劉敏清 何翃閎 潘陽陽 張慧珠 王亞營 楊珊珊 崔 燕 余四九

(甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院/甘肅省牛羊胚胎工程技術研究中心,甘肅 蘭州 730070)

牦牛(Bosgrunniens)是生活在高寒低氧環(huán)境的原始牛種之一，可在嚴寒和饑餓環(huán)境中進行正常的生命活動[1]。在高海拔地區(qū)，牦牛不僅承擔著農牧民的農耕勞作，還發(fā)揮著必要的運輸作用，是高海拔地區(qū)農牧發(fā)展的重要畜種[2]。但牦牛的生產性能較低，繁殖周期為三年兩胎或兩年一胎，極大影響了牦牛資源的利用。因此，與牦牛生殖繁育功能有關的基因或蛋白具有很重要的研究意義。

熱休克蛋白(heat shocks proteins，HSPs)是一組能夠逆轉或抑制細胞蛋白質在高溫應激下變性或去折疊的蛋白質[3]。當生物體受到環(huán)境脅迫時，HSP作為分子伴侶在蛋白質的形成中發(fā)揮著重要作用，且極大地增加了細胞對各類應激的生理耐受性[4]。根據分子量的大小和同源程度可將其分為小分子量HSP(15～30 kDa)、HSP60(30～70 kDa)、HSP70(30～70 kDa)、HSP90(大于80 kDa)、HSP110(大于80 kDa)和泛素6個家族，普遍存在于動物體內[5]。作為小分子量熱休克蛋白亞家族的重要代表成員之一，熱休克蛋白27(heatshockproteins27，HSP27)是一種可以抑制細胞凋亡的凋亡調節(jié)因子[6]。有研究表明，雌性卵巢內促凋亡因子和抗凋亡因子之間存在著不平衡關系[7]，這種關系與雌性生殖有重要聯系。在細胞沒有受到脅迫時，HSP27主要以無活性的大聚合體形式存在且表達量較低；當細胞受到脅迫時，HSP27會發(fā)生磷酸化反應被激活，從而促進蛋白質的正確折疊、組裝和糾正蛋白質的錯誤結構等一系列生物學功能，同時表達量增加[8]。HSP27具有很強的抗凋亡特性，通過與凋亡途徑中caspase介導激活的成分直接作用，在凋亡相關損傷中發(fā)揮保護作用[9-10]。早期的研究表明HSPs在受精和附植前對卵子、精子和胚胎發(fā)生發(fā)育都有重要作用[11]。近年來有研究發(fā)現，HSP27在人卵母細胞中可以表達，并在卵母細胞的發(fā)育過程中發(fā)揮作用[12]。在小鼠體內，當HSP27下調時可促進小鼠卵母細胞成熟，同時通過激活外源性caspase 8介導的凋亡途徑，促進卵母細胞早期凋亡，HSP27的下調與卵母細胞成熟呈正相關[13]。卵母細胞的正常發(fā)育、成熟以及早期凋亡等生理活動中均有HSP27的參與，其中過表達的HSP27并不影響受精率，反而提高了卵母細胞的胚胎發(fā)育潛能[14]。隨著熱休克蛋白進入人們的視野，其諸多功能逐漸被證實，其在胚胎發(fā)育中的功能研究也相應增加。例如研究發(fā)現HSP27在人類胚胎發(fā)育早期就有表達，HSP27的表達在細胞、分化、分裂和凋亡中發(fā)揮著重要作用[15-16]。Bahr等[17]研究表明，在羊的生殖生理過程中，子宮內發(fā)育比較遲緩的羊胎兒，HSP27的表達逐漸增加。同時有研究表明，過表達HSP27在卵巢細胞成熟過程中可以維持細胞的穩(wěn)定性，同時提高細胞對熱應激的耐性能力，從而發(fā)揮對細胞的保護和抑制凋亡作用[18-20]。本課題組前期研究發(fā)現，牦牛HSP27基因在牦牛黃體期的各個主要生殖器官中存在表達差異，而HSP27的表達在妊娠期子宮、輸卵管和卵巢中呈現顯著降低趨勢，可見HSP27基因在雌性牦牛生殖器官中發(fā)揮了一定的作用[21-22]。

