黃凱美 鄒宜靜 施楊琪 應逸寧 顏韶兵 包勁松,,*

(1 杭州市農業(yè)技術推廣中心,浙江 杭州 310017；2 浙江大學農學院應用生物科學系,浙江 杭州 310058；3 浙江大學原子核農業(yè)科學研究所,浙江 杭州 310058)

南瓜屬(Cucurbita，2n=2x=40)是葫蘆科植物中果實性狀最具多態(tài)性的屬，共包括30余種，其中中國南瓜(C.moschatoDuch)、美洲南瓜(C.pepoL.)、印度南瓜(C.maximaDuch)是主要栽培種[1-2]。目前，我國是世界上最大的南瓜消費國和生產國[2]，但南瓜作為一個小種類的蔬菜，遺傳與育種研究仍較為缺乏[3]。因此，開展關于南瓜品質和產量方面的研究對南瓜品種改良具有重要意義。

我國南瓜種質資源豐富，為南瓜育種工作的開展提供了必要的物質基礎[4]。20世紀90年代后期，一些科研單位以地方品種蜜本南瓜為主要親本，開展了中國南瓜的育種工作[3]。印度南瓜的引進也促進了我國印度南瓜的育種研究，在新品種培育方面取得了一些重要進展[4]。但是由于不同地區(qū)間頻繁引種及自繁自育，導致現有南瓜品種間品系交錯、親緣關系混雜，“同名異物”與“同物異名”現象屢見不鮮[5-6]。隨著地方品種收集工作的有效開展，發(fā)現眾多地方品種與育成品種間的親緣關系尚缺乏研究[7]。

簡單序列重復(simple sequence repeat,SSR)標記，又稱微衛(wèi)星標記[8]，是一種由幾個核苷酸(一般小于6個)為重復單位形成的分子標記。SSR標記具有出現頻率高、多態(tài)性豐富、檢測手段簡單、檢測結果重復性好等優(yōu)點，被廣泛應用于遺傳多樣性分析、親緣關系分析、品種鑒定等研究領域[9-10]。隨著南瓜基因組信息的測定和公開，大量SSR標記被開發(fā)并應用于南瓜品種的遺傳多樣性研究。王洋洋等[11]對印度南瓜進行了轉錄組測序分析，共檢測到12 557個SSR位點，分布于131 960條基因中；隨后選取20對引物分析30份南瓜材料的遺傳多樣性，發(fā)現14對引物可擴增出產物，11對引物具有多態(tài)性。朱海生等對美洲南瓜[12]和中國南瓜[13]進行轉錄組測序分析，分別檢測到7 478和5 407個SSR位點，分布于5 786和4 348條基因中，并選取部分引物剖析了美洲南瓜和中國南瓜的遺傳多樣性。武向斌[14]從南瓜、西瓜、黃瓜、甜瓜、苦瓜、絲瓜、冬瓜基因組中開發(fā)出種間SSR標記，發(fā)現96對引物中有87對在葫蘆科的7個種中具有良好的通用性。

本研究采用SSR標記分析35份南瓜品種的遺傳多樣性，特別是浙江地方品種十姐妹南瓜、上海地方品種黃狼南瓜、廣東地方品種密本南瓜與其他育成品種間的遺傳關系，以期揭示南瓜品種間的遺傳差異及親緣關系，為南瓜的新品種選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用的35份南瓜品種來自湖南、北京、浙江、廣東、上海、山東、安徽、河北、遼寧9個省市，包含印度南瓜、中國南瓜、美洲南瓜3個主要栽培種(表1)。所有供試材料于2020年8月10日在杭州臨安區(qū)板橋鎮(zhèn)杭州錦興農業(yè)開發(fā)有限公司基地種植，常規(guī)水肥管理。于2020年秋季收獲成熟期果實。

表1 試驗所用南瓜品種及其主要農藝性狀Table 1 The major agronomic traits of squash accessions used in this study

表1(續(xù))

