杜軍波, 張大雷, 張恒坡, 李靜

濮陽市安陽地區(qū)醫(yī)院皮膚科，河南 濮陽 455001

銀屑病是一種由遺傳、免疫及環(huán)境等多種因素共同介導的慢性炎癥性皮膚疾病，具體發(fā)病機制不清[1]。蛋白質(zhì)組學是以蛋白質(zhì)組為研究對象，研究細胞、組織或生物體蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律的科學，系統(tǒng)探討蛋白組學的變化能更好地反映復雜疾病的發(fā)生機制及其變化規(guī)律[2-3]。蛋白質(zhì)組學近年來在皮膚科領(lǐng)域得到廣泛應用[4]。有研究通過蛋白組學技術(shù)證實角蛋白類相關(guān)蛋白、凝血相關(guān)蛋白等多種異常表達蛋白可能與銀屑病(血瘀證)的發(fā)病機制有關(guān)[5]。通過血清蛋白組學技術(shù)鑒定出銀屑病患者中存在106種差異表達蛋白，涉及血液凝固、炎癥、細胞凋亡和血管生成等多種信號通路[6]，但關(guān)于通過蛋白組學技術(shù)對銀屑病皮損開展研究的報道較少。因此，本研究通過比較初發(fā)型尋常型銀屑病患者皮損與正常皮膚組織中的蛋白表達差異，以期為尋常型銀屑病的發(fā)病機制和靶向治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

納入6例于2020年6月—9月在濮陽市安陽地區(qū)醫(yī)院皮膚科就診的初發(fā)尋常型銀屑病(psoriasis vulgaris，PV)和6例色素痣患者作為研究對象。PV患者年齡27～33歲，平均(30.29±2.69)歲；PASI評分6～11，平均8.56±1.46；BMI 25～29 kg/m2，平均(27.03±1.52)kg/m2。兩組中各4例進行蛋白組學分析(實驗組)，2例進行驗證(驗證組)。兩組年齡(t=0.543)、BMI(t=0.968)相比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。PV患者納入標準：①通過組織病理學確診為PV；②初發(fā)型，年齡18歲以上。排除標準：①存在嚴重肝腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤及急慢性感染性疾病等；②合并其他風濕性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關(guān)節(jié)炎、白塞病等；③臨床資料不完整。色素痣患者納入標準：①結(jié)合病史、皮損特點及術(shù)后組織病理學診斷為色素痣；②手術(shù)后通過修剪“貓耳朵”等方式獲得色素痣皮損周邊正常皮膚組織。排除標準：①排除皮脂腺痣、色素性毛表皮痣等；②合并肝腎功能不全、感染性疾病、自身免疫性疾病等。所有研究對象均知情同意且簽署知情同意書。研究已通過本院倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 生物質(zhì)譜分析兩組蛋白表達差異 活檢手術(shù)獲得PV患者皮損，外科切除后獲得色素痣患者周圍正常皮膚組織，生理鹽水沖洗后置入-80 ℃冰箱中保存待測。取出組織于研磨杯中邊加入液氮邊研磨成粉末，加入TRIS平衡酚后于離心機下8 000 r/min離心10 min。吸取上清置入新的EP管中并加入0.1 mol/L乙酸銨/甲醇進行沉淀，靜置24 h，分別采用甲醇和丙酮進行洗滌1次，采用10 mmol/L的尿素溶液溶解。取各組蛋白溶解液，加入裂解液調(diào)整至體積一致，加入二硫蘇糖醇調(diào)整終濃度為5 mmol/L，再加入碘乙酰胺調(diào)整終濃度為11 mmol/L，以1∶50比例加入胰蛋白酶進行胰酶溶解并過夜，再以1∶100比例加入胰蛋白酶，繼續(xù)酶解4 h。各組胰酶酶解的肽段用Strata X C18(Phenomenex)除鹽后真空冷凍干燥，隨后以0.5 mol/L TEAB進行溶解肽段，根據(jù)串聯(lián)質(zhì)譜標簽(tandem mass tag，TMT)試劑盒操作說明標記肽段。

各個樣品中所獲得的肽段用高pH反相HPLC分級，肽段用液相色譜流動相A相(0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液)溶解，使用EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)中的流動相B(0.1%甲酸和90%乙腈的水溶液)進行分離。肽段分離后被注入NSI離子源中進行電離，采用QE plus質(zhì)譜進行分析。

1.2.2 生物信息學分析 兩組間差異表達蛋白采用費歇爾精確雙端檢驗方法(Fisher’s exact test)，以P-value小于0.05且差異倍數(shù)為1.3倍為差異具有統(tǒng)計學意義，將蛋白組學中所有的差異蛋白進行GO分類富集及KEGG通路富集分析。

