劉小瑜，吳維，石玲

【摘要】目的研究串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在梅州地區(qū)新生兒遺傳代謝病篩查的應(yīng)用情況，初步掌握本地區(qū)新生兒遺傳代謝病發(fā)病率及病種分布情況，為建立該地區(qū)新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查體系和臨床綜合干預(yù)模式提供參考。方法對2019年4月～2021年7月在梅州市出生的47 145例新生兒應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進行遺傳代謝病篩查，對可疑陽性患兒召回復(fù)查，輔助生化檢查、家系基因檢測，明確診斷，隨訪治療。結(jié)果共篩查47 145例新生兒，初篩陽性1489例（3.16%）。確診患兒11例，總發(fā)病率1/4286。篩查出7種遺傳代謝病，分別是高苯丙氨酸血癥4例，原發(fā)性肉堿缺乏癥2例，母源性肉堿缺乏癥、甲基丙二酸血癥、丙酸血癥、異丁酰輔酶A脫氫酶缺乏癥、希特林蛋白缺乏癥各1例。結(jié)論通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進行新生兒遺傳代謝病篩查、及早診療可有效保障患兒健康，是預(yù)防出生缺陷的重要手段，對提高人口質(zhì)量意義重大。

【關(guān)鍵詞】新生兒疾病篩查;串聯(lián)質(zhì)譜;遺傳代謝病

中圖分類號：R722文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.11.006

Analysis of tandem mass spectrometry screening and follow-up results of

neonatal genetic metabolic disorders in Meizhou

LIU Xiaoyua， WU Weib， SHI Lingb

（a.Child Healthcare Department， b. Medical Heredity Center， Maternal and Child Health Care and Family Planning

Service Center of Meizhou—Meizhou Women' s and Children's Hospital， Meizhou 514021， Guangdong， China）

【Abstract】ObjectiveTo study the application of tandem mass spectrometry for the screening of neonatal genetic metabolic disorders in Meizhou， and to gain a preliminary understanding of the incidence and distribution of genetic metabolic disorders in neonates in the region， so as to provide a reference for the establishment of a tandem mass spectrometry screening system and a comprehensive clinical intervention model for neonatal genetic metabolic diseases in the region. MethodsTandem mass spectrometry was applied to screen 47 145 newborns born in Meizhou City from April 2019 to July 2021 for genetic metabolic diseases， and children with suspected positive cases were recalled for review， adjuvant biochemical tests and family genetic tests were carried out to clarify the diagnosis and follow up treatment. ResultsA total of 47 145 newborns were screened and 1489 （3.16%） were initially screened positive. There were 11 confirmed cases， with a total incidence of 1/4286. 7 genetic metabolic disorders were screened： hyperphenylalaninemia （4 cases）， primary carnitine deficiency （2 cases ）， maternal carnitine deficiency（1 case）， methylmalonic acidemia（1 case）， propionic acidemia （1 case）， isobutyryl coenzyme A dehydrogenase deficiency （1 case）， and citrin deficiency （1 case）. ConclusionTandem mass spectrometry for the screening of neonatal genetic metabolic disorders and early diagnosis and treatment can effectively protect the health of patients. It is an important means of preventing birth defects， and is of great significance for improving the quality of population.

【Key words】newborn screening; tandem mass spectrometry; inherited metabolic diseases

遺傳代謝?。╥nherited metabolic diseases，IMD）是因遺傳基因突變導(dǎo)致體內(nèi)生化物質(zhì)在合成、代謝、轉(zhuǎn)運和儲存等方面出現(xiàn)各種異常產(chǎn)生的一系列疾病，包括氨基酸、有機酸、脂肪酸、激素等代謝混亂。具有先天性、終生性、家族性的特征[1]。該類疾病臨床缺乏特異性表現(xiàn)，可涉及多器官、系統(tǒng)。在臨床上，大部分遺傳代謝病診斷難度大。遺傳代謝病雖然單一病種罕見，但種類多，所以總的發(fā)病率較高，在出生缺陷疾病防控中占重要地位，早期診治能有效改善預(yù)后。為掌握梅州市新生兒遺傳代謝病的發(fā)病率和突變基因分布情況，本研究應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對2019年4月～2021年7月在梅州市出生的47 145例新生兒進行遺傳代謝病篩查，對診斷明確的患兒進行隨訪治療，結(jié)果分析如下。