1.2 試驗方法

1.2.1 性狀調查 分別在營養(yǎng)生長期和開花期開展農藝性狀調查，每個品種隨機取10株進行測量，同時記錄開花較早或較遲、抗病性好的品種。成熟期每個品種隨機收取10個果實考查果實性狀。性狀調查參照《南瓜種質資源描述規(guī)范和數據標準》[15]，數量性狀用平均值表示(表1)。

1.2.2 DNA提取 采用改良的CTAB法[16]提取南瓜葉片的基因組DNA：裁剪南瓜葉片約0.5 g，洗凈后保存在-20℃冰箱中備用。加入適量液氮將葉片研磨成粉，轉入1.5 mL的離心管中。離心管中加入600 μL預熱至65℃、濃度為20 g·kg-1的CTAB提取緩沖液，旋渦振蕩混勻。將離心管置于65℃水浴鍋提取30 min，期間每隔10 min輕輕搖晃離心管，使之充分混勻；取出離心管冷卻2 min后，12 000 r·min-1離心10 min，轉移上清液至新離心管中，加入600 μL氯仿，輕輕搖勻；12 000 r·min-1離心10 min，轉移上清至含有乙醇的離心管中，將離心管上下顛倒混合均勻，此時有絮狀DNA產生；12 000 r·min-1離心5 min，小心棄去上清液，保留底部DNA沉淀，加入無菌水使DNA溶解后，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR與電泳 SSR引物序列見表2，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR采用10 μL反應體系，由5 μL 2×PCR Mix、1 μL DNA模版(100 ng)、0.5 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL及3 μL雙蒸水組成。PCR反應程序為：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產物在100 g·kg-1的非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，緩沖液為0.5×TBE，恒壓120 Ⅴ，電泳時間視產物片段大小決定。取出凝膠后用蒸餾水清洗2遍，在1.0 g·kg-1的硝酸銀溶液中染色5～7 min，用蒸餾水再次清洗2遍，用8.0 g·kg-1甲醛-10 g·kg-1氫氧化鈉溶液顯色5～7 min，蒸餾水清洗2遍后取出，掃描結果。

1.2.4 數據統計分析 根據電泳結果，統計各樣本的基因型。使用Powermarker V3.25[17]分析數據，利用非加權組平均法(unweighted pair group average method with arithmetic mean，UPMGA)進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 SSR標記檢測

利用43對SSR標記(表2)分析35份南瓜品種材料的遺傳多樣性和種群結構，每對引物在35份樣品間都能夠擴增出多態(tài)性條帶(表3)。43對SSR引物共檢測到155個等位基因，每個標記所檢測到的等位基因數為2～7個，平均為3.6個；主要等位基因頻率為0.308 8～0.928 6，平均為0.550 1。檢測到177個基因型，每對引物所檢測到的基因型為2～7個，平均為4.1個。43對引物基因型雜合度在0～0.823 5之間，平均值為0.199 2。SSR標記的多態(tài)信息含量(polymorphism information content,PIC)值在0.130 8～0.775 4之間，平均值為0.487 2?；蚨鄻有栽?.135 2～0.802 3之間，平均值為0.551 7。

表2 43對SSR引物序列Table 2 The primer sequences of 43 SSR markers

表2(續(xù))

試驗結果表明，所有SSR標記在35份南瓜品種間均具有較好的基因多樣性和較高的遺傳雜合性，但在區(qū)分不同類型南瓜品種間有所差別。例如，標記S78、n15不能區(qū)分品種PM01～PM12、PM14(圖1-A、B)；標記S78和S17不能區(qū)分品種PM15～PM17、PM19～PM29(圖1-A、D)；圖中所示4個標記都無法將品種PM34～PM37區(qū)分開，說明所列舉的分子標記在上述種內品種間沒有多態(tài)性，但是在不同種間存在多態(tài)性，即存在南瓜的種間特異性。目前，在本研究中未發(fā)現對全部供試品種均具有多態(tài)性的通用SSR分子標記。

