桑艷紅 甄月巧 李爽 王楚楚

假性甲狀旁腺功能減退癥(PHP)是一組以終末靶器官對甲狀旁腺激素(PTH)抵抗為特征，導(dǎo)致低鈣血癥、高磷血癥和血清高PTH的一組罕見疾病[1]。該病主要是由于PTH與靶細(xì)胞膜受體結(jié)合異常及環(huán)磷酸腺苷(cAMP)依賴性通路活化受損而引起。PHP患者可能表現(xiàn)出典型的Albright遺傳性骨營養(yǎng)不良(AHO)體征，即身材矮小、中心性肥胖、圓臉、頸短、短指/趾畸形，生化異常表現(xiàn)為低鈣、高磷、高PTH及亞臨床甲狀腺功能減退癥(SCH)。根據(jù)尿cAMP水平和對外源性PTH的反應(yīng)性，PHP分為Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型主要表現(xiàn)為靶細(xì)胞膜受體-腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)缺陷，對PTH不反應(yīng)，不產(chǎn)生cAMP，PTH不能發(fā)揮激素的生理效應(yīng)，尿cAMP降低甚至測不出，注射活性PTH后其尿cAMP和尿磷不增加；Ⅱ型則表現(xiàn)為PTH能夠正常地與靶細(xì)胞膜受體結(jié)合產(chǎn)生cAMP，但cAMP不能進(jìn)一步發(fā)生生理效應(yīng)，尿cAMP升高、尿磷減少，注射活性PTH后尿cAMP繼續(xù)上升，但尿磷不增加[2]。此外根據(jù)激素抵抗模式和是否具有AHO表型可將PHP Ⅰ型進(jìn)一步分為3個(gè)不同的亞型：PHP-Ⅰa患者存在AHO表型和PTH、甲狀腺素、促性腺激素、生長激素釋放激素等多激素抵抗；PHP-Ⅰb具有典型的PTH抵抗特征，但沒有AHO特征；PHP-Ⅰc患者的臨床表現(xiàn)與PHP-Ia相似但G蛋白(Gsa)α亞單位的活性正常[3-4]。PHP-Ⅱ型與Ⅰb型類似，無多激素抵抗及AHO體型，補(bǔ)充外源性PTH后,cAMP生成無障礙，尿cAMP排出正常[5]。我們回顧性分析了1個(gè)Ⅰa型PHP患者家系的臨床特征，通過基因檢測確定疾病分型，旨在加強(qiáng)臨床醫(yī)師對該型PHP及該病基因檢測的應(yīng)用的認(rèn)識。

對象與方法

1.對象：納入先證者、先證者弟弟、先證者父母及外祖父母進(jìn)行研究。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院倫理委員會審批通過，患者及其家屬均知情同意。

2.方法

(1)臨床資料收集：收集先證者的一般信息、臨床表現(xiàn)、體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查資料。實(shí)驗(yàn)室檢查資料包括：甲狀腺功能、PTH、25羥維生素D3[25(OH)D3]、電解質(zhì)、24 h尿鈣、24 h尿磷、骨齡、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和皮質(zhì)醇(COR)節(jié)律、胰島素低血糖興奮試驗(yàn)結(jié)果等。PHP、SCH診斷明確后，行全外顯子基因測序；進(jìn)一步完善先證者弟弟及父母親的體格檢查及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查，最后獲取先證者弟弟、先證者父母及先證者外祖父母的基因樣本進(jìn)行分析驗(yàn)證。

