李 梨

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 重慶 400010)

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一種來源于中胚層的、早期未分化的細胞，廣泛地分布于人體各個細胞組織中，可實現(xiàn)自我復(fù)制、自我更新和無限增殖，還具有實現(xiàn)多向細胞分化的巨大潛能[1]。MSCs可通過分泌細胞因子等方式來調(diào)節(jié)細胞凋亡、促進干細胞增殖和調(diào)節(jié)免疫，進而實現(xiàn)組織器官修復(fù)。先前的研究表明，間充質(zhì)干細胞對血液系統(tǒng)疾病、血管性疾病、糖尿病、自身免疫性疾病、退行性疾病、腫瘤性疾病、移植物抗宿主病的治療具有潛在價值[2][3][4]。

外泌體（exosomes）是一種圓形或橢圓形的膜性囊泡結(jié)構(gòu)，直徑約為30～150nm，富含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)/多肽、mRNA、microRNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA以及完整的細胞器等多種成分[5]。外泌體廣泛存在于人體尿液、血漿、唾液、母乳、腦脊液、羊水、腹腔積液等多種不同體液中，由造血/非造血細胞產(chǎn)生和釋放，包括血小板、網(wǎng)織紅細胞、淋巴細胞、肥大細胞、胃腸黏膜上皮的白細胞、樹突狀上皮細胞、腫瘤細胞、神經(jīng)系統(tǒng)免疫細胞等[6]。外泌體包括9769種來源蛋白質(zhì)，3408種mrnas及838種microrna(mirnas/mirs)[7]，參與了機體中許多重要的生理生化過程，在細胞通信、遷移、血管新生、自身免疫反應(yīng)及惡性腫瘤細胞的生長中都起著重要作用[8][9]。

間充質(zhì)干細胞源性外泌體（MSCs-exo）與MSCs的功能相似，具有修復(fù)組織、組織再生、抑制炎癥反應(yīng)及調(diào)節(jié)免疫等功能，可用于治療心臟、腎臟、肝臟、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)疾病[5][10][11]。不同組織來源的MSCs-exo具有不同的作用，骨髓間充質(zhì)干細胞源性外泌體可應(yīng)用于減輕心肌缺血、抑制肝臟分化、抗腫瘤、促進皮膚愈合、促進受損腎神經(jīng)的修復(fù)等多種疾病的動物模型[10]。人臍帶間充質(zhì)干細胞源性外泌體可以表達外泌體標(biāo)志性蛋白CD9及CD63，能夠通過上調(diào)Treg和下調(diào)Th17參與自身免疫功能調(diào)節(jié)[12][13]。

肝臟被認為是我們身體最大的以其代謝和消化功能活動為主的一種實質(zhì)性器官,具有儲存肝糖、生物轉(zhuǎn)化、合成分泌性蛋白、合成凝血因子、內(nèi)分泌及免疫調(diào)節(jié)等功能。急性肝衰竭、肝硬化甚至肝癌等急慢性肝臟疾病嚴重影響人們的生命健康，提高肝臟在受傷后的修復(fù)能力是近年來研究的熱門話題。本文將對間充質(zhì)干細胞源性外泌體對肝臟病變的影響進行綜述。

一、間充質(zhì)干細胞源性外泌體與急性肝損傷

急性肝衰竭（ALF）是一種死亡率極高的疾病，其特征表現(xiàn)是“炎癥因子風(fēng)暴”，通過TNF-α、IL-1和IL-6等促炎因子的釋放，從而引起全身炎癥反應(yīng)，最終引起多器官功能衰竭[14]。受損的細胞可產(chǎn)生多種炎性刺激物，導(dǎo)致caspase-1激活，活化的caspase-1剪切并激活pro-IL-1b，最終導(dǎo)致蛋白水解活化；此外，肝細胞損傷后，促凋亡蛋白Bax和caspase3表達上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調(diào)[15][16]。Zhao, Liu等[17]通過建立一個D-半乳糖胺和脂多糖（D-GalN/LPS）誘導(dǎo)的肝細胞損傷和凋亡的模型，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過BMSC-Exos處理后，Bax和caspase-3的表達水平顯著降低，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平明顯上調(diào)。但是，當(dāng)存在自噬抑制劑3MA時，BMSC-Exos對細胞凋亡的抑制作用會發(fā)生比較明顯的逆轉(zhuǎn)。結(jié)果表明，BMSC-Exos可以誘導(dǎo)自噬，并通過介導(dǎo)自噬保護肝細胞免受各種應(yīng)激損傷。另一項研究使用LPS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠作為ALF的模型[12]。在LPS/D-GalN模型中，D-GalN具有肝毒性作用，而LPS通常與Toll樣受體4（TLR4）/CD14復(fù)合物結(jié)合，從而誘導(dǎo)炎性細胞因子的表達，引起大量巨噬細胞的浸潤。結(jié)果顯示hUC MSC-Exos降低了LPS刺激的RAW264.7巨噬細胞中NLRP3、caspase-1、IL-1b和IL-6的表達。由此得出hUC MSC-Exos可降低NLRP3炎癥小體的過度活化，在急性肝衰竭小鼠模型中起保護作用。Shao, Xu等[18]通過使用IL-6刺激hUC-MSCs，并對hUC-MSC來源的外泌體進行深度測序，確定miR-455-3p在IL-6刺激下由hUC MSC-Exos分泌產(chǎn)生，通過靶向PIK3r1抑制巨噬細胞釋放IL-6和其他炎癥因子。在化學(xué)性肝損傷小鼠模型中，miR-455-3p的高表達可減輕巨噬細胞浸潤和局部肝損傷，降低血清炎癥因子水平，從而改善肝臟組織病理損傷。有研究者通過醋氨酚（APAP）和過氧化氫（H2O2）體外誘導(dǎo)肝損傷[19]。APAP主要通過生成N-乙酰基-p-苯并喹非亞胺（NAPKI）并與肝蛋白的結(jié)合來介導(dǎo)肝損傷，而H2O2僅通過氧化應(yīng)激途徑誘發(fā)肝損傷。兩者均可引起線粒體功能障礙，最終導(dǎo)致細胞凋亡。在兩種損傷模型中，外泌體治療組的細胞活力顯著提高。結(jié)果表明，在肝再生過程中，啟動期基因的上調(diào)可導(dǎo)致外泌體中增殖蛋白，如PCNA和cyclind1的高表達。此外，外泌體還可通過上調(diào)Bcl-xL蛋白抑制APAP-和H2O2誘導(dǎo)的肝細胞凋亡，但是外泌體不能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激減輕肝細胞損傷。