以上研究表明，HSP27對于哺乳動物胚胎的發(fā)生發(fā)育發(fā)揮著重要作用，由此推測HSP27基因在牦牛妊娠調控等繁殖生理過程中具有重要意義。孤雌激活是指處于第二次減數分裂中期的成熟卵母細胞不經過精子受精作用，而在某些理化因素的刺激下繼續(xù)生長發(fā)育的過程，包括恢復并完成第二次減數分裂，發(fā)生卵裂形成早期胚胎[23]。卵母細胞的體外培養(yǎng)孤雌激活技術是研究哺乳動物受精機制以及其孤雌生殖的重要方法之一，也是研究細胞核移植的關鍵技術[24]。目前，國內外尚鮮見關于HSP27在牦牛卵母細胞和胚胎中表達的報道。本研究以牦牛為未成熟卵母細胞、成熟卵母細胞以及孤雌激活2～4細胞期、5～8細胞期、桑椹期和囊胚期的胚胎作為研究對象，通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)和免疫熒光染色法研究牦牛HSP27在牦牛卵母細胞以及不同時期孤雌激活胚胎中是否存在表達差異，旨在為后續(xù)探討HSP27在牦牛卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品采集

根據牦牛發(fā)情季節(jié)于2019年8-9月在青海西寧樂家灣屠宰場，在確保無菌環(huán)境下采集完整的牦牛卵巢，置于含有雙抗(100 IU·mL-1青霉素和0.05 mg·mL-1鏈霉素)的25～30℃的生理鹽水中，短時間內送回實驗室；用35℃含100 IU·mL-1青霉素和0.05 mg·mL-1鏈霉素的無菌生理鹽水清洗3～5次，使用帶有18號針頭的一次性塑料注射器，在無菌條件下采集卵巢表面凸起且直徑為2～8 mm之間發(fā)育卵泡中的卵泡液和卵母細胞，在BX51-DP71體視顯微鏡(日本Olympus公司)下選擇外在形態(tài)大小均一、無異常形態(tài)，被緊密排列的卵丘細胞緊密包裹的卵丘-卵母細胞復合體(cumulu-oocyte complex,COCs)。

1.2 卵母細胞培養(yǎng)

在體式顯微鏡下，使用無菌采卵針將選擇出的優(yōu)良COCs在培養(yǎng)皿中清洗3次，清洗液為添加有5% 胎牛血清胎(fetal bovine serum，FBS)(美國Hyclone公司)的杜氏磷酸鹽緩沖液(Dulbecco’s phosphate buffered saline,DPBS)溶液。提前在培養(yǎng)箱(5% CO2、38℃)中預平衡成熟液[10% FBS +卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液(TCM199)+100 μg·mL-1雌二醇+100 μg·mL-1促黃體素+100 μg·mL-1促卵泡素+100 μg·mL-1鏈霉素+100 μg·mL-1青霉素]，再將COCs放置于成熟液中培養(yǎng)，三氣培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)設定的培養(yǎng)條件為濕度飽和、CO2濃度5%及溫度38℃。培養(yǎng)至卵母細胞內第一極體出現，認為是卵母細胞的成熟標志。

1.3 卵母細胞的孤雌激活及胚胎的培養(yǎng)

使用DPBS液將體外培養(yǎng)成熟的牦牛卵母細胞清洗3～4次，后將成熟的卵母細胞在培養(yǎng)液(添加有1‰的透明質酸酶)進行消化并用采卵針緩慢吹打，實時觀察卵母細胞與卵丘細胞是否分離，直至成為不含有卵丘細胞的卵母細胞，將卵母細胞在添加有FBS的DPBS溶液中用采卵針清洗3～4次。選擇形態(tài)正常、胞質均一、卵周隙明顯且排出第一極體的卵母細胞，將其在離子霉素液滴中平衡5 min，借助BTX-450的電融合槽(BTx，美國)的作用將平衡后的卵母細胞進行激活，用TCM199液繼續(xù)清洗激活后的卵母細胞，最后將卵母細胞培養(yǎng)于6-甲基氨基嘌呤(6-Dimethylaminopurin,6-DMAP)(2 mmol·L-1)的微滴液中4 h，使卵母細胞完全激活。

用采卵針將激活后培養(yǎng)的卵母細胞轉移至SoFaa培養(yǎng)液(石蠟油覆蓋，提前在培養(yǎng)箱內平衡2 h)，在每個100 μL 的液滴里約有20個激活后的卵母細胞，將激活后的卵母細胞轉移至培養(yǎng)箱(飽和濕度、5% CO2、38℃)中培養(yǎng)，根據胚胎各時期發(fā)育所需時間，記錄培養(yǎng)時間并于具體時間收集各時期胚胎并保存。

1.4 試驗引物的設計

根據GenBank數據庫中公布牛HSP27基因的編碼區(qū)，選擇GAPDH為內參基因，應用Primer Premier 5.0 軟件設計特異性引物。本試驗所涉及引物均由北京華大合成。