1資料與方法1.1臨床資料篩查對象為2019年4月～2021年7月在梅州市各定點助產(chǎn)醫(yī)院出生的自愿接受串聯(lián)質(zhì)譜篩查的47 145例活產(chǎn)新生兒。

1.2方法

1.2.1標本采集與遞送新生兒家長簽署篩查知情同意書。按照衛(wèi)生部《新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范》（2010版），采集出生72小時～7天充分喂哺后的新生兒足跟血4滴，滴至我中心統(tǒng)一發(fā)的濾紙片上，每個血斑直徑>8 mm，室溫下自然干燥后，放入密封袋存于2～8℃的冰箱中保存。由采血單位7天內(nèi)統(tǒng)一遞送至梅州市新生兒疾病篩查中心實驗室檢測。

1.2.2儀器及試劑應(yīng)用高效液相色譜儀（日本島津公司UFLC-20A）（包括LC-20AD二元高壓梯度泵，SIL-20AC自動進樣器，CTO-20A助溫箱）和三重四極桿質(zhì)譜儀（生產(chǎn)商：AB Sciex Pte. Ltd.型號API 3200MDTM ），華大公司生產(chǎn)的多種氨基酸、?；鈮A測定試劑盒，用衍生法檢測新生兒干血片中的23種氨基酸、35種?；鈮A指標、38種比值，篩查指標共96個。

1.2.3串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測首先用1 mL的內(nèi)標溶解液將內(nèi)標干粉充分溶解，置于超聲機低溫超聲1.5小時。用手動打孔儀打取直徑3 mm的圓形濾紙血片，置于96孔過濾板中，用萃取液跟內(nèi)標液配制反應(yīng)液，每孔加入90 μL配制好的反應(yīng)液，將過濾板與反應(yīng)板用皮筋固定在一起震蕩30 min后離心5 min，取下反應(yīng)板氮吹18 min后，加入50 μL的衍生溶液，置于溫箱衍生30 min后再進行氮吹18 min，再加入75 μL流動相溶液后震蕩15 min，震蕩結(jié)束后離心5 min，將反應(yīng)板置于串聯(lián)質(zhì)譜儀進行檢測。實驗中采用試劑盒提供的高、低質(zhì)控品對實驗質(zhì)量進行控制，同時參加了衛(wèi)生部臨檢中心的新生兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查室間質(zhì)評，均合格。

1.2.4可疑陽性的召回和診斷由經(jīng)遺傳代謝病?？婆嘤?xùn)合格后上崗的臨床醫(yī)師進行實驗數(shù)據(jù)判讀、報告審核。對初篩陽性患兒由當(dāng)?shù)蒯t(yī)院召回復(fù)采血片，寄送本中心復(fù)檢。若初篩結(jié)果明顯高于切值，立即召回本中心復(fù)查。對復(fù)查結(jié)果仍異常者召回本中心查尿有機酸、血生化或家系基因檢測等輔檢，同時結(jié)合臨床癥狀明確診斷。

1.2.5隨訪與治療為陽性患兒建立隨訪治療病歷。已有指南、共識的疾病參照已發(fā)布的各種指南、共識隨訪治療。未有指南、共識的疾病參照顧學(xué)范主編的《臨床遺傳代謝病》進行隨訪治療。

2結(jié)果

2.1串聯(lián)質(zhì)譜篩查結(jié)果

2019年4月～2021年7月全市篩查新生兒104 439例，其中自愿接受串聯(lián)質(zhì)譜篩查的新生兒47 145例，占總篩查數(shù)的45.14%。初篩陽性1489例，初篩陽性率3.16%（1489/47 145）。項目開展初期陽性率較高，2021年1～7月初篩陽性率1.59%（178/11 179）。篩出7種遺傳代謝病，共確診患兒11例，總發(fā)病率1/4286。分別是原發(fā)性肉堿缺乏癥2例，發(fā)病率1/23 572。母源性肉堿缺乏癥、甲基丙二酸血癥cb1C型、丙酸血癥、異丁酰輔酶A脫氫酶缺乏癥、希特林蛋白缺乏癥各1例，發(fā)病率均為1/47 145。高苯丙氨酸血癥4例，是傳統(tǒng)四病初篩Phe陽性，用串聯(lián)質(zhì)譜復(fù)查Phe仍升高后查基因確診的，發(fā)病率1/26 109（4/104 439）。依據(jù)高苯丙氨酸血癥產(chǎn)生的原因，可將其分為苯丙氨酸羥化酶缺乏癥和四氫生物蝶呤缺乏癥，發(fā)病率分別是苯丙氨酸羥化酶缺乏癥1/104 439，四氫生物蝶呤缺乏癥1/34 813（3/104 439）。11例患兒臨床表現(xiàn)見表1，串聯(lián)質(zhì)譜篩查和主要輔助檢測結(jié)果見表2。