二、間充質(zhì)干細胞源性外泌體與自身免疫性肝炎

自身免疫性肝炎是由自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的肝臟炎癥性疾病，其確切病理生理機制尚不明確，相關(guān)研究表明，多種間充質(zhì)干細胞源性外泌體含有TGF-β1、IL-6、IL-10和肝細胞生長因子（HGF）等細胞因子和生長因子，有助于免疫調(diào)節(jié)[20]。其中，IL-6可以促進幼稚T淋巴細胞分化為Th17細胞，分泌IL-17，促進AIH的發(fā)展。IL-1β可以將人Treg細胞轉(zhuǎn)化為Th17細胞，Treg細胞可分泌IL-10，以維持肝臟免疫平衡和IL-10的耐受性[21]。miRNA-223-3p是PBMC和BMSC中高表達的miRNA，可調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因STAT3的表達，該基因是IL-1β和IL-6的重要上游激活因子，Treg和Th17細胞及其分泌的IL-10和IL17在AIH模型中增加。此外，STAT3還可激活RORT并促進Th17細胞中IL-17的分泌，在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。hUC MSC-Exos可作為載體將micro-RNA傳遞到細胞中，調(diào)節(jié)肝臟中IL-1β和IL-6的表達。Lu等[22]通過改變肝臟S100/CFA-小鼠脾臟中Treg和Th17細胞的比例，發(fā)現(xiàn)攜帶miRNA-223-3p的間充質(zhì)干細胞源性外泌體顯著提高了Treg/Th17的降低比率。其機制與miRNA-223-3p介導(dǎo)的對STAT3基因和炎性細胞因子（IL-1β和IL-6）表達的調(diào)節(jié)以及Treg/Th17比值的升高有關(guān)。其中，NLRP3屬于炎性復(fù)合體的傳感蛋白，異常NLRP3激活可能參與了自身免疫性疾病的進展。caspase-1可分泌促炎細胞因子，并誘導(dǎo)細胞焦亡，通過激活caspase-1，然后分泌IL-1β對內(nèi)源性或外源性危險信號做出應(yīng)答。Chen等[23]采用肝抗原S100建立小鼠自身免疫性肝炎模型，用LPS和ATP建立肝細胞細胞損傷模型，采用超速離心法分離骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體，通過血清ALT和AST的水平以及肝組織學(xué)來評估肝損傷，用炎癥性細胞因子和乳酸酶脫氫酶分別檢測炎癥和細胞死亡。研究表明間，充質(zhì)干細胞源性外泌體可通過miRNA-233途徑來調(diào)控炎癥小體NLRP3及caspase-1，通過與其3’-UTR結(jié)合抑制NLRP3的激活，導(dǎo)致NLRP3 mRNA降解，從而抑制肝臟炎癥和細胞死亡。