注：引物分別為：A：S78；B：n15；C：S190；D：S17。Note:SSR markers:A:S78.B:n15.C:S190.D:S17.圖1 35份南瓜材料PCR產物電泳結果Fig.1 Electrophoresis images of 35 squash accessions with SSR markers

2.2 聚類分析

利用UPGMA聚類方法將43對SSR標記的擴增結果進行聚類分析，以確定35份供試南瓜品種間的親緣關系。結果表明，35份品種可以分為三大類，分別記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(圖2)。與表1中各樣品對應的南瓜品種對應，第Ⅰ類包含13個品種(PM01～PM12、PM14)，均為中國南瓜；第Ⅲ類包含5個品種(PM29～PM33)，為美洲南瓜；第Ⅱ類包含17個品種(PM15～PM17、PM19～PM28、PM34～PM37)，為印度南瓜。第Ⅰ類中，PM10與其他幾個品種的親緣關系最遠，SSR標記無法區(qū)分PM01和PM02。第Ⅱ類分為3個亞群，其中PM34～PM37與其他品種親緣關系最遠，PM26～PM28與其他品種親緣關系較遠。第Ⅲ類中PM31與PM33親緣關系較近，PM29、PM30、PM32親緣關系較近，為2個亞群。浙江省著名地方品種十姐妹南瓜(PM08)為中國南瓜，與PM04、PM06、PM07和PM11親緣關系較近。上海著名地方品種黃狼南瓜(PM12)為中國南瓜，與PM03親緣關系較近，與PM08親緣關系較遠。廣東省著名地方品種密本南瓜PM09是南瓜育種的重要材料，與廣東的香芋南瓜PM14親緣關系最近。

圖2 基于SSR標記的35份南瓜品種聚類分析Fig.2 Cluster tree of 35 squash accessions based on SSR markers

2.3 南瓜農藝性狀及果實性狀

第Ⅰ類(中國南瓜，PM01～PM12、PM14)都為蔓生，多在主蔓結瓜，PM09、PM12和PM14在側蔓結瓜。葉片多為掌狀，PM06、PM09和PM11為心臟五角狀，PM14為近圓形。莖都為五棱形。雌花萼片上部擴大成葉狀。果實形狀多樣，以梨形略多。果皮為深綠色或墨綠色，PM03、PM09、PM14披有不規(guī)則花紋。瓜面平滑，瓜肉色淡黃。果肉厚0.70～1.75 cm。以嫩果或老熟果供食用，嫩果采收時果重差異明顯，果重為393.5(PM07)～783.0 g(PM10)。品質性狀中口感大多為脆，肉質松軟和致密都較為常見。

第Ⅱ類南瓜(印度南瓜，PM15～PM17、PM19～PM28、PM34～PM37)包含的品種較多，整體性狀多樣，形態(tài)豐富，異質化程度高。所有品種都為蔓生，始花節(jié)位最高為34節(jié)，最低為13節(jié)。大多為主蔓結瓜，PM15～PM17為側蔓結瓜。葉形以掌狀為主，莖為近圓形。果實形狀多樣，其中扁圓形較為常見。瓜皮底色有灰綠色、綠色、深綠色、黑綠色、白色等，明顯或隱約有深綠色、淺綠色、灰綠色等斑紋。瓜面平滑，瓜肉色淡黃到黃色。果實體積不等，單果重203.5～1 306.0 g。質地以致密較多，口感多樣，以粉、面為主。

第Ⅲ類南瓜(美洲南瓜，PM29～PM33)為蔓生或矮生，始花節(jié)位多在12節(jié)或13節(jié)，且多在主蔓結瓜。葉形為近三角形，莖有棱或溝，瓜形大多為扁圓形。瓜皮顏色多樣性豐富，有白色、淡黃白色、淺綠、淺黃色或黃橙色帶縱條紋。瓜面平滑或多棱，果肉較厚，色白至淡黃。果實體積不等，PM29～PM31呈扁圓型果型小，單果重270.0～353.0 g，PM32、PM33分別呈橢圓形和圓筒形，單果重505.5～791.0 g。肉質致密、松軟，口感面、脆、粉均有。另外，PM29～PM31兼有觀賞價值。

