王文靜 呂思佳 何 凡 汪慶昊 吳月燕

(浙江萬里學院生物與環(huán)境學院，浙江 寧波 315100)

杜鵑花為杜鵑花科(Ericaceae)杜鵑花屬(Rhododendron)常綠或落葉灌木，是世界著名的觀賞植物，廣泛應(yīng)用于園林種植和室內(nèi)美化[1-2]。我國具有豐富的杜鵑花種質(zhì)資源，但僅有少數(shù)杜鵑花種具有香氣，如常綠杜鵑亞屬中的云錦杜鵑(Rh.fortunei)?；ㄏ闶怯^賞植物的重要觀賞性狀之一，因此花香也是評價花卉品質(zhì)的一項重要指標[3]。但目前對杜鵑花的花香性狀及香氣物質(zhì)形成機理的研究卻鮮有報道[4]。

花香是植物散發(fā)出的揮發(fā)性低分子量混合物，植物的部分營養(yǎng)器官及花器官均可以散發(fā)芳香物質(zhì)?；ǖ南銡馀欧帕扛鶕?jù)花的發(fā)育階段有所不同[5]?；ㄏ憧梢晕ハx完成授粉，抵御生物脅迫以及環(huán)境變化引起的自然脅迫等[6-7]。相對于花型、花色等易于觀察的植物性狀，目前對花香的研究相對滯后[8]。

通過對多種植物花香化合物的成分進行分析，已明確萜烯類化合物是植物香氣成分中的主要物質(zhì)[9]。植物香氣中萜類化合物種類多樣，其中芳樟醇是萜烯類化合物的重要組成部分，是桂花(Osmanthusfragrans)[10]，百合(Lilium)[11]，康乃馨(DianthusCarnation)[12]等具香氣植物的香氣化合物主要成分。芳樟醇常作為香精與香水中的主要香料成分，也可作為食用香料成分[13]。研究表明芳樟醇合酶(linalool synthetase,LIS)是萜烯類化合物生物合成的重要酶，可以將香葉基焦磷酸(geranyl pyrophosphate,GPP)直接催化為揮發(fā)性物質(zhì)芳樟醇[14]。通過分析擬南芥基因組序列發(fā)現(xiàn)，不同種萜烯類合酶基因中，75%的萜烯類合酶基因編碼的氨基酸序列及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)具有相似性，但是這些基因在生物學功能方面表現(xiàn)差異[15]。

章辰飛等[16]研究發(fā)現(xiàn)萜烯類化合物是云錦杜鵑香氣成分的主要組成部分，其中芳樟醇含量較高，同時芳樟醇在云錦杜鵑花不同花期的花瓣中均存在?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，推測芳樟醇可能為云錦杜鵑的主要特征香氣成分。本研究以香氣濃郁且萜烯類化合物含量豐富的云錦杜鵑作為試驗材料，克隆杜鵑LIS基因，并對云錦杜鵑不同花期的花瓣及其他組織進行基因表達水平分析，結(jié)合芳樟醇的含量變化分析結(jié)果，以期深入探討杜鵑花中LIS基因的功能及花香成分代謝機制，為今后利用LIS基因改良植物花香化合物含量，提高植物花香質(zhì)量和觀賞價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

云錦杜鵑采自寧波四明山國家森林公園(圖1)，根據(jù)花被片開放程度將杜鵑花的開花過程分為4個時期：花苞期，花被未張開；半開期，花被片張開；盛開期，花被片全部開放；衰敗期，花被片開始萎蔫。選取10株生長健壯且長勢一致的云錦杜鵑，隨機選擇處于相同花期，大小相同、著色一致、無病蟲害、無擠壓損傷的花瓣，用蒸餾水沖洗外部雜質(zhì)后立即置于液氮中，放入-80℃超低溫冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 用液氮研磨杜鵑花花瓣樣品，采用植物總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取花瓣總RNA。分別用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000核酸蛋白質(zhì)分析儀(上海賽默飛世爾科技)測定總RNA的完整性和濃度。按照TransScript Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)說明書合成cDNA第一鏈[17]。