三、間充質(zhì)干細胞源性外泌體與肝纖維化/肝硬化

肝星狀細胞（HSCs）通過細胞因子和生長因子的調(diào)節(jié)激活，導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生。細胞外基質(zhì)在增殖的HSCs協(xié)助下通過分泌膠原形成纖維瘢痕組織，但如果不適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)，則可導(dǎo)致肝硬化。損傷的上皮細胞釋放的外泌體可促進a-SMA表達、F-actin表達、成纖維細胞增殖和Ⅰ型膠原的產(chǎn)生，成纖維細胞的活化依賴于外泌體中TGF-b1 mRNA的傳遞。TGF-β1在STAT3激活的HSCs中才具有促纖維化細胞因子和凋亡特性，此外，STAT3還可介導(dǎo)Bcl-2的轉(zhuǎn)錄。通過建立HST-T6或CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型，發(fā)現(xiàn)miR-181-5p可通過修飾STAT3和Bcl-2的3’UTR，減弱STAT3和Bcl-2基因的表達，同時通過下調(diào)STAT3通路介導(dǎo)TGF-β1信號傳導(dǎo)，減輕肝組織纖維化程度[24][25]。Li[13]等研究者用四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝臟纖維化，通過肝臟內(nèi)直接注射人臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體，發(fā)現(xiàn)hucMSC-Ex移植到小鼠纖維化肝臟后血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性增加，而Ⅰ型和Ⅲ型膠原降低，并通過作用于TGF-β1和磷酸化Smad2在體內(nèi)的表達，促進肝細胞損傷的恢復(fù)。另一項研究建立了CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，注射hBM-MSCs-Ex治療4周[26]。研究結(jié)果表明，體內(nèi)注射hBM-MSCs-Ex可通過減少膠原蛋白沉積，增強肝功能，抑制炎癥和促進肝細胞再生減輕肝纖維化。此外，該實驗還發(fā)現(xiàn)，hBM-MSCs-Ex在體內(nèi)和體外實驗中均抑制Wnt/β-catenin通路，α-SMA和CollagenⅠ的表達。

四、間充質(zhì)干細胞源性外泌體與肝癌

肝癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的第四大常見原因，其發(fā)病機理及治療的研究一直是肝癌研究的重點。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，AMSC-Exo-199a具有典型的外泌體特性，可通過抑制其靶基因YAP1、CD151和mTOR的表達，導(dǎo)致細胞增殖、侵襲和遷移減少，從而增強阿霉素的敏感性。此外，靜脈注射AMSC-Exo-199a可顯著增強Dox在體內(nèi)抗HCC的作用。除mTOR外，HK2、PKM2、PAK4等MiR-199a-3p介導(dǎo)的基因調(diào)控也被證明與肝癌有關(guān)[27]。另一項研究評估了來源于骨髓間充質(zhì)干細胞和肝間充質(zhì)干細胞的外泌體對二乙基亞硝胺（DEN）誘導(dǎo)的大鼠肝癌進展的潛在影響及其相關(guān)機制[28]。CSCs源性外泌體組小鼠的肝臟相對重量和血清腫瘤標(biāo)志物和肝酶水平、HCC標(biāo)志物、免疫染色強度、腫瘤的數(shù)量和面積均顯著增加。表明CSCs源性外泌體具有顯著的誘導(dǎo)腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成的能力，可導(dǎo)致顯著的腫瘤生長和進展。此外，CSCs外泌體增加了Bcl2、TGFβ1、NFκB、MMP9和VEGF基因的表達；增加了TGF-β1、P13K和ERK蛋白的表達；增加了PCNA的免疫染色；增加了血清TGF-β1的水平，但降低了Bax、p53和timp1 mRNA的水平。

五、間充質(zhì)干細胞源性外泌體與其他肝臟疾病

大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查和臨床資料研究結(jié)果表明，酒精性肝病患者住院人數(shù)占同期全國肝病患者的比例逐年上升。研究顯示，活性氧（ROS）在酒精性肝病的進展中發(fā)揮重要作用。ROS可激活NLRP3-caspase-1信號通路，介導(dǎo)相關(guān)促炎細胞因子（如IL-1β）釋放[29]。此外，Treg/Th17比例的失衡也參與ALD的發(fā)生、發(fā)展。jin等[30]通過建立一個酒精性肝損害小鼠模型，分離提取間充質(zhì)干細胞源性外泌體，在ald小鼠中進行MSCs-exo植入，最終發(fā)現(xiàn)MSCs-exo能夠減輕由于乙醇引起的肝損害和脂質(zhì)沉淀。具體的作用機制可能是通過調(diào)節(jié)Nrf-2/HO-1和NLRP3-caspase-1-IL-1β通路、恢復(fù)Treg和TH17細胞的比例平衡，最終降低肝內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥水平。

六、總結(jié)與展望

本文通過分析間充質(zhì)干細胞源性外泌體在自身免疫型肝炎、急性肝衰竭、肝硬化、肝癌等疾病中的功能與作用機制并做出簡要的總結(jié)，為肝臟疾病的診斷和新藥的研發(fā)工作提供了一種嶄新的方法與思路。但目前的研究僅建立在小鼠模型的基礎(chǔ)上，MSCs-exo用于治療靈長類動物的效果仍然還有待考量，且關(guān)于MSCs-exo仍存在一些健康安全問題，但它在急慢性肝臟疾病的治療上仍然具備很大的潛力，將MSCs-exo廣泛地應(yīng)用到肝臟疾病的臨床診斷和治療、改善疾病的預(yù)后等，都是我們目前研究工作中的重點，具有十分重要的意義。