黃 會 曾玉蘭 廖珍慧 施玉琴 黃 露 周月泉

（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院，武漢 430077）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是呼吸系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病，40歲以上人群COPD的患病率達到13.7%[1]，在吸煙人群中也有約24%患有此病[2]。研究證實，香煙煙霧可以導(dǎo)致機體肺組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[3]。煙霧暴露可通過炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血管活性物質(zhì)調(diào)節(jié)細胞內(nèi)免疫應(yīng)答通路引起肺血管平滑肌細胞增殖，導(dǎo)致管壁增厚，管腔狹窄，血管管腔纖維化或完全閉塞[4]。肺微血管內(nèi)皮細胞（pulmonary microvascular endothelial cell，PMVEC）在肺損傷過程中較為活躍，介導(dǎo)疾病發(fā)生發(fā)展。生理條件下，它們依靠其正常的增殖和凋亡平衡維持著細胞數(shù)量的穩(wěn)定和血管功能正常[5]。研究表明，細胞抗凋亡因子B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和細胞核因子-κB（nuclear factor-κB，NFκB）在PMVEC 中均有表達，可能介導(dǎo)COPD[6]。紅景天苷是中草藥紅景天的一種提取物[7]，具有較強的抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗衰老、抗COPD 及抗缺氧等特性[8-9]。然而紅景天苷能否調(diào)節(jié)煙霧暴露大鼠PMVEC 活性及對PMVEC 的調(diào)控作用機制尚不清楚。因此本研究探究紅景天苷對煙霧暴露大鼠PMVEC 活性及NF-κB/Bcl-2 表達水平的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑

選擇50 只健康成年SD 大鼠，CV 級，雌雄不限，體質(zhì)量250～350 g，均由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供，常溫飼養(yǎng)。

散花牌過濾嘴香煙由河南中煙工業(yè)有限公司生產(chǎn)，每支焦油含量為13 mg，尼古丁含量為1.0 mg，CO 含量為14 mg；紅景天苷由上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)；多聚甲醛購自上海蕓強化工有限公司；Bcl-2 兔抗、NF-κB 兔抗和DAB 顯色試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 動物分組與模型建立

50 只大鼠隨機分為空白組，煙霧組，紅景天苷低、中、高劑量組。制備大鼠被動吸煙裝置，煙熏箱大小為115 cm×65 cm×50 cm，每側(cè)各留9 個直徑2.5 cm 的通氣孔。被動吸煙實驗中，10 支香煙捆扎為一組后點燃，并置于煙熏箱中的支架上。用測氧儀對煙熏箱中氧氣的濃度進行監(jiān)測，根據(jù)測得的結(jié)果對箱中的通氣孔數(shù)量進行適當調(diào)節(jié)，使箱中氧氣濃度盡量保持在20%。所有大鼠每天吸煙2次，每次吸煙間隔4 h，制備COPD 大鼠模型?？瞻捉M大鼠不做任何處理，常規(guī)飼養(yǎng)；煙霧組大鼠分別置于煙熏箱內(nèi)，在4 周內(nèi)每天吸煙2 次，每次吸煙10 支，每次30 min，中間間隔4 h；紅景天苷低、中、高劑量組大鼠在煙霧吸入基礎(chǔ)上分別給予50、100 mg/kg 和200 mg/kg 的紅景天苷，均腹腔注射；空白組和煙霧組大鼠同期給予同等容積的滅菌注射用生理鹽水經(jīng)腹腔注射。所有大鼠共干預(yù)16 周，每周干預(yù)6 d，每天1 次。

1.3 標本采集

麻醉所有大鼠后處死，打開大鼠的胸腔，把大鼠的右主支氣管進行結(jié)扎，將右肺快速取出，分離出右肺動脈，將取出的右肺保存在-80℃?zhèn)溆谩Ｗ蠓斡?%多聚甲醛經(jīng)氣管充分灌注直至胸膜平整，結(jié)扎左主支氣管后剪下，放入4%的中性甲醛固定液中，用于H-E 染色。