(2)基因檢測：取先證者及其家屬靜脈外周血5 ml，采用血液基因組DNA Mini試劑盒(CwbioBiotech，北京，中國)從血液中分離出總DNA。使用Agilent Sure Select Human All Exon試劑盒進(jìn)行捕獲和文庫構(gòu)建，在Illumina平臺上進(jìn)行全外顯子測序，有效測序數(shù)據(jù)與參考基因組(GRCh37/hg19)進(jìn)行比對。結(jié)合基因變異頻率、臨床數(shù)據(jù)庫(ClinVar、HGMD、OMIM)收錄情況、軟件預(yù)測結(jié)果(SIFT、MutationTaster、PROVEAN、MutationTaster等)篩選出一個(gè)GNAS基因的雜合變異c.534-2A>G，設(shè)計(jì)引物對篩選出的可疑候選變異進(jìn)行PCR擴(kuò)增和Sanger測序驗(yàn)證。PCR引物序列分別為：正向引物：5’-GGACGGTCACTTCCGTTGAG-3’，反向引物：5’-CGGTCACTCCACAAACCTGT-3’。

結(jié) 果

1.臨床檢查結(jié)果：先證者，女，9歲6個(gè)月，因“反復(fù)發(fā)作性上肢抽搐9年余，再發(fā)加重5天”于2014年4月3日入院?；颊?年余前無明顯誘因出現(xiàn)右上肢抽搐，右手腕部和肘部屈曲，持續(xù)約30 s自行緩解；此后上述癥狀間斷發(fā)作4次，每次發(fā)作持續(xù)約30 s～2 min，可自行緩解；5天前再次出現(xiàn)雙上肢緊張性抽搐，雙下肢不明顯，呼之不應(yīng)，持續(xù)約3 min緩解。于我院門診查PTH 946.8 pg/ml(14.0～72.0 pg/ml，括號內(nèi)為正常參考值范圍，以下相同),血鈣1.34 mmol/L(2.03～2.54 mmol/L)，血磷3.10 mmol/L(0.83～1.48 mmol/L)。體格檢查：身高120 cm(同齡人身高中位數(shù)137 cm，-2 SD為125.0 cm)，上部量60 cm，下部量60 cm，體重30 kg，BMI 20.8 kg/m2。臉圓面紅、雙手第4、5掌指關(guān)節(jié)較短，面神經(jīng)叩擊征(Chovestek征)陽性，束臂加壓試驗(yàn)(Trouseau征)陽性，神經(jīng)系統(tǒng)檢查：腱反射亢進(jìn)。實(shí)驗(yàn)室檢查：血鈣1.34 mmol/L，血磷3.41 mmol/L，血鎂0.60 mmol/L(0.70～1.00 mmol/L)，24 h尿磷12.06 mmol/L(22.00～48.00 mmol/L)，24 h尿鈣0.22 mmol/L(2.50～7.50 mmol/L)(尿量1 800 ml)。25(OH)D39.09 ng/ml(>20 ng/ml)；堿性磷酸酶269 U/L(35～150 U/L)，甲狀腺功能五項(xiàng)：游離三碘甲腺原氨酸(FT3)6.24 pmol/L(2.80～6.80 pmol/L)，游離甲狀腺素(FT4)11.58 pmol/L(11.50～22.70 pmol/L)，超敏促甲狀腺激素(sTSH)12.734 mIU/L(0.500～5.500 mIU/L),甲狀腺球蛋白抗體(TgAb) 16.9 U/ml(<60.0 U/ml)，甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb) 20.3 U/ml(<60.0 U/ml))。性腺七項(xiàng)：總睪酮9.00 ng/dl，促卵泡生成激素4.92 mIU/ml，促黃體生成激素3.25 mIU/ml，泌乳素4.68 ng/ml，雌二醇26.20 pg/ml，孕酮0.373 ng/ml，生長激素0.596 ng/ml(0～8.000 ng/ml)，提示垂體-性腺軸尚未啟動。通過左手正位X線檢查結(jié)果計(jì)算骨齡約11歲，大于實(shí)際年齡。胰島素低血糖興奮生長激素試驗(yàn)結(jié)果：生長激素0 min、30 min、60 min、90 min、120 min分別為6.92 ng/ml、2.86 ng/ml、0.588 ng/ml、0.232 ng/ml、0.674 ng/ml，高峰值>5 ng/ml但<10 ng/ml，提示垂體生長激素部分缺乏；患者早晨8時(shí)、下午4時(shí)、午夜12時(shí)的ACTH分別為28.9 pg/ml(7.2～63.3 ng/ml)、17.1 pg/ml(4.0～32.0 ng/ml)、3.3 pg/ml，COR分別為258.6 nmol/L(172.0～497.0 nmol/L)、142.2 nmol/L(74.1～286.0 nmol/L)、59.4 nmol/L。診斷考慮PHP、SCH。入院后予碳酸鈣600 mg每日2次口服，骨化三醇(羅蓋全)0.25 μg每日1次口服，優(yōu)甲樂25 μg每日1次口服，復(fù)查血鈣1.62 mmol/L,血磷2.88 mmol/L,血鎂0.60 mmol/L。入院后患兒短暫發(fā)作1次抽搐，持續(xù)約30 s自行緩解。出院后長期予以鈣劑、活性維生素D及優(yōu)甲樂治療，定期隨訪，未再發(fā)作抽搐。末次隨訪時(shí)間為2020年8月26日，患者身高140 cm，體重62 kg，BMI 31.6 kg/m2，F(xiàn)T34.46 pmol/L，F(xiàn)T413.48 pmol/L，TSH 7.44 mIU/L，PTH 261.8 pg/ml，血鈣2.15 mmol/L，磷1.78 mmol/L，血鎂0.70 mmol/L，25(OH)D323.4 ng/ml,將優(yōu)甲樂劑量由原來每天50 μg調(diào)整為每天62.5 μg，羅蓋全0.25 μg每日2次，鈣爾奇D 300 mg每天3次。

