翟亞偉，趙 穎,2，李勝男，朱妙菲，潘 雯，巴音達(dá)拉，馬 榮

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)林業(yè)和草原資源監(jiān)測中心，烏魯木齊 830002)

0 引 言

【研究意義】吐魯番地區(qū)葡萄產(chǎn)業(yè)，占農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的41.27%[1]。近年來在新疆吐魯番市田間調(diào)查過程中，在葡萄病葉上分離得到一株真菌，對比形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定，對準(zhǔn)確鑒定該菌有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Q.cyanescens隸屬于擔(dān)子菌門，黑粉菌亞門，外擔(dān)菌綱，微座孢目，桉座孢科，桉座孢屬，該科僅包含Quambalaria一個(gè)屬。目前，Quambalaria屬中包含9個(gè)種：Q.coyrecup、Q.cyanescens、Q.eucalypti、Q.fabacearum、Q.pitereka、Q.pusilla、Q.ruqosea、Q.simpsonii、Q.tasmaniae，模式種為Quambalariapitereka[2-10]。Quambalaria屬真菌中既有能夠危害桉屬(Eucalyptus)和傘房桉屬(Corymbia)植物引起幼苗的莖葉、枝干，造成枝葉枯萎、潰爛甚至死亡的病原真菌(Q.eucalypti、Q.fabacearum、Q.pitereka、Q.coyrecup)[11]，又包含能夠引發(fā)人類腹膜炎等疾病，具有天然的真菌藥物抗性，可阻礙抗真菌治療的Q.cyanescens等臨床類病原菌[5]。該屬真菌主要分布在澳大利亞、中國、美國、巴西、泰國、荷蘭、意大利、葡萄牙、烏拉圭、伊朗、南非、埃及、捷克、馬來西亞、土耳其、西班牙、匈牙利、保加利亞、敘利亞等國家[11-15]。目前，我國已經(jīng)報(bào)道了該屬中的4個(gè)種：Q.cyanescens，Q.pitereka，Q.eucalypti，Q.simpsonii[10，12，16-17]【本研究切入點(diǎn)】從紅曲米中篩選得到Q.cyanescens，其發(fā)現(xiàn)該菌具有良好的凝乳活性，其產(chǎn)生的凝乳酶是一種新型蛋白[16]。植入物上得到Q.cyanescens[12]，也有研究Q.cyanescens所產(chǎn)凝乳酶的作用[18].。尚未在葡萄葉片上有該屬真菌的記錄。【擬解決的關(guān)鍵問題】運(yùn)用常規(guī)組織分離法獲得純化菌株，提取該菌基因組DNA，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)合形態(tài)學(xué)特征完成該菌的分類地位的鑒定。將其接種在不同培養(yǎng)基、溫度、pH和光照條件下，混合正交實(shí)驗(yàn)，觀察并記錄該菌的培養(yǎng)特征，分析該菌的最適培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 材 料

標(biāo)本來源：2018年在新疆吐魯番市葡萄園采集獲得。

培養(yǎng)基：沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)和玉米粉瓊脂(CMA)，冷卻至60 ℃時(shí)加入1 mol/L HCl或NaOH溶液微調(diào)培養(yǎng)基pH值至特定值后1×105Pa滅菌30 min，試驗(yàn)范圍pH 5.0 ～ 9.0，兩相鄰處理間pH差值為1。

儀器：超凈工作臺(杭州哈析儀器儀表有限公司)、高壓蒸汽滅菌鍋(三洋公司GMSX-280)、PCR儀(上海安亭科學(xué)儀器廠)、凝膠成像儀(北京盛科信德科技有限公司)、電泳儀(北京市六一機(jī)械廠)、體式顯微鏡(北京榮興光恒科技有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 供試菌株的分離、純化和保存及形態(tài)學(xué)

常規(guī)組織分離法分離2018年在新疆吐魯番地區(qū)采集到的葡萄樹病葉，利用單孢純化法得到純化菌株。挑取純化菌株菌落邊緣的菌絲置于PDA斜面上，28 ℃黑暗培養(yǎng)，待菌落長至斜面的1/3處時(shí)置于4 ℃冰箱保存，每個(gè)菌株保存3份。菌株保存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院林木保護(hù)實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 菌株種類的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)特征