1.4 肺組織H-E 染色及病理學(xué)觀察

給藥結(jié)束后第3 天打開大鼠胸腔，夾閉右主支氣管，經(jīng)氣管插管處以25 cm 汞柱的灌注壓力向左主支氣管內(nèi)灌注4%多聚甲醛，近心端縫線結(jié)扎離斷肺后浸于4%多聚甲醛48 h，之后梯度脫水、二甲苯透明，石蠟包埋。以5 μm 厚度切片，脫蠟，梯度水化，后行H-E 染色，二甲苯透明后中性樹膠封片。高倍顯微鏡下用軟件測量平均肺泡間隔、平均肺泡數(shù)，評估造模是否成功。

1.5 免疫印跡檢測NF-κB 和Bcl-2 蛋白表達

分別提取4 組大鼠肺組織100 mg，將組織裂解，提取蛋白，測量蛋白濃度，分裝后保存在-20℃冰箱。將蛋白溶液與緩沖溶液按4∶1 比例混勻，后煮沸、變性。在電泳板內(nèi)分別注入50 μmol/L 的蛋白樣品，把電泳后的樣品轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，加入脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗后TTBS 漂洗10 min×3 次，加入二抗常溫1 h。取出PVDF 膜，TTBS 漂洗10 min×3 次，DAB 顯色后數(shù)碼相機照相。

1.6 PMVEC 原代培養(yǎng)和鑒定

1.6.1 PMVEC 原代培養(yǎng) 麻醉大鼠，消毒后分離大鼠皮膚和肌肉組織，打開胸腔，暴露心肺，用夾子夾閉腔靜脈，放出血液后把肺循環(huán)灌洗干凈，再取出肺葉，放置在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分離剔除臟層胸膜，剪下1 mm×1 mm×1 mm 大小的組織塊均勻貼在培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶中留有適量的培養(yǎng)液，把培養(yǎng)瓶倒置在恒溫箱中進行孵育，4 h 后將瓶歸位，以確保培養(yǎng)液和組織塊恰好接觸。60 h 后觀察細胞從組織塊的游出情況，而后把組織塊移除，再加入培養(yǎng)液。當細胞融合達到80%～90%時，胰蛋白酶消化傳代。

1.6.2 PMVEC 鑒定 在顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)改變，用相機進行拍照。取2 代細胞消化后用懸浮液接種于專用的蓋玻片上，培養(yǎng)48 h 后進行鑒定：多聚甲醛固定細胞后，加入CD34 多克隆抗體，4℃孵育過夜，DAPI 染色5 min，PBS 溶液終止染色；25 μg/mL BSI 加入到細胞中，避光1 h，抗熒光淬滅劑對細胞進行封片。

1.7 MTT 法檢測PMVEC 代謝活性

取對數(shù)期生長的PMVEC，用胰酶消化成細胞懸液，將其種植于96 孔板中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 h 后，棄去培養(yǎng)液，PBS 清洗3 遍，換內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基（endothelial cell medium，ECM）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察細胞生長狀態(tài)良好，再換條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。根據(jù)實驗要求將PMVEC 分別培養(yǎng)24 h及48 h。于實驗終止4 h 前避光條件下加入濃度為5 mg/mL 的MTT 溶液，每孔 20 μL，然后置入培養(yǎng)箱中孵育至實驗終止。取出細胞，吸去上清，每孔加入150 μL 的DMSO，溶解藍色結(jié)晶，待結(jié)晶溶解后上機檢測。

1.8 流式細胞儀檢測PMVEC 凋亡率

將PMVEC 用0.25%胰酶消化制成密度為1×105/mL 的細胞液，PBS 沖洗2 次，換用ECM 培 養(yǎng)24 h 后移至離心管中，加入400 μL 1×Binding Buffer 緩沖液、5 μL 的Annexin V-FITC輕輕混勻后避光孵育15 min，加入10 μL 的碘化丙啶（PI），輕輕混勻后冰浴5 min，在30 min 內(nèi)上流式細胞儀檢測。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS19.0 軟件進行分析。計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗，多組計量數(shù)據(jù)比較采用單因素分析法檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織病理形態(tài)

空白組大鼠支氣管、肺組織結(jié)構(gòu)清晰、正常，可見完整的支氣管黏膜上皮和大小均勻的肺泡（圖1A）；煙霧組大鼠可見支氣管壁和肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，支氣管管腔結(jié)構(gòu)變窄，可見炎癥細胞浸潤、黏性液分泌物，肺泡腔變大、壁??；肺泡間隔變窄或中斷，還可見肺大泡（圖1B）；低、中、高劑量組的肺組織出現(xiàn)明顯改善，且紅景天苷高劑量組肺組織改善最為明顯（圖1C～1E）。