先證者弟弟，男，4歲，外形、相貌與先證者相似，無明顯臨床癥狀。體格檢查：身高104 cm，體重20 kg，BMI 18.5 kg/m2，臉圓面紅，手指短粗，雙手第4、5掌指關(guān)節(jié)較短，智力較同齡兒差。實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果：血鈣2.24 mmol/L，血磷1.82 mmol/L，PTH 391.4 pg/ml，F(xiàn)T35.73 pmol/L，F(xiàn)T415.48 pmol/L，sTSH26.103 mIU/L。診斷為PHP、SCH。治療上給予碳酸鈣600 mg每日2次、羅蓋全0.25 μg每日2次、優(yōu)甲樂25 μg每日1次，長期隨訪。末次隨訪時(shí)間為2020年8月26日，患兒身高139 cm，體重47 kg，BMI 24.3 kg/m2,血鈣2.15 mmol/L，血磷1.75 mmol/L，PTH 274.2 pg/ml，25(OH)D321.14 ng/ml，F(xiàn)T35.65 pmol/L，F(xiàn)T413.94 pmol/L，sTSH 6.726 mIU/L，目前身高在同年齡、同性別兒童中處于正常范圍(約50%位置)。

先證者母親，女，35歲，身高140 cm，體重56 kg，BMI 28.6 kg/m2，面圓頸短，十指粗短，面神經(jīng)叩擊征陽性。既往有低鈣血癥病史，間斷補(bǔ)鈣，檢測血鈣1.76 mmol/L，血磷1.54 mmol/L，PTH 174.3 pg/ml，F(xiàn)T34.78 pmol/L，F(xiàn)T412.75 pmol/L，sTSH 11.37 mIU/L，予鈣劑、活性維生素D及優(yōu)甲樂治療。末次隨訪時(shí)間為2020年8月26日，復(fù)查血鈣1.66 mmol/L，血磷1.50 mmol/L，血鎂0.50 mmol/L，PTH 175.90 pg/ml，25(OH)D319.76 ng/ml，F(xiàn)T35.21 pmol/L，F(xiàn)T417.86 pmol/L，sTSH 1.745 mIU/L。

