康助習(xí) 匡 黎 郭 俊 權(quán)瑞泉 魏 英

（國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院，1 腫瘤科，2 實(shí)驗(yàn)中心，十堰 442000）

大約有八成的肝癌患者體內(nèi)的癌細(xì)胞已擴(kuò)散至全身各器官組織中，因而無(wú)法通過(guò)手術(shù)進(jìn)行根治[1-3]。同時(shí)，術(shù)后患者容易出現(xiàn)肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，效果欠佳。目前對(duì)肝癌發(fā)病的分子機(jī)制仍然不清楚，有專家推測(cè)是多種原因共同導(dǎo)致[4-5]。大量研究表明，通過(guò)對(duì)肝癌分子發(fā)病機(jī)制的研究，進(jìn)一步掌握與肝癌密切相關(guān)的信號(hào)通路來(lái)確定針對(duì)性的靶向性治療方案，對(duì)于阻止患者病情惡化、增加肝癌患者存活率具有重大意義，因此尋找抗肝癌的新靶點(diǎn)刻不容緩。有研究顯示[6-7]通過(guò)干預(yù)癌細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在一定程度上可以控制病情進(jìn)展。Hedgehog（Hh）信號(hào)通路在研究中被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的發(fā)生存在密切關(guān)系[8-10]。而miRNA-132 則被證實(shí)在多種人類腫瘤（如乳腺癌、肝癌等）中檢驗(yàn)結(jié)果含量均較低，顯示其具有抑癌基因的作用[11]。但是miRNA-132對(duì)Hh 信號(hào)作用的相關(guān)研究較少，目前尚不清楚。本研究以人肝癌HepG2 細(xì)胞為研究對(duì)象，探討miRNA-132 通過(guò)Hh 信號(hào)通路對(duì)HepG2 細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源及分組

將在ATCC細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買的人肝癌HepG2細(xì)胞分為空白組（無(wú)轉(zhuǎn)染HepG2）、NC組（HepG2轉(zhuǎn)染miR-132-NC）、YJ組（HepG2轉(zhuǎn)染miR-132 mimics）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

電泳儀、PCR 儀（北京由萊普特科學(xué)儀器）；流式細(xì)胞儀（北京德利卡生物技術(shù)）；miR-132 mimics，miR-132-NC（上海生工）；Transwell小室（北京明陽(yáng)科華生物科技）；CCK-8 試劑盒（Dojindo，日本）；PVDF 膜（Millipore，美國(guó)）；恒溫?fù)u床（成都蘇凈器材公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

在DMEM 培育液（含有胎牛血清）中培養(yǎng)HepG2 細(xì)胞株。細(xì)胞數(shù)量為80%～90%時(shí)，進(jìn)行胰蛋白酶消化，然后采取1 600 r/min 進(jìn)行離心5 min，收集、重懸并培養(yǎng)細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)HepG2細(xì)胞，接種于6孔板內(nèi)（1×104個(gè)/mL），22 h后，HepG2細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，把4 μL脂質(zhì)體和200 μL緩沖液依次加入EP管中，充分混和20 min后，加入6孔板，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒分別將miR-132 mimics、miR-132-NC轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染5 h后，繼續(xù)培養(yǎng)，采用qRT-PCR法檢測(cè)是否轉(zhuǎn)染成功。

1.5 RT-PCR 檢測(cè)miR-132 含量

將液氮冷凍的HepG2 細(xì)胞進(jìn)行研磨，用TRIzol 進(jìn)行總RNA 的提取，逆轉(zhuǎn)錄參照說(shuō)明書執(zhí)行，將逆轉(zhuǎn)后所得的cDNA 進(jìn)行熒光反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。所有反應(yīng)嚴(yán)格按照反應(yīng)的條件進(jìn)行擴(kuò)增，內(nèi)參采用GAPDH，變性3 min 95℃，變性5 s 95℃，退火1 min 60℃，共40 個(gè)循環(huán)。取平均值計(jì)算Ct 值，計(jì)算方法用2－△△Ct法。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞稀釋（1×105/mL），培養(yǎng)0.5 d。在96 孔板中平鋪，數(shù)量增長(zhǎng)到一定程度后加入CCK-8 10 μL。常溫靜置30 min，使用讀板器檢測(cè)450 nm OD 值。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將HepG2 細(xì)胞密度調(diào)整至1.2×106/mL，接種于6 孔板中培養(yǎng)。0.01 mol/L PBS 洗滌，1 650 r/min 離心5min，-4 ℃保存，PBS 洗滌3 次，水浴，吹打均勻，4℃避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式上樣檢測(cè)。