3 討論

南瓜表型的多樣性使其能適應各種各樣的自然環(huán)境，從而在不同條件下進行種植，滿足食用、藥用、籽用、觀賞等栽培目的，具有極高的經濟價值[2-3,15]。因此，了解南瓜表型多樣性的遺傳信息對推進南瓜育種工作具有重要的意義。本試驗詳細調查了不同南瓜栽培品種間農藝性狀的差異，發(fā)現不同類群間在葉形、果形及果實質地等方面具有共同特點，為今后的育種工作提供了良好的研究基礎。在三大類中，每一類型都分別含有大果品種和小果品種，說明不同種之間及種內的不同品種之間都表現出了果實形狀及大小的多樣性。第Ⅰ類南瓜中，PM02、PM05、PM09長勢較好，PM03、PM07、PM10和PM11是早熟品種，PM02和PM05抗白粉病較強，可作為選育高產早熟高抗品種的親本。第Ⅱ類南瓜中，PM27和PM28結瓜較多，PM21、PM24和PM25綜合性狀優(yōu)良，可以作為群體品種參與育種。第Ⅲ類南瓜中，PM32、PM33和PM37節(jié)間短，可以作為親本育成矮化、耐肥品種。不同類型農藝性狀的多樣性有助于開展種間雜交，從而可以將不同種的優(yōu)異性狀結合起來，培育高產、優(yōu)質、多抗的南瓜新品種。如，將第Ⅰ類中的著名地方品種密本南瓜(PM09)與第Ⅲ類中節(jié)間短的品種PM32或PM33雜交，有望選育出矮化高產的新品種。

除了表型遺傳多樣性，DNA分子標記已廣泛應用于遺傳多樣性和植物親緣關系鑒別研究。簡單重復序列(SSR)標記自1994年[8]建立以來，因其多態(tài)性良好、分辨率高、遺傳信息量豐富、數量多、重復性好、操作簡便等優(yōu)點被廣泛利用，目前已經成為應用最廣泛且最重要的遺傳標記之一，應用于指紋數據庫構建、分子輔助選擇育種、遺傳多樣性分析和品種純度鑒定等相關研究。本研究利用43對SSR引物，對35份樣品進行PCR檢測，共檢測到155個等位基因，平均每個標記位點能檢測到3.6個等位基因，每個標記所檢測到的等位基因數為2～7個，PIC為0.130 8～0.775 4，平均值0.487 2。武向斌[14]利用66對SSR引物對61份美洲南瓜樣本DNA進行了擴增，發(fā)現平均每個標記位點能檢測4.2個等位基因，PIC平均值為0.43。朱海生等[13]利用30對SSR引物對30份中國南瓜樣本開展遺傳多樣性分析，發(fā)現每對引物檢測到的等位基因為1～5個，平均值為2.11個。周秦等[18]利用26對SSR引物對26份南瓜核心種質資源進行了擴增及多態(tài)性評價，每對引物檢測到的等位基因數目為1～12個，平均值為4.5個，PIC平均值為0.460。王迎兒等[22]利用26對SSR標記對41份均來源于浙江省內的南瓜種質資源材料進行了遺傳多樣性分析，平均每對引物檢測到5.4個等位基因，PIC平均值為0.58。王瑞等[20]利用150對引物對24份由廣東省農科院采集的南瓜種質資源樣本進行擴增，平均每對引物檢測到4.8個等位基因。與之前的試驗相比，本試驗所選用的SSR標記具有良好的多態(tài)性，標記的平均等位基因數比王迎兒等[22]的研究結果稍少；與武向斌[14]的研究類似，本研究在一定程度上展示了南瓜種質資源的豐富性和差異性。結合基因型和表型的數據，可以通過關聯分析找到與這些農藝與果實性狀顯著關聯的分子標記[23]。但是，開展關聯分析相關研究需要更多的南瓜品種并發(fā)掘更多的分子標記。

