6個(gè)月或更長時(shí)間被定義為慢性疼痛，慢性疼痛時(shí)，通常伴有持續(xù)性的有害刺激或傷害[5]，慢性疼痛常發(fā)生于創(chuàng)傷性神經(jīng)、脊髓或腦損傷后，也可伴發(fā)于糖尿病、帶狀皰疹后遺神經(jīng)病、多發(fā)性硬化癥、癌癥等疾病[6]。慢性疼痛常會(huì)對患者造成巨大影響，如免疫力下降、異常的應(yīng)激反應(yīng)、食欲減退、引發(fā)失眠、焦慮、抑郁等神經(jīng)精神癥狀，嚴(yán)重時(shí)可致自殺等。同時(shí)，越來越多的臨床證據(jù)也表明，慢性疼痛可能會(huì)導(dǎo)致患者的認(rèn)知功能受到損傷[7]。Moriarty[8]等認(rèn)為，對于慢性疼痛患者，其認(rèn)知會(huì)受到疼痛的負(fù)面影響，包括注意力、學(xué)習(xí)和記憶、信息處理的速度和精神運(yùn)動(dòng)能力、執(zhí)行功能等均會(huì)下降，這種影響將成為日?；顒?dòng)和康復(fù)的主要障礙。但目前，對于慢性疼痛導(dǎo)致患者認(rèn)知功能受損的發(fā)病機(jī)制尚不明了，臨床也缺乏治療手段，因此，積極探索研究其發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)以及闡述其可能介導(dǎo)的分子機(jī)制具有重要的臨床意義。

目前的研究認(rèn)為，慢性疼痛導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的發(fā)生，主要因?yàn)榇竽X中某些區(qū)域受到損傷[9]。同時(shí)，慢性疼痛還會(huì)加速腦部老化[10]，其中大腦左右的海馬體常有受累。海馬體在人的記憶和認(rèn)知等方面起到關(guān)鍵作用，受損后往往很難逆轉(zhuǎn)[11]。一系列研究表明，慢性疼痛引發(fā)的認(rèn)知功能障礙和患者海馬組織的損傷是密切相關(guān)的，包括學(xué)習(xí)障礙和記憶障礙[12]，多項(xiàng)臨床研究數(shù)據(jù)顯示慢性疼痛患者的海馬結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了變化[13]。神經(jīng)損傷大鼠模型的海馬體神經(jīng)元減突觸可塑性降低，而后者是海馬體發(fā)揮學(xué)習(xí)和記憶功能的基礎(chǔ)[14-15]，海馬區(qū)星型膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量減少可能會(huì)影響神經(jīng)元的功能，進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。

血管內(nèi)皮生長因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)是血管內(nèi)皮生長因子家族中的一員，在血管生成、淋巴管生成、內(nèi)皮細(xì)胞生長和存活等方面具有活性，并能影響血管通透性[16-17]。此外，VEGF-C在調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞分化、軸突發(fā)育等方面也發(fā)揮著重要功能。Heinolainen等[18]發(fā)現(xiàn)VEGF-C結(jié)合受體VEGFR3后可以激活靜止NSCs進(jìn)入細(xì)胞周期，并產(chǎn) 生祖細(xì)胞，并介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)AKT和ERK通路的激活，調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖。Cho等[19]發(fā)現(xiàn)VEGF-C的缺失對非洲爪蟾和小鼠胚胎大腦中的神經(jīng)發(fā)育起損害作用，并且NSCs內(nèi)VEGF-3的條件缺失將影響成年小鼠腦室下區(qū)(subventricular zone，SVZ)中的神經(jīng)發(fā)生。在這一基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了VEGF-C對于神經(jīng)干細(xì)胞的分化以及軸突發(fā)育的影響，以及慢性疼痛引發(fā)的認(rèn)知功能障礙過程中，大鼠體內(nèi)VEGF-C的分泌水平。并且通過Western Blot定性與定量檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白GFAP以及神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白Nestin、NeuN的表達(dá)水平，旨在揭示VEGF-C的水平與神經(jīng)干細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞活性水平的關(guān)系。

本研究的結(jié)果顯示，在動(dòng)物模型上，Morris水迷宮測試顯示慢性疼痛模型的大鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，說明模型構(gòu)筑成功，同時(shí)，慢性疼痛實(shí)驗(yàn)組的血清VEGF-C表達(dá)較對照組降低，這可能是海馬體星形膠質(zhì)細(xì)胞受損導(dǎo)致VEGF-C胞外分泌減少，腦組織蛋白定量也顯示，慢性疼痛實(shí)驗(yàn)組的GFAP蛋白表達(dá)升高、Nestin、NeuN的蛋白表達(dá)較實(shí)驗(yàn)組降低，說明慢性疼痛不僅影響星形膠質(zhì)細(xì)胞，對神經(jīng)干細(xì)胞也有損傷作用。本實(shí)驗(yàn)在離體細(xì)胞模型上進(jìn)一步驗(yàn)證VEGF-C的作用機(jī)制。分別設(shè)計(jì)VEGF-C的 shRNA以及過表達(dá)載體，通過慢病毒轉(zhuǎn)染原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，敲減和過表達(dá)VEGF-C，并與原代神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，分別從上調(diào)和下調(diào)兩方面，對VEGF-C的細(xì)胞內(nèi)外水平變化以及下游調(diào)控通路進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VEGF-C敲減后，神經(jīng)干細(xì)胞的分化和軸突發(fā)育均受到影響，GFAP、Nestin、NeuN等特異性標(biāo)志蛋白的表達(dá)大大下降，說明VEGF-C的下調(diào)對星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞皆有負(fù)面作用，這可能是慢性疼痛引發(fā)的認(rèn)知功能障礙的基礎(chǔ)。但本研究仍無法證實(shí)是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化引起VEGF-C的下調(diào)還是VEGF-C下調(diào)使得星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，同時(shí)，是否有其他類型VEGF分子機(jī)制參與這一過程，可能需要生物信息學(xué)分析以及進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。