1.8 Transwell 小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

各組HepG2 細(xì)胞接種數(shù)量為1×105/mL，將50 mg/mL 的基質(zhì)膠稀釋后加入小室上層，37℃下呈凝膠狀態(tài)。上室中加入細(xì)胞懸液，下室中加入少量胎牛血清培養(yǎng)基，37.5℃培養(yǎng)24 h，取出小室，拭去膜上面的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，計(jì)算膜下面的細(xì)胞，即HepG2 侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.9 免疫印跡檢測(cè)Shh 蛋白表達(dá)

將HepG2 細(xì)胞進(jìn)行裂解，并提取核蛋白，將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液按4∶1 的比例混均，煮沸變性。電泳后的50 μL 蛋白樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加脫脂奶粉封閉，時(shí)長(zhǎng)為1 h。加入1 抗后進(jìn)行TTBS 漂洗，3×10 min，最后加入二抗，常溫封閉1 h。取出PVDF 膜，進(jìn)行TTBS 漂洗，DAB 顯色后數(shù)碼相機(jī)照相。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用軟件對(duì)空白組、NC 組、YJ 組HepG2 細(xì)胞凋亡情況及Shh 蛋白表達(dá)量等數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，空白組、NC 組、YJ 組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HepG2 細(xì)胞中miR-132 相對(duì)表達(dá)量

RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示（圖1），3 組對(duì)比，YJ組HepG2 細(xì)胞中miR-132 表達(dá)量最高（P<0.05），說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。

圖1 3 組HepG2 細(xì)胞中miR-132 表達(dá)量

2.2 各組HepG2 細(xì)胞增殖情況

CCK-8 檢測(cè)結(jié)果顯示，3 組對(duì)比，YJ 組HepG2細(xì)胞增殖數(shù)量最低（P<0.05），空白組HepG2 細(xì)胞的增殖與NC 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P>0.05），皆高于YJ 組（P<0.05）（圖2）。

圖2 3 組HepG2 細(xì)胞增殖情況

2.3 各組HepG2 細(xì)胞凋亡情況

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，YJ 組、NC組、空白組細(xì)胞凋亡率分別是23.07%±2.17%、3.39%±0.69%、3.32%±0.57%，與NC 組及空白組比較，YJ 組HepG2 細(xì)胞凋亡數(shù)量最多（均P<0.05），空白組細(xì)胞凋亡數(shù)量與NC 組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖3）。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

2.4 各組HepG2 細(xì)胞侵襲情況

Transwell 小室檢測(cè)結(jié)果顯示，YJ 組細(xì)胞侵襲數(shù)量（58.60±5.32）與空白組和NC 組比較明顯降低（均P<0.05），NC 組細(xì)胞侵襲數(shù)量（95.32±9.32），與空白組（98.60±9.65））相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖4）。

圖4 肝癌HepG2 細(xì)胞侵襲情況

2.5 各組Shh 蛋白相對(duì)表達(dá)量

免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，YJ 組Shh 蛋白相對(duì)表達(dá)量與空白組和NC 組相比明顯降低（P<0.05），NC 組Shh 蛋白相對(duì)表達(dá)量含量與空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖5）。

圖5 3 組細(xì)胞中Shh 的蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

在中國(guó)最新的一次流行病調(diào)查報(bào)告中顯示，我國(guó)每年死于肝癌的人數(shù)約為43 萬(wàn)，5年內(nèi)每1 萬(wàn)名患者中僅有3 千左右的患者得以存活[12]。該病與普通肝臟疾病區(qū)分困難，所以很多患者錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)期。病情進(jìn)展迅猛，多數(shù)患者在確診初期病情已發(fā)展到難以甚至無(wú)法控制的狀態(tài)[13]。普通藥物治療成效微弱，目前臨床還是依靠手術(shù)治療來(lái)控制病情發(fā)展。雖取得了一定成效，但對(duì)于改善患者生存率，增加患者生存時(shí)間的意義不顯著[14]。