先證者外婆，女，65歲，身高138 cm，體重43 kg，BMI 22.6 kg/m2，患有糖尿病，體弱多病。

2.基因檢測結(jié)果：我們在先證者外周血DNA樣本的全外顯子測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)GNAS基因的雜合變異c.534-2A>G，通過Sanger測序?qū)υ撟儺愇稽c(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，明確了先證者中該變異為雜合攜帶(圖1)。隨后對先證者家屬進(jìn)行該c.534-2A>G變異位點(diǎn)檢測，結(jié)果顯示，先證者母親(Ⅱ:1)、外婆(Ⅰ:2)及弟弟(Ⅲ:2)均攜帶該變異位點(diǎn)，而在先證者父親(Ⅱ:2)及外公(Ⅰ:1)未檢出。本次研究檢出的GNAS雜合變異c.534-2A>G在國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)，該變異位于7號外顯子相鄰的經(jīng)典剪切位置，且多種統(tǒng)計(jì)方法預(yù)測會對基因或基因產(chǎn)物造成有害影響。我們在GnomAD、ExAC、TOPMED數(shù)據(jù)庫中對該變異頻率進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)該變異在人群中的頻率未見收錄，不屬于多態(tài)性變異。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)先證者所攜帶的c.534-2A>G雜合變異已在一個(gè)有PHP表現(xiàn)的AHO家系中報(bào)道且與疾病共分離[6]。GNAS基因的經(jīng)典剪切位點(diǎn)變化如c.435+1G>A、c.530+1G>T、c.973+2T>C、c.974-2A>G均已有PHP致病性的報(bào)道[7-8]，該基因的剪切位點(diǎn)變異導(dǎo)致的PHP是已知的致病機(jī)理。根據(jù)ACMG指南判定該變異為致病性的。我們隨后對該患病家系中其他成員中該變異位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證結(jié)果顯示先證者中該變異來自于其母親，同時(shí)在先證者外婆及先證者弟弟中均檢出該變異，而在先證者父親及外公中未檢出，提示在該患病家系中該變異由先證者外婆傳遞至其母親，再由其母親傳遞至先證者及其弟弟，該變異在該家系中屬于母系遺傳的基因失活突變引起的，按照基因診斷結(jié)果該患病家系為PHP-Ia型。

圖1 研究對象家系圖及GNAS基因變異Sanger測序結(jié)果：紅色箭頭表示變異位置：先證者(Ⅲ:1，黑色箭頭所指)血液樣本測序結(jié)果提示攜帶GNAS基因雜合變異c.534-2A>G；Ⅰ:1、Ⅱ:2未攜帶變異c.534-2A>G；Ⅰ:2、Ⅱ:1、Ⅲ:2攜帶GNAS基因雜合變異c.534-2A>G。同一位點(diǎn)出現(xiàn)雙峰提示雜合。

討 論

PHP是一種遺傳性疾病，屬于罕見的、高度異質(zhì)性和嚴(yán)重?fù)p害的疾病，其特征是終末器官對PTH的作用產(chǎn)生抵抗[9]。PHP是Albright等描述的第一個(gè)激素抵抗綜合征，且已證實(shí)與遺傳有關(guān)，可由編碼刺激性G蛋白(Gαs)α亞單位(Gsα)的GNAS外顯子雜合失活突變引起[10]。已知在70%～80%的患者中，PHP-Ia是因?yàn)槟赶颠z傳的GNAS基因的雜合失活突變引起，而PHP-Ib通常為GNAS基因啟動子區(qū)的胞嘧啶甲基化異常引起[11]。AHO表型與多種PHP有關(guān)，包括成人矮小、短肢骨化和皮下骨化。