利用UPGMA方法對35份材料進行聚類分析，結果顯示南瓜材料可明顯分為三大類，對應中國南瓜、印度南瓜、美洲南瓜3個種。與周秦等[18]、王迎兒等[22]發(fā)現利用SSR標記可以區(qū)分不同種南瓜的研究結果一致。從聚類圖可以看出，印度南瓜與美洲南瓜親緣關系較近，這與盧麗芳等[24]、李俊麗等[25]、李海真等[26]、張?zhí)烀鞯萚27]利用其他分子標記的研究結果不一致，即上述研究中認為中國南瓜與美洲南瓜親緣關系較近。這種差異可能是由于本研究供試品種中的美洲南瓜數量較少，代表性差，美洲南瓜根據表型可分為很多類型[28]，而本研究只收集到以觀賞類型為主的5個品種。分析研究所用的分子標記系統可以發(fā)現，前人分析中都使用了顯性標記[24-27]，而本研究中的SSR為共顯性標記，即因分子標記類型不同，可能會導致不同的結果。以往研究還發(fā)現在相同栽培種的不同品種間，可進一步分為不同的類群，例如朱海生等[13]將30份中國南瓜樣本分為兩類：第一類包括22份材料，瓜形多為盤形、近圓形、橢圓形和扁圓形；第二類包括8份材料，瓜形多為長筒形或長頸圓筒形，其分類主要與果實的性狀相關。王瑞等[20]也發(fā)現可將中國南瓜分為兩類，第一類果實形狀多為棒槌形，第二類多為扁圓形。武向斌[14]將61份美洲南瓜種質分為含有5份野生種質的類別Ⅰ和含有56份栽培種質的類別Ⅱ，其分類主要與是否為栽培種相關。本研究的品種聚類分析也表明，在第Ⅰ類和第Ⅱ類南瓜中，還可繼續(xù)分為三類。綜上可知，利用SSR標記可以區(qū)分不同種的南瓜，而且同一種內中，可以進一步區(qū)分出不同類群。

需要指出的是，雖然利用SSR標記很容易將不同南瓜類型區(qū)分開，但同一類型的不同南瓜品種很難相互區(qū)分，例如PM01和PM02的品種聚類分析。SSR標記檢測的電泳結果同時體現了SSR存在種間的特異性，即同種內多態(tài)性小，不同種間多態(tài)性大，說明本研究采用的SSR標記在不同種間的通用性差。但這有利于不同類型南瓜間開展種間的雜交育種、標記輔助育種以及遺傳圖譜的構建。因此，為了更好地從分子水平區(qū)分同一種內的南瓜品種，需要采用通用性更好的SSR標記。為了南瓜種質資源的保護和分子育種的開展，后續(xù)研究可以利用通用性好的SSR標記建立南瓜品種的指紋圖譜，以便開展特定南瓜品種的鑒定工作。

4 結論

本試驗利用43個簡單序列重復(SSR)標記，將35份南瓜栽培品種進行了分子層面的遺傳多樣性分析，通過聚類分析將其劃分為中國南瓜(13份)、印度南瓜(17份)和美洲南瓜(5份)共3種栽培類型，與實際栽培種的劃分相符。同時，本試驗調查了不同南瓜品種的農藝性狀和果實性狀，發(fā)現不同種品種的農藝性狀與果實性狀差別明顯，每個種內部分品種農藝性狀較好，可以作為雜交育種的親本。由于許多SSR標記具有種間特異性，開展南瓜種間雜交育種時，這些標記適合應用于標記輔助選擇。本研究結果為國內南瓜栽培品種遺傳結構的進一步研究，以及開展種間雜交分子育種的研究提供了理論依據。