1.2.2RhLIS基因克隆 從GenBank中下載與杜鵑花屬植物親緣關(guān)系較近植物的LIS基因全長序列，采用ClustalW進行多序列比對，在同源性較高的序列設(shè)計簡并引物LIS-F1和LIS-R1(表1)進行PCR擴增。PCR反應(yīng)總體系為50 μL：2×Taq PCR Master Mix 25 μL、cDNA模板2 μL、上下游引物各2 μL、RNase-free水19 μL。PCR反應(yīng)程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃保溫10 min，4℃保存。根據(jù)簡并引物的擴增序列設(shè)計RACE擴增引物5′GSP和3′GSP，分別擴增該基因的5′和3′端序列[18]。RACE-cDNA的合成具體操作按照SMARTer RACE 5′/3′ Kit RACE試劑盒(日本寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)說明書進行。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、連接pMD18-T Vector Cloning Kit(日本寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)、轉(zhuǎn)化(DH5α感受態(tài)細胞)、重組子篩選及菌液PCR鑒定后，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定[19]。根據(jù)RACE拼接結(jié)果設(shè)計全長引物LIS-F2和LIS-R2，用于驗證基因的全長序列。

表1 LIS基因克隆所用引物Table 1 Primers used for cloning of LIS gene

1.2.3 生物信息學分析 采用ORF finder查詢開放閱讀框(open reading frame,ORF)并預測氨基酸序列；采用DNAMAN 軟件進行同源蛋白質(zhì)序列比對；采用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；采用CDD軟件分析蛋白質(zhì)序列的保守結(jié)構(gòu)域；采用Expasy Protparam和ProtScale預測蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和疏水性/親水性；采用NetPhos分析蛋白質(zhì)的磷酸化位點；采用SOPMA預測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；采用Swiss-Model預測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。

1.2.4RhLIS基因表達水平的分析 按照NovoScript Plus All-in-one1st Strand cDNA Synthesis SuperMix(gDNA Purge)試劑盒(日本近岸蛋白質(zhì)科技有限公司)合成實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)的模板cDNA。利用 Premier5.0 軟件設(shè)計qRT-PCR引物LIS-F3和LIS-R3。以杜鵑EF1α(DUH018457.1)為內(nèi)參基因，按照Trans Start Tip Green qPCR SuperMixS說明書(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進行qRT-PCR擴增。每個樣品擴增時均有內(nèi)參基因同時參與擴增，各樣品的基因相對表達量均為 3 次生物重復的平均值，采用 2-ΔΔCT法[20]進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 云錦杜鵑不同花期的花瓣及其他組織中芳樟醇含量的測定 采用頂空固相微萃取(solid-phasemicro-extraction,SPME)與氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)聯(lián)用技術(shù)(SPME-GC-MS)結(jié)合內(nèi)標定量法進行芳樟醇含量測定[21-22]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有樣品均設(shè)置3次生物學重復，試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0和Excel 2010進行整理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LIS基因的克隆

以云錦杜鵑花苞cDNA為模板，利用簡并引物進行PCR擴增獲得1 293 bp保守區(qū)序列(圖2-A)；基于保守區(qū)序列的RACE擴增，分別獲得541 bp的5′序列(圖2-B)和1 259 bp的3′序列(圖2-C)。利用DNAMAN軟件將保守區(qū)、5′和3′序列進行比對拼接，得到LIS基因全長為2 071 bp，其中包含1 887 bp的完整ORF序列(圖2-D)，編碼628個氨基酸(圖3)。該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中含有一段天冬氨酸保守區(qū)域(DDxxD)[23]，是金屬離子結(jié)合區(qū)域，也是萜類合酶具有的典型結(jié)構(gòu)。利用NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST序列比對，LIS基因核苷酸序列與茶樹(Camelliasaluenensis)、葡萄(Vitisvinifera)、桂花的相似性分別為71%、68%和68%。

注:A:保守區(qū)擴增產(chǎn)物;B:5′RACE擴增產(chǎn)物;C:3′RACE擴增產(chǎn)物;D:LIS基因完整ORF區(qū)。Note:A:Conserved region sequence.B:5′RACE sequence.C:3′RACE sequence.D:LIS gene complete ORF region.圖2 云錦杜鵑LIS基因PCR擴增Fig.2 PCR amplification of LIS gene in Rh. fortunei