2.2確診遺傳代謝病患者臨床轉(zhuǎn)歸高苯丙氨酸血癥、原發(fā)性肉堿缺乏癥、母源性肉堿缺乏癥、異丁酰輔酶A脫氫酶缺乏癥、希特林蛋白缺乏癥因早篩查、早診斷、及時服藥或飲食干預(yù)，效果明顯，生長發(fā)育與同齡兒童相仿。1例甲基丙二酸血癥患兒因及時藥物治療，體格發(fā)育正常，智能稍落后。1例丙酸血癥患兒在出生后14天即發(fā)病住院治療，出院后定期隨訪，體格、智能發(fā)育稍落后。

3討論3.1新生兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查的國內(nèi)外現(xiàn)狀及意義新生兒遺傳代謝病篩查是公共衛(wèi)生工作的重要組成部分，是預(yù)防和控制出生缺陷一項關(guān)鍵和有效措施[1～2]。我國目前仍是出生缺陷高發(fā)的國家，據(jù)國家原衛(wèi)生部2012年發(fā)布的數(shù)據(jù)[3]：我國每年有90萬左右缺陷兒出生，約占出生人數(shù)的5.6%。大力推行新生兒疾病篩查仍刻不容緩。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)作為近年發(fā)展起來的一種代謝病檢測方法，正符合了新生兒疾病篩查所要求的簡便、快速、敏感，可以一次大量地檢測血片。1990年，美國杜克大學(xué)的Dr.Millington首先利用串聯(lián)質(zhì)譜儀進行新生兒遺傳代謝病篩查[4]。隨著技術(shù)逐漸完善，串聯(lián)質(zhì)譜被世界各地的新篩實驗室廣泛應(yīng)用。2002年上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院在國內(nèi)率先開展串聯(lián)質(zhì)譜新生兒遺傳代謝病篩查[1]。之后浙江、甘肅、山東等地均將串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)用于新生兒遺傳代謝病篩查[5～7]。由此提高了篩查效率及篩查特異性、敏感性，節(jié)約醫(yī)療成本，推動新生兒遺傳代謝病篩查進入一個新紀元。