表1 引物序列及長度Table 1 Primer sequence and length

1.5 各時期樣品RNA提取及RNA反轉錄

將未成熟卵母細胞、成熟卵母細胞(每個試驗組各50個)以及體外培養(yǎng)孤雌激活不同時期的胚胎組(每個試驗組各20枚胚胎)，用PBS緩慢清洗3次，用微量樣品RNA提取試劑盒(美國Omega公司)，分別提取未成熟卵母細胞、成熟卵母細胞以及孤雌激活各時期胚胎總RNA，再使用Go ScriptTMReverse Transcription System(美國Promega公司)將RNA反轉錄成cDNA模板，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 牦牛HSP27基因的擴增

以反轉錄后未成熟卵母細胞、成熟卵母細胞以及體外培養(yǎng)孤雌激活不同時期胚胎的cDNA為反應模板，分別以GAPDH和HSP27為反應引物，進行PCR。PCR總反應體系為20 μL：Taq PCR Master Mix 10 μL，無菌去離子水8 μL，模板1 μL，上下游引物各0.5 μL。PCR反應條件：95℃預變性4 min；95℃變性30 s；60℃退火30s；72℃延伸25 s(HSP27)或15 s(GAPGH)，35個循環(huán)；72℃終延伸10 min，4℃保存。應用10 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳對產物進行檢測。

1.7 qRT-PCR檢測HSP27基因的表達

引物HSP27和引物GAPDH對HSP27基因在牦牛未成熟卵母細胞、成熟卵母細胞以及不同時期孤雌激活胚胎中的表達水平使用實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche生物)進行檢測。將牦牛未成熟卵母細胞、成熟卵母細胞以及體外培養(yǎng)孤雌激活不同時期胚胎分為6試驗組別，每個組分別有試驗孔、內參孔和空白孔。qRT-PCR總反應體系為20 μL：模板1 μL、SYBR Premix Dimer EraserTM(2×)[寶生物工程(大連)有限公司TaKaRa]10 μL、無菌去離子水 7.4 μL、上下游引物各0.8 μL。反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性4 s，60℃退火34 s，40個循環(huán)。反應檢測各試驗組熔解曲線，每組重復進行3次。使用統計學SPSS21.0 軟件對試驗數據進行處理分析，HSP27基因的相對表達量用2-ΔΔCt法計算。

1.8 免疫熒光染色檢測HSP27蛋白的表達

在室溫條件下，將牦牛未成熟卵母細胞、成熟卵母細胞以及體外培養(yǎng)孤雌激活不同時期胚胎分別使用免疫染色固定液固定0.5 h，用免疫染色洗滌液清洗各試驗組樣品。免疫染色封閉液分別封閉各試驗組樣品0.5 h，將牦牛未成熟卵母細胞、成熟卵母細胞以及不同時期的孤雌激活胚胎放置于HSP27抗體(ab79868，美國Abcam公司)中4℃過夜，清洗3次，山羊抗鼠的二抗IgG(北京博奧森生物技術有限公司)(1∶100 稀釋)孵育1 h，清洗3次，最后封片。在BX51-DP71熒光倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察6組試驗組免疫熒光染色結果并拍照。

2 結果與分析

2.1 卵母細胞及不同時期孤雌激活胚胎在的培養(yǎng)

通過倒置相差顯微鏡觀察牦牛卵母細胞以及體外培養(yǎng)孤雌激活不同時期胚胎的發(fā)育情況(圖1)。牦牛未成熟卵母細胞、成熟卵母細胞以及胚胎的發(fā)生發(fā)育情況均較好，挑選發(fā)育較好的牦牛未成熟卵母細胞、成熟卵母細胞以及體外培養(yǎng)2～4細胞期胚胎、5～8細胞期胚胎、桑椹胚和囊胚期的胚胎，分別收集6個試驗組樣品并保存于-80℃超低溫冰箱，以備后續(xù)試驗使用。

注：A：未成熟卵母細胞；B：成熟卵母細胞；C：2～4細胞期；D：5～8細胞期；E：桑椹胚；F：囊胚期胚胎。標尺為200 μm。Note:A:Immature oocytes.B:Mature oocytes.C:2～4 cell.D:5～8 cell.E:Mulberry embryo.F:Blastocyst embryo.Bar is 200 μm.圖1 牦牛卵母細胞及孤雌激活各時期胚胎發(fā)育情況Fig.1 Embryo development of yak oocytes and parthenogenetic activation