注:方框內(nèi)是起始密碼子 ATG 和終止密碼子TAG；DDLYD為天冬氨酸富集模體。Note:The boxes are the start codon ATG and the stop codon TAG.DDLYD is an aspartic acid enriched motif.圖3 云錦杜鵑LIS基因的核苷酸及推測的氨基酸序列Fig.3 The nucleotide and deduced amino acid sequence of LIS gene from Rh. fortunei

2.2 LIS蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)預測

2.2.1 LIS蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析 LIS編碼蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域分析表明，杜鵑花LIS蛋白質(zhì)屬于Isoprenoid-Biosyn-C1 superfamily超家族(圖4)。

圖4 杜鵑花LIS基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.4 Conservative domains of LIS encoding protein in Rhododendron

2.2.2 LIS蛋白質(zhì)生物活性分析 ProtParam分析結(jié)果表明，杜鵑LIS蛋白質(zhì)的預測分子質(zhì)量為72.39 kDa，等電點(pI)為5.85，說明其為酸性蛋白質(zhì)；分子式為C3268H5068N860O949S25，負電荷氨基酸殘基總數(shù)(Asp+Glu)為85，正電荷氨基酸殘基總數(shù)(Arg+Lys)為70，不穩(wěn)定系數(shù)為37.81，推測為帶負電荷的穩(wěn)定蛋白質(zhì)，脂溶性指數(shù)為91.61，親水性平均數(shù)為-0.269。ProtScale 分析結(jié)果表明，LIS蛋白質(zhì)存在明顯的疏水區(qū)和親水區(qū)，其中第94位最高，為2.2；第50位最低，為-2.8，表明LIS蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)(圖5)。

圖5 杜鵑花LIS蛋白質(zhì)疏水性/親水性預測Fig.5 Prediction of the hydrophobic/hydrophilic of LIS in Rhododendron

2.2.3 LIS蛋白質(zhì)磷酸化修飾預測 NetPhos分析表明，杜鵑LIS蛋白存在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸3個磷酸化位點(圖6)，其中絲氨酸磷酸化位點44個，蘇氨酸磷酸化位點35個，酪氨酸磷酸化位點24個。

圖6 杜鵑花LIS蛋白質(zhì)氨基酸翻譯后磷酸化修飾預測Fig.6 Prediction of phosphorylation site after amino acid translation of LIS protein in Rhododendron

2.2.4 LIS蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測 分析杜鵑LIS編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，有393個氨基酸參與形成α-螺旋，占總氨基酸的62.58%；有173個氨基酸參與形成無規(guī)則卷曲，占總氨基酸的27.55%；有37個氨基酸參與形成延伸鏈，占總氨基酸的5.89%；有25個氨基酸參與形成β-轉(zhuǎn)角，占總氨基酸的3.98%(圖7)。表明杜鵑花LIS基因的編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中含有豐富的α-螺旋和無規(guī)則卷曲；利用Swiss-Model工具對杜鵑花LIS基因的編碼蛋白質(zhì)進行三級結(jié)構(gòu)建模，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中選擇與LIS蛋白質(zhì)序列一致性最高的蛋白質(zhì)為模板進行同源模建，得到杜鵑LIS蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型。與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果相符，含有大量α-螺旋和不規(guī)則卷曲(圖8)。

注:橫軸表示氨基酸位置;藍色區(qū)域表示α-螺旋;紫色區(qū)域表示無規(guī)則卷曲;紅色區(qū)域表示延伸鏈;綠色區(qū)域表示β-轉(zhuǎn)角。Note:Horizontal axis indicated amino acid position.The blue part indicated alpha helix.The purple indicated random coil.The red part indicated extended strand.The green part indicated beta turn．圖7 杜鵑花LIS 蛋白二級結(jié)構(gòu)預測Fig.7 The prediction of LIS secondary structure in Rhododendron

圖8 杜鵑花LIS 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預測Fig.8 Prediction of the three-dimensional structure of LIS protein in Rhododendron