3.2本研究篩查、診斷結(jié)果本中心于2019年4月引進串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)擴大疾病篩查譜，到目前已篩查47 145例新生兒，確診11例患者，總發(fā)病率1/4286。翻閱近幾年文獻，發(fā)現(xiàn)與省內(nèi)的東莞地區(qū)發(fā)病率1/4816相仿[8]，高于湖南省的發(fā)病率1/5282[9]，低于石家莊地區(qū)的發(fā)病率1/1259[10]、山西部分地區(qū)的發(fā)病率1/1656[11]。目前本中心剛開展此項篩查，由家長自愿選擇篩查，標本量較少，未能全面覆蓋所有新生兒，未來還需要擴大樣本量和增加篩查率來進一步完善數(shù)據(jù)。從病種結(jié)構(gòu)上分析，氨基酸代謝障礙5例，占確診病例的45.45%（5/11）。脂肪酸代謝障礙4例，占確診病例的36.36%（4/11）。有機酸代謝障礙2例，占確診病例的18.18%（2/11）。氨基酸代謝障礙中高苯丙氨酸血癥4例，占確診病例的36.36%。這4例患兒是從104 439例總篩查人數(shù)中發(fā)現(xiàn)的，發(fā)病率1/26 109，遠低于全國的平均發(fā)病率1/11 144[12]。檢出有機酸代謝障礙中1例為甲基丙二酸血癥cb1C型、1例為丙酸血癥，發(fā)病率均為1/47 145。石家莊地區(qū)、山西部分地區(qū)高苯丙氨酸血癥與甲基丙二酸血癥的發(fā)病率明顯高于本地區(qū)[10～11]，說明遺傳代謝病的發(fā)病率及病種分布具有地區(qū)差異，考慮系地域和種族基因的不同所致。為進一步研究總體發(fā)病率及病種分布，未來還有待于完善全國多中心大樣本數(shù)據(jù)進行分析。從基因檢測結(jié)果分析，4例高苯丙氨酸血癥分別經(jīng)基因檢測，發(fā)現(xiàn)2例四氫生物蝶呤缺乏癥患兒均攜帶有同一個PTS基因c.84-291A>G突變位點，為內(nèi)含子變異，在ExAC東亞人群頻率數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)。該位點突變是否是本地區(qū)熱點突變，還有待增加篩查量后驗證。檢出脂肪酸代謝障礙4例，在3例原發(fā)性肉堿缺乏癥患兒中檢出2位攜帶有c.51C>G突變，該位點突變是否為本地區(qū)熱點突變，還有待擴大樣本量后驗證。還發(fā)現(xiàn)了c.760C>T（p.R254X）這個中國人群常見突變[13]。在篩查中發(fā)現(xiàn)1例母源性肉堿缺乏癥（病例3），母子串聯(lián)質(zhì)譜檢測顯示游離肉堿及多種?；鈮A明顯降低，且未見明顯癥狀，予基因檢測并家系驗證后，提示母親是原發(fā)性肉堿缺乏癥患者，其子為母源性肉堿缺乏癥，利于制定隨訪方案。由此可見，通過新生兒篩查及基因確診，還能發(fā)現(xiàn)母親的遺傳代謝病。故遺傳代謝病的精準診斷，離不開高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展。先證者的基因確診為父母再生育指導(dǎo)提供了可能。

3.3遺傳代謝病臨床情況11例確診病例都因及早篩查治療，預(yù)后良好。其中4例高苯丙氨酸血癥、2例原發(fā)性肉堿缺乏癥、1例異丁酰輔酶A脫氫酶缺乏癥早期僅有輕度黃疸，確診后予特奶或藥物治療，隨訪期間患兒生長發(fā)育基本正常。1例母源性肉堿缺乏癥患兒與原發(fā)性肉堿缺乏癥母親未見明顯異常癥狀，母子口服左卡尼汀后游離肉堿恢復(fù)正常。母親隨訪中發(fā)現(xiàn)二尖瓣關(guān)閉不全，現(xiàn)繼續(xù)服藥。孩子停藥隨訪中，生長發(fā)育好。1例希特林蛋白缺乏癥召回時出現(xiàn)黃疸、血氨稍高、總膽汁酸高，及時服藥和飲食干預(yù)，效果明顯，生長發(fā)育與同齡兒童相仿。1例甲基丙二酸血癥患兒召回時出現(xiàn)黃疸、血同型半胱氨酸高、尿甲基丙二酸高，及時藥物治療，各項生化指標控制在正常范圍，體格發(fā)育正常，智能稍落后。1例丙酸血癥患兒在新生兒期即發(fā)病，因黃疸、高氨血癥、酸中毒住院治療，出院后予特奶、左卡尼汀等治療，定期隨訪，體格、智能發(fā)育稍落后。這11例患者若未進行篩查，待發(fā)病時才診治，極可能致死、致殘。所以，通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進行新生兒遺傳代謝病篩查，改變了之前被動治療的局面，走向了主動預(yù)防，減少致死、致殘率。

綜上所述，通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進行新生兒遺傳代謝病篩查在我市開展運行良好，成效顯著。為降低出生缺陷率，提高人口素質(zhì)作出了巨大的貢獻。本研究建立了我市新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查體系和臨床綜合干預(yù)模式，初步明確了本市新生兒遺傳代謝病發(fā)病率及其構(gòu)成譜、單病種基因突變情況。但收集樣本數(shù)尚少，還不能很好地反映本地區(qū)遺傳代謝病各單病種發(fā)病率及基因突變譜，有待今后收集更大樣本數(shù)據(jù)進一步研究完善。

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（收稿日期：2021-08-25修回日期：2021-09-26）

（編輯：王琳葵潘明志）