挑取少量菌落邊緣菌絲，置于PDA平板中央的無菌蓋玻片邊緣，培養(yǎng)3 d后觀察并測量蓋玻片上菌落的生長情況、孢子的形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)性狀，主要為產(chǎn)生色素的顏色、菌絲質(zhì)地，并測量其菌落直徑。

1.2.2.2 分子生物學(xué)的鑒定

采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA[19]。通過ITS1(5＇-TCCGTAGTGAACCTGCGG-3＇)和ITS4(5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇)擴(kuò)增內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)；NL1(5＇-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3＇)和NL4(5＇-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3＇)擴(kuò)增核糖體大亞基[20-21]。PCR反應(yīng)體系為30 μL：包含2×EsTaqMaster Mix 15 μL，上下引物各1.5 μL，DNA模板1.5 μL，ddH2O 10.5 μL[22]。PCR產(chǎn)物送至上海生工工程有限公司測序。在GenBank數(shù)據(jù)庫中下載與供試菌株同源性在99%以上物種的ITS和LSU序列，用于系統(tǒng)發(fā)育分析。以Microstromajuglandis作為外群，用PAUP*4.0b 10軟件進(jìn)行最大簡約分析(Maximum parsimony，MP); 用Raxml軟件進(jìn)行最大似然分析(Maximum likelihood，ML); 用MrBayes 3.2.6進(jìn)行貝葉斯分析(Bayesian inference，BI)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[23]。表1

表1 Quambalaria屬菌株信息Table 1 Quambalaria species information

1.2.3 供試菌株的生物學(xué)特性

挑取菌落邊緣少量菌絲，采用平板劃線法接種分別在不同培養(yǎng)基種類(A)、光照條件(B)、pH值(C)和培養(yǎng)溫度(D)等4個(gè)因素的不同水平下培養(yǎng)，進(jìn)行L225(32×52)混合正交試驗(yàn)[24]，設(shè)3次重復(fù)，3 d后隔日測量菌落直徑，計(jì)算菌落生長速率。

培養(yǎng)基種類因素3水平：A1、A2、A3分別為PDA培養(yǎng)基、SDA培養(yǎng)基、CMA培養(yǎng)基；光照條件因素3水平：B1、B2、B3分別為全光照、半光照、黑暗；pH值因素5水平：C1、C2、C3、C4、C5分別為pH=5、6、7、8、9；培養(yǎng)溫度因素5水平：D1、D2、D3、D4、D5分別為20、25、30、35、40。根據(jù)不同處理下的菌落生長速率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行多因素方差分析(MANOVA)，判斷影響供試菌株生長的主要因素，篩選有利于其生長的最優(yōu)組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株的種類鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)特征觀察

研究表明，從葡萄病葉上得到的菌株P(guān)t4-1在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)初期菌絲透明稀疏，菌落表面光滑；中后期菌絲白色致密，菌落干燥粗糙，具有明顯凸起和絲狀邊緣；室溫培養(yǎng)72 h后可產(chǎn)生紫色色素。培養(yǎng)后期會產(chǎn)生2種分生孢子：初生分生孢子透明，橢圓形至梭形，光滑，大小為3.2～7.3×0.6～2.7 μm；次生分生孢子透明，光滑，卵圓形至橢圓形，大小為2.4～3.4×0.6～1.6 μm。圖1

注：A：菌落正面(反面)；B：菌絲(標(biāo)尺=20 μm)；C：初生分生孢子(標(biāo)尺=20 μm)；D：次生分生孢子(標(biāo)尺=10 μm)

2.1.2 分子系統(tǒng)學(xué)

研究表明，ITS、LSU引物擴(kuò)增獲得長度約為617 bp和600 bp的基因片段，將所獲得的序列同GenBank數(shù)據(jù)庫種的序列進(jìn)行同源性比較，利用最大簡約法(MP法)、最大似然法(ML法)和貝葉斯法(BI法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。菌株P(guān)t4-1、Pt4-2、Pt6-1、Pt6-2與QuambalariacyanescensBRIP 48396位于同一支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，最終將供試菌株P(guān)t4-1、Pt4-2、Pt6-1、Pt6-2鑒定為藍(lán)色刺孢霉Q.cyanescens。圖2

圖2 基于ITS和LSU基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 phylogenetic tree based on ITS and LSU gene sequences