2.3 LIS蛋白質(zhì)序列的同源性和系統(tǒng)進化分析

利用DNAMAN軟件對杜鵑花與其他物種LIS基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸進行同源性比對，結(jié)果如圖9所示，杜鵑花與其他物種蛋白質(zhì)氨基酸序列中均含有天冬氨酸富集區(qū)域(DDxxD)，但存在長度差異性和組成變異性，杜鵑RhLIS與桂花、麻瘋樹、萵苣LIS蛋白質(zhì)氨基酸序列相似性分別為56.35%、57.96%、53.44%。為研究杜鵑花與其他物種LIS的進化關(guān)系，根據(jù)15個LIS基因的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。由圖10可知，杜鵑花LIS蛋白質(zhì)與桂花的關(guān)系最近，其次與萵苣、向日葵的關(guān)系較為接近。

注:Rh:杜鵑；Of:桂花；Jc:麻瘋樹；Ls:萵苣；Ha:向日葵。方框中為DDxxD結(jié)構(gòu)域。Note:Rh:Rhododendron simsii Planch. Of:Osmanthus fragrans. Jc:Jatropha curcas. Ls:Lactuca sativa. Ha:Helianthus annuus. The DDxxD domain was showed by box.圖9 杜鵑花與其他植物LIS蛋白質(zhì)氨基酸序列的多重比較Fig.9 Multiple alignment of deduced LIS amino acids sequences from Rhododendron and other plants

圖10 杜鵑花LIS與其他物種LIS蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進化樹Fig.10 Phylogenetic tree of LIS proteins in Rhododendron and other species

2.4 云錦杜鵑不同花期的花瓣及其他組織中LIS基因的表達水平分析

由圖11-A可知，LIS基因在不同組織中均有表達，在4個花期的花瓣中，LIS基因的表達水平呈先上升后下降的變化趨勢，且在盛開期表達量最高，這與花香揮發(fā)物質(zhì)釋放的規(guī)律相符合；在盛開期的花蕊中，雄蕊中LIS基因的表達水平遠高于雌蕊，高達17.5倍；幼葉的LIS基因的表達水平高于老葉，高達35倍。在盛開期，花瓣(花苞期+半開期+盛開期+衰敗期)中的表達量顯著高于花蕊，在雄蕊中也有相對較高的表達量，其次為雌蕊，表達量最低的是老葉。

2.5 云錦杜鵑不同花期花瓣及其他組織中芳樟醇含量

根據(jù)SPME-GC-MS分析結(jié)果，云錦杜鵑不同開花期花瓣及其他組織的芳樟醇含量的測定值如圖11-B。結(jié)果表明，在云錦杜鵑4個花期的花瓣中，芳樟醇含量呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，與LIS基因的表達水平變化趨勢相一致，在半開期含量最高；在盛開期的花蕊中，雌蕊的芳樟醇含量高于雄蕊；在盛開期，花瓣中芳樟醇的含量顯著高于花蕊；此外，幼葉中芳樟醇的含量低于半開期的花瓣。

2.6 相關(guān)性分析

云錦杜鵑不同花期的花瓣及其他組織中LIS基因表達水平和芳樟醇含量的相關(guān)系數(shù)為0.827，表明杜鵑LIS基因與芳樟醇的合成密切相關(guān)，推測LIS參與了芳樟醇的生物合成。

3 討論

花香是觀賞植物的重要性狀之一，植物體主要通過過氧化物酶體、細胞質(zhì)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway,MVA)和質(zhì)體中的2-甲基-D赤蘚糖醇-4-磷酸途徑(methylerythritol-4-phosphate pathway,MEP)，合成單帖、倍半萜、二萜等化合物[24]。近年來，通過對香氣植物中花香化合物成分以及合成機制的深入探究，從仙女扇[25]、金魚草(Antirrhinummajus)[26]及其他植物中分離純化出花香合成途徑的關(guān)鍵基因，發(fā)現(xiàn)LIS基因的表達與芳樟醇的含量密切相關(guān)；Lucker[27]在煙草植株中轉(zhuǎn)入3個單萜合酶基因，轉(zhuǎn)化植物體的產(chǎn)物中萜烯類物質(zhì)β-蒎烯、檸檬烯和芳樟醇等香氣化合物的含量顯著上升，達到人類嗅覺感知范圍，由此證明通過基因工程可以改良花香性狀。