所有差異蛋白通過STRING在線軟件進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein internaction network,PPI)分析，參數(shù)最低設(shè)置為0.400。

1.2.3 Western blot驗證 將PV組織及正常皮膚組織分別置于消毒后的研缽中，邊加入液氮邊研磨成粉末，收集所有粉末移入EP管，加入500 μL RIPA裂解液，冰上孵育約30 min后離心，吸管吸取上清液于-80 ℃冰箱中保存。取5 μL蛋白樣品進行電泳、電轉(zhuǎn)、牛奶封閉，分別加入一抗S100A7(1∶200，上海雅吉生物科技有限公司，中國)、S100A9(1∶400，abcam公司，美國)、cathepsin B(1∶500，abcam公司，美國)、haptoglobin(1∶500，abcam公司，美國)、arginase-1(1∶100，R&D公司，美國)和β-actin(1∶1 000，萬類生物科技有限公司，中國)并4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗(1∶1 000)孵育1 h。每個條帶的蛋白灰度值采用Image J軟件檢測。組織中目標蛋白相對表達水平=目標蛋白的灰度值/β-actin灰度值，重復測量3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用GraphPad Prism 5.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，兩組間蛋白表達水平的比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PV患者皮損中的差異表達蛋白

研究中共匹配到的肽段有70 945個，最終匹配到的蛋白有4 990個，進行定量分析的有4 720個(圖1)。火山圖(圖2)顯示，相對于正常組織而言，銀屑病皮損中發(fā)生顯著改變的蛋白共有454個，其中上調(diào)的蛋白有291個，下調(diào)的蛋白有163個。

圖1 蛋白組學中鑒定到的蛋白基本信息

圖2 尋常型銀屑病患者皮損中的差異表達蛋白

2.2 GO富集分析和KEGG富集分析

對發(fā)生顯著改變的454個蛋白進行GO富集分析和KEGG富集分析，結(jié)果顯示，在GO富集分析中，涉及的生物學過程主要為中性粒細胞活化、中性粒細胞介導的免疫、TNF-α介導的信號通路、B細胞介導的免疫、上皮細胞分化及角質(zhì)化。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，尋常型銀屑病發(fā)病機制可能涉及到IL-17信號通路、氧化磷酸化、PPAR信號通路等(圖3、圖4)。

圖3 差異表達蛋白的GO富集分析

圖4 差異表達蛋白的KEGG富集分析

2.3 PPI分析

PPI結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋白與蛋白相互作用值超過0.400的差異蛋白共372個，進一步對這些差異蛋白進行GO和KEGG富集分析，結(jié)果顯示差異蛋白主要涉及的生物學進程及通路主要與炎癥、角化過度及IL-17介導的信號通路、表皮細胞分化等有關(guān)。差異蛋白分別與圖2中GO富集分析中的生物學進程中前3種(中性粒細胞活化、中性粒細胞介導的免疫、TNF-α介導的信號通路)及KEGG信號通路中的前3種(IL-17信號通路、氧化磷酸化、PPAR信號通路)進行匹配分析，共匹配出12個蛋白(表1)，提示這12個蛋白可能在尋常型銀屑病的發(fā)病機制中扮演了重要作用。

表1 12種核心蛋白的基本信息

2.4 Western blot驗證

對S100A7、S100A9、cathepsin B、haptoglobin和arginase-1共5個蛋白在初發(fā)尋常型銀屑病患者皮損中的表達進行Western blot驗證，結(jié)果顯示，銀屑病患者皮損中S100A7(t=5.54，P<0.05)、S100A9(t=45.23，P<0.05)、cathepsin B(t=4.23，P<0.05)、haptoglobin(t=4.12，P<0.05)和arginase-1(t=6.65，P<0.05)蛋白表達水平較正常皮膚組織升高(圖5)。

圖5 S100A7、S100A9、cathepsin B、haptoglobin和arginase-1蛋白表達水平的Western blot驗證

3 討論

銀屑病發(fā)病機制復雜，盡管遺傳因素在一定程度上解釋了某些基因位點易感性與銀屑病發(fā)病相關(guān)[7]，但目前大多數(shù)研究認為，除了遺傳因素外，免疫炎癥，尤其是多種信號通路和炎癥介質(zhì)在銀屑病的發(fā)病機制中扮演了重要作用[8]。TMT是一種多肽體外等重同位素標記的相對與絕對定量技術(shù)，采用6、10及16種同位素的標簽，通過特異性標記多肽的氨基基團，經(jīng)高分辨質(zhì)譜儀串聯(lián)分析，可同時比較多達16種樣品之間的蛋白質(zhì)表達量，是定量蛋白質(zhì)組學中經(jīng)典的高通量篩選技術(shù)[9]。