2.2 菌株的生物學(xué)特性

研究表明，菌株P(guān)t4-1在不同的pH值(5、6、7、8、9)、不同培養(yǎng)基(PDA、SDA、CMA培養(yǎng)基)、不同的培養(yǎng)溫度(20～40 ℃)及不同的光照條件(全光照、半光照和黑暗條件)下的菌落形態(tài)存在較大差異。該菌在PDA、SDA培養(yǎng)基上生長良好，可分泌紫色色素，20～25 ℃的培養(yǎng)溫度下紫色色素明顯。隨著培養(yǎng)溫度的升高，色素分泌減少，逐漸由紫色變?yōu)樗{(lán)色，35 ℃時(shí)不產(chǎn)生紫色的色素，40 ℃時(shí)菌株不能生長。菌株P(guān)t4-1在CMA培養(yǎng)基上生長但不產(chǎn)生色素。

培養(yǎng)基的種類、光照條件及培養(yǎng)溫度三者間的交互作用對菌株P(guān)t4-1菌落生長具有顯著影響。菌株P(guān)t4-1在PDA、SDA、CMA培養(yǎng)基上的平均生長速率分別為1.81、1.82、0.86 cm/d；在PDA、SDA培養(yǎng)基上生長速度較CMA培養(yǎng)基更快。不同光照條件、培養(yǎng)基pH值和培養(yǎng)溫度對菌落的生長無顯著影響。其中組合A2B2C1D2(SDA培養(yǎng)基、半光照、pH5、溫度25 ℃)的生長速率最大，平均生長速率為2.29 cm/d；組合A3B2C1D2(CMA培養(yǎng)基、半光照、pH 5、溫度25 ℃)的生長速率最小，平均生長速率為0.55 cm/d。圖3

圖3 Pt4-1在不同培養(yǎng)條件下的菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of Pt4-1 under different culture conditions

3 討 論

藍(lán)色刺孢霉(Quambalariacyanescens)真菌是一類重要的植物病原真菌，不僅能夠危害桉樹、樺樹[10-11,25]，在伊朗還能夠危害葡萄嫩枝[24]，研究首次在新疆的葡萄葉片上收集到菌株P(guān)t4-1，該菌在培養(yǎng)基上形成的初生分生孢子(3.2～7.3×0.6～2.7 μm)為透明、橢圓形至梭形、光滑；次生分生孢子(2.4～3.4×0.6～1.6 μm)透明、光滑、卵圓形至橢圓形，與Narmani和Arzanlou從葡萄藤上得到的Q.cyanescens菌株的形態(tài)特征較為相似[26]。

菌株P(guān)t4-1在培養(yǎng)初期時(shí)菌絲透明稀疏，菌落潮濕光滑；中后期菌落白色、干燥粗糙、菌絲致密、具有明顯凸起和絲狀邊緣；培養(yǎng)72 h后可觀察到菌落背面出現(xiàn)紫色，與Narmani和Arzanlou的研究結(jié)果一致[26]。

鑒于該菌在不同培養(yǎng)基上的形成的菌落存在差異，研究觀察了菌株P(guān)t4-1在不同培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)特征，研究表明菌株分泌色素與培養(yǎng)基種類有關(guān)，該菌在CMA培養(yǎng)基上無色素形成，這一結(jié)果與Kuan的研究結(jié)果一致[9]。但菌株P(guān)t4-1在PDA、SDA培養(yǎng)基上的色素顏色均為紫色至藍(lán)色，與Kuan的描述存在差異。Kuan發(fā)現(xiàn)Q.cyanescens在SDA培養(yǎng)基上分泌紅色色素、PDA培養(yǎng)基上分泌深棕色色素、果汁瓊脂培養(yǎng)基(V8)上分泌紫色色素，引起這一差異的原因有待進(jìn)一步研究[9]。

色素的產(chǎn)生與否、顏色深淺與培養(yǎng)溫度之間存在聯(lián)系，25～30 ℃時(shí)色素產(chǎn)生并多于35 ℃，這與研究相似[9]。

4 結(jié) 論

從新疆吐魯番的葡萄病葉上分離該菌，綜合ITS和LSU基因序列分析及菌株的形態(tài)學(xué)特征確定該菌為藍(lán)色刺孢霉(Quambalariacyanescens)。菌株P(guān)t4-1的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：SDA培養(yǎng)基、半光照、培養(yǎng)基pH值為5、溫度25 ℃。