本研究中，杜鵑花LIS編碼蛋白質(zhì)中含有Isoprenoid-Biosyn-C1 superfamily超家族序列，且含有典型的天冬氨酸富集模體(DDxxD)結(jié)構(gòu)，這與小蒼蘭[28]、薰衣草(Lavandulaangustifolia)[29]和丁香(Syzygiumaromaticum)[30]的研究結(jié)果相同。通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，杜鵑LIS蛋白質(zhì)與桂花、萵苣聚為一小支，與仙女扇和雞血藤聚為一大類，在保持物種特異性的同時可能具有類似的生物學功能。本研究還發(fā)現(xiàn)，云錦杜鵑花瓣中LIS基因相對表達量呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，在盛開期最高，這與百合[13]和桂花[31]的研究結(jié)果一致，同時雄蕊中LIS基因相對表達量遠高于雌蕊，但是芳樟醇含量低于雌蕊。在不同花期的花瓣中，芳樟醇的含量呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，該結(jié)果與章辰飛等[16]的研究結(jié)果相同，但是衰敗期花瓣中芳樟醇含量略有不同，可能與不同時期樣品的差異有關(guān)，從而導致不同批次花瓣中芳樟醇的相對含量與絕對含量變化趨勢不同。本研究中芳樟醇的含量變化與LIS基因表達水平變化趨勢相同，但是與前人研究相比最高值提前了一個花期，芳樟醇在半開期的花瓣中含量最高，可以推測半開期與盛開期的芳樟醇含量變化與杜鵑花花瓣吸引昆蟲授粉具有重要關(guān)聯(lián)。

注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note：Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level.圖11 云錦杜鵑不同花期的花瓣及花蕊LIS基因表達量與芳樟醇含量分析Fig.11 Expression analysis of LIS gene and linalool content in petals and other tissues of Rh. fortunei in different flowering stages

在云錦杜鵑中，LIS基因表達量產(chǎn)生巨大差異的原因可能與組織特異性相關(guān)，植物中香氣化合物主要通過花瓣進行合成和排放調(diào)節(jié)，盡管在其他組織中(例如萼片、雄蕊、雌蕊和蜜腺)也有部分香氣化合物的形成[32]；此外，花瓣相較于花蕊擁有更大的空氣接觸面積，但是在吸引昆蟲傳粉和授粉過程中，葉片并不是主要的香氣貢獻者。本研究克隆出云錦杜鵑中LIS基因，可以在后續(xù)研究中進一步確定其上游啟動子的序列和功能，通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控目標基因在時間和空間上的特定表達，最終改變花香化合物的組成與含量，完成花香植物新種質(zhì)的創(chuàng)制，但該設(shè)想尚需要通過遺傳轉(zhuǎn)化等方法進行驗證。此外，本研究在云錦杜鵑中只克隆得到1個LIS基因，在杜鵑花中是否存在LIS家族基因，仍需進一步研究。今后可進一步分析杜鵑花中花香合成途徑中物質(zhì)交換及關(guān)鍵基因的表達模式，為探明杜鵑花中LIS基因調(diào)控芳樟醇生物合成的機理提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究通過RT-PCR和RACE技術(shù)首次從云錦杜鵑中克隆獲得LIS基因全長cDNA序列，ORF序列長度為1 887 bp，編碼628個氨基酸，生物信息學分析表明，杜鵑花LIS基因編碼1個酸性、帶負電荷的穩(wěn)定親水性蛋白質(zhì)，屬于Isoprenoid-Biosyn-C1 superfamily超家族，具有典型的DDxxD結(jié)構(gòu)。LIS基因在云錦杜鵑不同花期的花瓣及其他組織中均有表達，但表達量表現(xiàn)出較大的差異性，云錦杜鵑中LIS基因相對表達量與香氣釋放規(guī)律一致，呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢；不同部位中，花瓣LIS基因相對表達量高于花蕊，幼葉高于老葉，具有組織特異性。對比芳樟醇含量變化趨勢發(fā)現(xiàn)，杜鵑LIS基因表達水平與芳樟醇含量及香氣變化密切相關(guān)。本研究結(jié)果為進一步探究杜鵑花LIS基因的功能奠定了基礎(chǔ)，也為今后改良杜鵑花香氣化合物的成分、提高花香質(zhì)量和觀賞價值提供了參考。