本研究采用TMT標記的蛋白組學技術(shù)對銀屑病皮損中的差異蛋白進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，銀屑病皮損中上調(diào)的蛋白有291個，下調(diào)的蛋白有163個。GO富集分析后證實，這些差異蛋白涉及的生物學過程與中性粒細胞活化、中性粒細胞介導的免疫等有關(guān)，這可能與銀屑病典型的病理特征之一有關(guān)，即大量中性粒細胞在表皮聚集所致的Munro微膿腫或Kogoj微膿瘍。中性粒細胞也能分泌多種炎癥介質(zhì)(如IL-6、TNF-α等)進一步參與并促進銀屑病皮損中的慢性炎癥狀態(tài)[10]。此外，GO富集分析發(fā)現(xiàn)生物學過程中還涉及到上皮細胞分化及角質(zhì)化，可能與銀屑病皮損快速增殖及斑塊形成這一表型有關(guān)。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)前三種為IL-17信號通路、氧化磷酸化、PPAR信號通路。IL-17家族因子在銀屑病的發(fā)病機制中作用較為顯著，尤其是IL-23/IL-17軸在銀屑病發(fā)病過程中起著重要作用，IL-17A屬于Th17細胞分泌的主要細胞因子之一，可與TNF-α協(xié)同誘導內(nèi)皮細胞上的粘附分子和趨化因子高表達，促進銀屑病的炎癥發(fā)展[11]。IL-17也可促進角質(zhì)形成細胞的過度增殖及中性粒細胞、肥大細胞等活化，從而進一步加重局部的炎癥反應[12]。蛋白經(jīng)過修飾后在銀屑病發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，其中磷酸化水平最為常見，部分蛋白如STAT3經(jīng)過磷酸化修飾后在銀屑病皮損中表達上調(diào)，而其非磷酸化水平的表達與正常皮膚組織無差異，通過抑制STAT3的磷酸化修飾后可降低銀屑病樣皮損的嚴重程度[13]。Tyr705和Ser727是STAT3兩個磷酸化位點，當被激活后可促進STAT3的表達升高[14]。PPAR是調(diào)節(jié)脂質(zhì)、葡萄糖和氨基酸代謝的核受體超家族的成員，PPAR和相應的配體在皮膚和其他器官中具有重要的細胞調(diào)節(jié)功能，包括細胞增殖和分化以及炎癥反應[15]。

GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示多種信號通路均參與了銀屑病的免疫學發(fā)病機制及病理生理過程，PPI分析后顯示372個差異蛋白可能是銀屑病發(fā)病機制的重要蛋白，結(jié)合GO富集分析及KEGG富集分析結(jié)果，篩選出17種核心蛋白，涉及IL-17信號通路、中性粒細胞活化、氧化磷酸化、PPAR信號通路、中性粒細胞介導的免疫、PPAR信號通路、TNF-α介導的信號通路等，提示這些通路可能與銀屑病的發(fā)病機制密切相關(guān)。

對其中S100A7、S100A9、cathepsin B、haptoglobin和arginase-1 5種蛋白進行驗證，結(jié)果顯示，銀屑病患者皮損中該5種蛋白表達水平均升高。S100A7和S100A9均屬于S100家族中的主要成員，參與銀屑病的炎癥反應、角質(zhì)形成細胞過度增殖等過程[16]，其中S100A9屬于銀屑病的一種標志蛋白[17]。cathepsin B也稱之為組織蛋白酶 B，目前研究最為廣泛的屬于cathepsin G。cathepsin G可活化多種炎癥因子如IL-33、IL-1α、IL-36等促炎因子參與銀屑病的炎癥反應[15]，而cathepsin B失活后可減輕IL-17A誘導的角質(zhì)形成細胞過度增殖、炎癥反應現(xiàn)象，同時也可減輕角質(zhì)形成細胞的分化[18]。haptoglobin屬于一種急性蛋白，主要由肝臟合成，也可由角質(zhì)形成細胞合成，在銀屑病患者皮損中haptoglobin表達水平升高[19]。arginase-1是鳥氨酸循環(huán)代謝的關(guān)鍵酶，在銀屑病皮損中同樣高表達[20]，但目前尚缺少有關(guān)兩種蛋白對銀屑病發(fā)生發(fā)展影響機制的研究。本研究結(jié)果顯示haptoglobin和arginase-1兩種蛋白可能與中性粒細胞介導的免疫有關(guān)，為下一步對這兩種蛋白進行研究提供了思路。

綜上所述，銀屑病發(fā)病機制較為復雜。本研究采用蛋白組學技術(shù)證實多種免疫信號通路及差異表達蛋白可能在銀屑病的發(fā)病機制中扮演了重要作用，為下一步研究提供了新思路。然而，本研究納入樣本量較少，未對核心蛋白進行功能學分析，需在日后進一步研究。