圖1 各組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)。

2.2 大鼠肺泡數(shù)和肺泡間隔

和空白組比較，煙霧組大鼠肺泡數(shù)顯著降低，肺泡間隔明顯升高（P<0.05）；和模型組比較，紅景天苷低、中、高劑量組大鼠肺泡數(shù)均顯著升高，肺泡間隔均顯著降低，其中高劑量組變化最為顯著（P<0.05）（表1）。

表1 各組大鼠肺泡數(shù)和肺泡間隔比較（n=10，±s）

表1 各組大鼠肺泡數(shù)和肺泡間隔比較（n=10，±s）

*P<0.05 vs 空白組；△P<0.05 vs 煙霧組；#P<0.05 vs 低劑量組；□P<0.05 vs 中劑量組

組別 肺泡數(shù)（個/mm2） 肺泡間隔（μm）空白組 534.7±100.1 36.7±6.2煙霧組 318.4±41.2* 55.2±10.1*低劑量組 421.6±63.7*△ 50.4±8.5*△中劑量組 468.9±75.3*△# 46.3±7.6*△#高劑量組 500.4±83.6*△#□ 39.8±6.9*△#□

2.3 大鼠NF-κB 和Bcl-2 蛋白表達

和空白組比較，煙霧組大鼠肺組織NF-κB 蛋白表達顯著升高，Bcl-2 蛋白表達明顯降低（P<0.01）；和煙霧組比較，紅景天苷低劑量組和高劑量組肺組織NF-κB 蛋白表達顯著降低，Bcl-2 蛋白表達顯著升高，且紅景天苷高劑量組的變化最為顯著（P<0.01）（圖2）。

圖2 各組大鼠NF-κB 和Bcl-2 蛋白表達比較。

2.4 大鼠原代PMVEC 的生長情況

60 h 后，可觀察到細胞從肺組織塊的邊緣游出（圖3A）；5～7 d 后可見細胞長成單層，呈鋪路石樣排列，形態(tài)為多角形或短梭型，且細胞大小均勻（圖3B）。

2.5 PMVEC 免疫細胞化學(xué)鑒定

熒光顯微鏡下觀察到PMVEC 細胞質(zhì)內(nèi)綠色熒光顆粒，CD34 陽性表達，證實培養(yǎng)的細胞為血管內(nèi)皮細胞。與FITC 標記的植物凝集素BSI 的陽性結(jié)合，證實該細胞為微血管內(nèi)皮細胞（圖3C）。

圖3 組織貼塊法培養(yǎng)大鼠PMVEC。

2.6 大鼠PMVEC 活性

和空白組比較，煙霧組大鼠24 h 和48 h 的PMVEC 活性明顯降低（P<0.01）；和煙霧組比較，紅景天苷低、中、高劑量組大鼠的PMVEC 活性顯著提升（P<0.01），且高劑量組大鼠PMVEC 活性明顯高于低劑量組和中劑量組（P<0.05）（表2）。

表2 各組大鼠PMVEC 活性比較（n=10，±s）

表2 各組大鼠PMVEC 活性比較（n=10，±s）

*P<0.05 vs 空白組；△P<0.05 vs 煙霧組；#P<0.05 vs 紅景天苷低劑量組；□P<0.05 vs 紅景天苷中劑量組

組別 24 h 48 h空白組 1.01±0.11 1.52±0.22煙霧組 0.55±0.06* 0.37±0.05*紅景天苷低劑量組 0.77±0.17*△ 0.96±0.19*△紅景天苷中劑量組 0.83±0.18*△# 1.11±0.20*△#紅景天苷高劑量組 0.95±0.19*△□# 1.22±0.21*△□#

2.7 大鼠PMVEC 的凋亡率

和空白組比較，煙霧組PMVEC 凋亡率顯著增加（P<0.01），紅景天苷低、中、高劑量組PMVEC凋亡率顯著降低，且隨著紅景天苷劑量的增加，凋亡率降低更為顯著（P<0.01）（圖4、5）。