miR-132 是在小鼠神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)的一種生物內(nèi)源的非編碼小RNA，定位在人類染色體17p13[15]。目前已經(jīng)有研究顯示，其在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮一定作用，在多種人類腫瘤（如大腸癌、肝癌等）中檢測(cè)含量較低，對(duì)癌細(xì)胞有抑制作用。楊波等[16]研究表明，miR-132 對(duì)于卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲發(fā)揮抑制作用，表明miR-132很有可能是一種新的腫瘤抑制基因。為了深入探究miR-132 在人肝癌HepG2 細(xì)胞中的生物學(xué)作用，本研究通過(guò)過(guò)表達(dá)質(zhì)粒miR-132 mimics 轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2 細(xì)胞，提升 miR-132 表達(dá)量。對(duì)空白組、NC 組、YJ 組人肝癌HepG2 細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組及NC 組比較，YJ 組HepG2 細(xì)胞增殖數(shù)量最少，侵襲數(shù)量降低，細(xì)胞凋亡數(shù)量升高，結(jié)果說(shuō)明miR-132 抑制HepG2 細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)其凋亡。沙敏等[17]通過(guò)血清檢測(cè)顯示，血清miR-132在肝癌患者癌細(xì)胞中表達(dá)下降，其在肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中均有參與并發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，并且能夠通過(guò)靶向抑制GP73 的表達(dá)，降低GP73 活性發(fā)揮抑制肝癌增長(zhǎng)作用。劉海斌等[18]通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-132 模擬物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)的miR-132 對(duì)體內(nèi)外肝癌細(xì)胞有增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，miR-132 有望成為肝癌治療的新靶點(diǎn)。

Hh 信號(hào)通路是果蠅發(fā)育中相對(duì)保守的信號(hào)通路，其在器官形成的胚胎發(fā)育階段具有控制細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖、促進(jìn)細(xì)胞分化的功能。近年來(lái)，研究表明該通路異常激活與多種腫瘤疾?。ㄈ缥赴?、直腸癌等）的發(fā)生存在較大聯(lián)系。沈依萌等[19]在其研究中顯示正常成人體內(nèi) Hh 信號(hào)通路不表達(dá)或很少表達(dá)，但在肝癌組織中可見 Hh 信號(hào)通路的異常激活，進(jìn)而導(dǎo)致其下游靶基因的表達(dá)出現(xiàn)異常情況，促進(jìn)肝癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程。趙洪川等[20]研究顯示Shh、Ptch 等Hh 信號(hào)通路基因在肝癌中表達(dá)量很高，提示Hh 信號(hào)通路在肝癌的發(fā)生和進(jìn)展進(jìn)程中存在異常激活的可能性，為肝癌的發(fā)病機(jī)制研究提供了新的思考方向。姚利等[21]研究表明 Shh蛋白表達(dá)在基因轉(zhuǎn)錄、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等方面發(fā)揮了重大作用，其與腫瘤的高增殖活性密切相關(guān)。研究證實(shí)許多組織器官腫瘤的形成都與該基因異常表達(dá)有關(guān)。Shh 蛋白含量升高導(dǎo)致其與Ptch 蛋白結(jié)合，大量的Smo 蛋白從Ptch 蛋白中解脫后進(jìn)入細(xì)胞核，激活了下游轉(zhuǎn)錄因子Gli，引發(fā)促細(xì)胞生長(zhǎng)基因過(guò)度表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖。相反，當(dāng)該蛋白表達(dá)被抑制時(shí)可發(fā)揮促凋亡作用。Hh 信號(hào)通路的異常表達(dá)可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起到了直接或間接作用。近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)Hh 通路的異常激活及miRNA 的表達(dá)變化在各類腫瘤中同時(shí)存在。Guo 等[22]在研究中探討了Glil 基因在肝癌中的表達(dá)情況及其與miR-132 表達(dá)量之間的相關(guān)性，通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明兩者在肝癌中可能具有協(xié)同作用。同時(shí)顯示miR-132 在肝癌中呈現(xiàn)低表達(dá)，并通過(guò)靶向抑制下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Glil 基因參與調(diào)控發(fā)現(xiàn)Hh 信號(hào)通路，發(fā)揮類似抑癌基因作用，能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。Li 等[23]通過(guò)熒光素酶報(bào)道基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了miR-132 與Hh 配體Shh 之間的相互作用關(guān)系，實(shí)驗(yàn)顯示miR-132 上調(diào)可以抑制Shh的表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖過(guò)程，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。以上研究結(jié)果均揭示miR-132 與Hh 的相互關(guān)聯(lián)影響了肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，YJ 組HepG2 細(xì)胞中Shh 蛋白表達(dá)量最低，與NC 組、空白組相比差距大，NC 組與空白組相比數(shù)據(jù)接近，提示過(guò)表達(dá)miR-132 后，Shh 蛋白表達(dá)量減少，發(fā)揮促凋亡作用。說(shuō)明Shh 蛋白有可能成為肝癌的診斷標(biāo)志物之一，為惡性腫瘤的靶向治療提供行之有效的靶點(diǎn)。

綜上所述，miR-132 能夠通過(guò)降低Hh 信號(hào)通路的表達(dá)水平發(fā)揮促人肝癌HepG2 細(xì)胞凋亡作用。