2.2 HSP27基因在牦牛卵母細胞及孤雌激活不同時期胚胎中的擴增

使用10 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果見圖2。圖2-A為HSP27基因的擴增產物，其明顯條帶出現在182 bp處，與設計產物長度大小基本一致。圖2-B為GAPDH基因的擴增產物，大小為129 bp，驗證了反轉錄所得cDNA模板可用于后續(xù)試驗。

注：M：DL2000 DNA相對分子質量標準；1:未成熟卵母細胞；2：成熟卵母細胞；3:2～4細胞期胚胎；4:5～8細胞期胚胎；5：桑椹胚；6：囊胚期。Note:M:DL2000 DNA Marker.1:Immature oocytes.2:Mature oocytes.3:2～4 cell.4:5～8 cell.5:Mulberry embryo.6:Blastocyst embryo.圖2 HSP27 和 GAPDH基因擴增Fig.2 HSP27 and GAPDH gene amplification

2.3 qRT-PCR檢測牦牛HSP27基因的表達

qRT-PCR分析結果表明，HSP27和GAPDH基因PCR產物的退火溫度值都比較單一，有單一的熔解峰。由圖3可知，HSP27基因在牦牛未成熟卵母細胞、成熟卵母細胞以及體外培養(yǎng)孤雌激活不同時期胚胎中均可表達，其中在卵母細胞中，未成熟卵母細胞表達量顯著高于成熟卵母細胞的表達量(P<0.05)。在胚胎時期，表達量最高是體外培養(yǎng)孤雌激活2～4細胞期胚胎，表達量最低是囊胚期胚胎，隨著胚胎的不斷發(fā)育，HSP27的表達量逐漸降低；在體外培養(yǎng)孤雌激活2～4細胞期胚胎和囊胚期胚胎中的表達分別與其他組相比差異顯著，而在體外培養(yǎng)孤雌激活5～8期胚胎和桑椹胚之間的表達差異不顯著。

卵母細胞及孤雌激活各時期細胞Yak oocytes and parthenogenetic activation注：不同字母之間表示差異性顯著(P<0.05)。下同。Note:Different letters indicate significant differences at 0.05 level.The same as following.圖3 牦牛HSP27基因的表達水平Fig.3 Expression level of yak HSP27 gene

2.4 免疫熒光染色檢測牦牛HSP27在卵母細胞及孤雌激活不同時期胚胎中的分布及表達

免疫熒光染色結果顯示，HSP27蛋白在牦牛卵丘細胞和卵母細胞中均有表達，在體外培養(yǎng)孤雌激活2～4細胞期胚胎、5～8細胞期胚胎和桑椹胚中主要存在于細胞核內和細胞質中，在囊胚期主要存在于細胞核中(圖4)。HSP27蛋白在牦牛未成熟卵母細胞、成熟卵母細胞以及體外培養(yǎng)孤雌激活不同時期胚胎中均有表達，其中在卵母細胞時期，未成熟卵母細胞表達量顯著高于成熟卵母細胞的表達量。在胚胎時期，HSP27蛋白表達量最高是在體外培養(yǎng)孤雌激活2～4細胞期胚胎中，表達量最低是在體外培養(yǎng)孤雌激活囊胚期胚胎中，伴隨著胚胎的不斷發(fā)育，HSP27蛋白的表達量逐漸降低(圖5)。

注:標尺=50 μm。DAPI：4’-6-二脒基-2苯基吲哚Note:Bar=50 μm.DAPI:4’-6-diamidino-2-phenylindole圖4 牦牛卵母細胞及孤雌激活不同時期胚胎中HSP27蛋白的分布Fig.4 Distribution of HSP27 protein in yak oocytes and parthenogenetic embryos at different stages

卵母細胞及孤雌激活各時期細胞Yakoocytes and partheogenetic activation圖5 牦牛HSP27蛋白的表達水平Fig.5 Expression levels of yak HSP27 protein

3 討論

哺乳動物卵母細胞成熟是決定胚胎發(fā)育的重要因素之一。近年來，人們對體外培養(yǎng)的卵母細胞早期凋亡與卵母細胞發(fā)育能力的關系進行了大量研究。研究表明，卵母細胞早期凋亡相反地降低了卵母細胞的發(fā)育能力[25]。在正常卵巢組織內，隨著卵母細胞的發(fā)育，卵巢中HSP27的表達降低[26]。本試驗中，HSP27在牦牛未成熟卵母細胞在基因和蛋白水平均高于成熟卵母細胞，這與前人研究結果一致。同時發(fā)現了卵母細胞的發(fā)育與其周圍的顆粒細胞是相互依賴的[15]，由于關于HSP27在卵母細胞中的作用的報道很少，推測這一點可能與卵丘顆粒細胞有關。