GNAS基因定位于20q13.3，包含13個(gè)外顯子，在結(jié)構(gòu)上與小鼠2號染色體上的同源序列非常相似，具有高度復(fù)雜的印記表達(dá)模式，其能夠調(diào)控父系表達(dá)的非編碼RNA參與印記調(diào)節(jié)；主要編碼刺激性Gsα，還可編碼一個(gè)結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的蛋白Alex，參與配體互作、腺苷酸環(huán)化酶的激活及多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)。在嚙齒類動物中的研究表明，Gsα的啟動子和第一外顯子位于1個(gè)富含CpG的島上，但在這兩個(gè)等位基因上都沒有甲基化標(biāo)記，這也是Gsα在大多數(shù)組織中是雙向表達(dá)的原因[12]。然而，在腎近端小管、甲狀腺、性腺、垂體、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同區(qū)域及棕色脂肪組織等少數(shù)組織中，Gsα主要來自母體等位基因，其父系等位基因通過尚未明確的機(jī)制被沉默，這也是母系遺傳的基因失活突變引起的AHO會導(dǎo)致多激素抵抗、早發(fā)性肥胖和認(rèn)知障礙的原因，而這種因母系突變導(dǎo)致的PHP被稱為PHP-Ia型[13]。相反，由父系遺傳的相同GNAS外顯子失活突變引起的AHO不會引起激素抵抗、肥胖或認(rèn)知障礙，因此被稱為假假性甲狀旁腺功能減退癥(PPHP)。

結(jié)合我們收集的該家系臨床信息，判斷該家系符合PHP-Ⅰa型，主要表現(xiàn)為典型面容(圓臉、短頸)、身材矮小、低血鈣、高血磷、高PTH，臨床診斷為PHP、SCH。AHO會導(dǎo)致多激素抵抗、早發(fā)性肥胖和認(rèn)知障礙。本研究中，先證者母親的哥哥及其子女、先證者外婆的兄弟姐妹均無類似臨床表現(xiàn)，結(jié)合之前的臨床信息，該家系存在來源于母系的GNAS基因突變，在先證者診斷PHP后，其弟弟和母親隨后也發(fā)現(xiàn)除假性甲狀旁腺功能減退之外，同時(shí)也并存SCH，并且這種功能減退是原發(fā)性SCH，而不是甲狀腺激素抵抗，因?yàn)檠a(bǔ)充優(yōu)甲樂后患者的sTSH可以恢復(fù)正常。值得注意的是，先證者診斷時(shí)其PTH水平明顯升高，達(dá)正常值十幾倍，低鈣和高磷也更加明顯，先證者母親的低鈣、高磷、高PTH水平次之，先證者弟弟的血鈣正常，血磷、血PTH水平升高程度均明顯低于先證者，提示即使是相同的基因突變，不同年齡患者的臨床嚴(yán)重程度也并不完全一致。該家系經(jīng)過6年的干預(yù)治療后，先證者弟弟的生長發(fā)育影響較小，而先證者的甲狀腺功能及鈣磷代謝雖有所糾正，但終身高無明顯改善，提示早期干預(yù)治療可明顯改善患者的臨床結(jié)局。先證者母親的低鈣、高磷、高PTH與治療前變化不大，考慮與其服藥不規(guī)律有關(guān)。

對于PHP的治療，因患者存在PTH抵抗，應(yīng)給予活性維生素D治療，但同時(shí)應(yīng)積極給予普通維生素D的補(bǔ)充使其達(dá)到正常水平，以減少維生素D缺乏對其他組織器官的影響。

隨著遺傳學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展，越來越多的GNAS基因變異在PHP患者中被發(fā)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)了與該家系呈疾病共分離的雜合變異c.534-2A>G，但盡管家系成員的臨床信息與基因診斷結(jié)果均提示該家系為PHP-Ⅰa型，但我們沒有對該變異進(jìn)行功能學(xué)研究，還需更多研究來進(jìn)一步評估這種獨(dú)特的突變是否能導(dǎo)致Gsα的功能障礙。