圖4 流式細胞儀檢測PMVEC 凋亡率散點圖。

圖5 大鼠PMVEC 細胞凋亡率比較

3 討論

既往研究證明，長期吸煙可導(dǎo)致COPD 的發(fā)生[10]。香煙煙草中所含有的化學(xué)成分極其復(fù)雜，煙草在燃燒的過程中釋放出煙霧，煙霧中的多種物質(zhì)會導(dǎo)致炎癥和癌癥的發(fā)生，對機體的各個器官造成嚴重的損傷[11]。PMVEC 以緊密連接方式像地毯一樣覆蓋在肺血管腔表面，直接與血液接觸，是構(gòu)成“氣血屏障”的基本結(jié)構(gòu)，在生理和病理情況下都發(fā)揮著重要的作用[12]。PMVEC 及其緊密連接的蛋白對維持血管內(nèi)壁完整性、調(diào)節(jié)血管通透性、防止凝血和血栓形成等起重要作用。PMVEC 的形態(tài)、功能和大血管起源的內(nèi)皮細胞有很大不同，因此本研究體外培養(yǎng)煙霧暴露大鼠PMVEC，觀察紅景天苷對其細胞活性以及大鼠肺組織NF-κB 和Bcl-2 蛋白表達水平的影響。

煙霧所致肺氣腫模型類似于人的小葉中心型肺氣腫，這是香煙煙霧相關(guān)性 COPD 最常見的病理類型。本研究用不同劑量的紅景天苷干預(yù)煙霧暴露大鼠，顯示干預(yù)后大鼠的肺組織病理學(xué)形態(tài)得到明顯改善。紅景天是景天科紅景天屬草本或亞灌木植物，主要生長在高海拔的喜馬拉雅山區(qū)、亞洲西部和北美洲等高寒地帶，具有頑強的生命力和耐低氧等特性，被譽為“高原人參”?！侗静菥V目》記載紅景天具有“去邪惡氣，補諸不足”的功效，大量研究證明紅景天苷具有保護神經(jīng)元、肺組織等多種生物活性。張卓一等[13]研究顯示，紅景天苷可有效改善百草枯中毒大鼠的肺組織形態(tài)，其作用機制可能與調(diào)控Toll 樣受體4 和NF-κB 的表達有關(guān)。本研究結(jié)果與上述報道一致。

紅景天苷可以有效抗擊抑郁和焦慮，并且對衰老、疲勞和氧化等都有一定的拮抗作用[14-15]。本研究采用常用的組織貼塊法培養(yǎng)出大鼠PMVEC，實驗結(jié)果顯示紅景天苷能有效提高PMVEC 活性，同時抑制PMVEC 凋亡率。鄭明昱等[16]報道，模型組肺組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1） mRNA 和蛋白表達水平與對照組相比顯著增高，而紅景天苷組肺組織中TGF-β1 mRNA 和蛋白表達顯著低于模型組，推測紅景天苷對平滑肌增殖、氣道上皮增生的抑制作用可能是通過下調(diào)TGF-β1 的表達而實現(xiàn)?？荡貉嗟萚17]研究表明，紅景天苷可抑制模擬微重力誘導(dǎo)的PMVEC 凋亡，其機制可能是影響了PI3K/Akt 通路。Bcl-2 家族在細胞內(nèi)的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要的作用，是重要的抗凋亡分子[18]。NF-κB 是Rel 蛋白家族的成員之一，廣泛存在于各種細胞中，為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，與免疫應(yīng)答，細胞增殖、生長及分化，細胞存活及凋亡均有密切關(guān)系[19]。有研究證實吸煙可以使肺組織NF-κB 的表達增強，本實驗結(jié)果也顯示煙霧組大鼠肺組織NF-κB 表達顯著增加，Bcl-2 的表達明顯降低；干預(yù)后的紅景天苷低劑量和高劑量組大鼠NF-κB 表達均得到了顯著抑制，明顯增加了Bcl-2 的表達，但紅景天苷高劑量組的蛋白表達改善最為明顯。Recio 等[20]研究表明，紅景天苷能夠改善COPD 可能 與MAPK/NF-κB 通路相關(guān)。Chen 等[21]研究證實，紅景天苷通過激活Nrf2 抗氧化信號通路及抑制NF-κB 和TGF-β1、Smad2/Smad3 通路發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗纖維化效應(yīng)。

綜上所述，紅景天苷可抑制煙霧暴露大鼠PMVEC 凋亡，其作用機制可能與抑制NF-κB 的活性、促進Bcl-2 表達有關(guān)。