熱休克蛋白(HSPs)是哺乳動物胚胎發(fā)育過程中最先產生的蛋白質之一，其表達是哺乳動物胚胎發(fā)育優(yōu)化的必要條件[27]。哺乳動物胚胎發(fā)育以細胞快速生長和分化為特征，需要表達多種HSPs才能使胚胎發(fā)育達到最佳狀態(tài)[28]。自發(fā)的、結構性的HSP70表達開始于合子基因組活動，在2細胞早期，可誘導的HSP70表達和其他類熱休克蛋白表達的形成似乎受到發(fā)育調控[29]。Rylander等[30]研究表明，在應激源的作用下，哺乳動物胚胎中HSPs的表達升高，且相關蛋白合成及功能減弱。還有研究表明，在囊胚期胚胎中，熱休克蛋白Grp78的表達呈現出較高水平，這一點可能與胚胎的生理代謝變化有關，由于哺乳類動物胚胎對培養(yǎng)環(huán)境非常敏感，保持穩(wěn)定的培養(yǎng)條件非常重要[31]。隨著胚胎的發(fā)育，HSPs表達呈現降低趨勢，這可能是因為HSPs增加了胚胎對外環(huán)境各種有害刺激應對的敏感性，例如溫度升高、氧化應激等[32]。關于水牛胚胎中HSP70基因特征和表達的研究指出，卵母細胞成熟培養(yǎng)及附植前體外胚胎發(fā)育時可用HSP70作為生物因素優(yōu)化胚胎培養(yǎng)條件[33]。還有研究發(fā)現，HSP70表達被抑制后可降低囊胚的發(fā)育率，證實HSPs在胚胎發(fā)育中的表達對胚胎起到了保護作用。研究表明，HSPs的表達量量與動物體胚胎的附植和胚胎毒性有關[34-35]。Walsh等[36]發(fā)現，HSP27的上調可能是細胞生長停滯和分化的必要條件。Mehlen等[37]發(fā)現，HSP27表達不足導致分化流產，這是由于細胞凋亡導致的整體死亡。Arrigo[38]發(fā)現，HSP27的表達與細胞分化和凋亡之間的平衡有關，與細胞增殖階段無關。本研究發(fā)現，牦牛HSP27表達量最高是在體外培養(yǎng)孤雌激活2～4細胞期胚胎中，表達量最低是在囊胚期胚胎中，伴隨著胚胎的不斷發(fā)育，HSP27的表達量逐漸降低，同時在體外培養(yǎng)孤雌激活2～4細胞期胚胎和囊胚期胚胎中的表達差異顯著，說明HSP27的表達與胚胎發(fā)育有重要聯系。以上研究均證實HSP27在卵母細胞成熟和附植前體外胚胎發(fā)育過程中有重要的作用。

免疫熒光染色結果表明，HSP27蛋白在牦牛卵母細胞中有表達，同時在體外培養(yǎng)孤雌激活2～4細胞期胚胎、5～8細胞期胚胎和桑椹胚細胞核和細胞質中均有表達，在囊胚期主要在細胞核中表達。有研究表明，HSP27蛋白隨著胚胎的不斷發(fā)育，其表達從細胞質逐漸轉移至細胞核，這與本研究結果基本一致，可能是因為HSP27蛋白降低了胚胎細胞核對外界各種有害刺激的敏感性，從而促進了胚胎發(fā)育[30]。劉姍[39]研究發(fā)現，HSP27表達定位于小鼠早期胚胎發(fā)育的不同時期胚胎的細胞核和細胞質內，未在核仁中表達，本試驗結果與上述研究一致。綜上所述，在哺乳動物牦牛胚胎發(fā)育的生理過程中HSP27發(fā)揮重要作用。

4 結論

本研究發(fā)現HSP27基因在牦牛未成熟卵母細胞、成熟卵母細胞以及孤雌激活不同時期胚胎中均有表達。免疫熒光染色顯示HSP27蛋白在牦牛未成熟卵母細胞、成熟卵母細胞中有表達，在體外胚胎孤雌激活2～4細胞期胚胎、5～8細胞期胚胎和桑椹胚中主要存在于細胞核內和細胞質中，而在囊胚期主要存在于細胞質中。表明HSP27在牦牛體外早期胚胎的發(fā)育具有潛在的調控作用。本研究為進一步明確HSP27在胚胎發(fā)育中的作用及機理提供了一定的理論依據。