彭丹丹，李 言

1東南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京210096；2江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫214122

衰老通常伴隨機(jī)體發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的生理功能下降，這其中就包括能量代謝穩(wěn)態(tài)。衰老相關(guān)的代謝穩(wěn)態(tài)失衡通常包括能量消耗減少、脂肪堆積以及胰島素敏感性的降低等［1-2］。衰老相關(guān)的代謝穩(wěn)態(tài)失衡與很多代謝性疾病有著十分密切的關(guān)系，包括2型糖尿病、心血管疾病以及神經(jīng)退行性疾病等［3-6］。因此，探究衰老相關(guān)的代謝穩(wěn)態(tài)失衡發(fā)生發(fā)展過程中的分子機(jī)制并尋找潛在的干預(yù)靶點(diǎn)迫在眉睫［7-8］。研究發(fā)現(xiàn)衰老會(huì)導(dǎo)致脂肪組織中microRNA的水平發(fā)生改變，從而影響能量代謝穩(wěn)態(tài)［9］。miR-190-5p（miR-190）位于染色體15q22.2的TLN2基因內(nèi)含子區(qū)。最近，越來越多的相關(guān)研究表明其與人類疾病之間具有相關(guān)性，尤其是在癌癥的發(fā)生和發(fā)展方面［10］。已知miR-190在多個(gè)組織中存在表達(dá)，但是其在脂肪組織中以及衰老進(jìn)程中發(fā)揮的具體作用和分子機(jī)制仍不明確［10］。本研究對(duì)miR-190在脂肪細(xì)胞中的作用進(jìn)行探究，鑒定衰老過程中miR-190水平的改變及其在衰老相關(guān)代謝穩(wěn)態(tài)失衡中的作用，探討miR-190調(diào)控脂肪組織能量代謝穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠模型：實(shí)驗(yàn)所用小鼠C57BL/6J（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司），均為年齡4～8周齡的雄鼠，待其成年后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物20～22℃恒溫飼養(yǎng)于無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)動(dòng)物房，每12 h開關(guān)照明晝夜循環(huán)，以正常飼料飼養(yǎng)。本研究所有小鼠實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)“3R”原則，按照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南》（GB/T27416-2014）執(zhí)行。

細(xì)胞系：褐色脂肪前體細(xì)胞（brown adipose cell，BAC）細(xì)胞系，細(xì)胞培養(yǎng)基：改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）+10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）+1%青鏈霉素混合液（penicillin-streptomycin solution，PS）。3T3 L1細(xì)胞系，脂肪前體細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基：DMEM+10%新生牛血清（newborn calf serum，NCS）+1%PS+生物素（8 mg/L）+泛酸（17 μmol/L）。所有細(xì)胞置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天觀測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

泛酸酯、生物素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、地塞米松（dexamethasone，Dex）、吲哚美辛（indometacin，Indo）和葡萄糖（D-glucose）（Sigma公司，美國(guó)）；核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）反轉(zhuǎn)錄試劑盒、克隆用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）酶LA Taq（Ta-KaRa公司，日本）；蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑、SYBR GREEN實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（Roche公司，瑞士）；蛋白定量試劑Bradford、蛋白marker PageRuler Prestained Protein Ladde和蛋白免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑Super West Pico Chemiluminescent Substrate（Thermo Fisher公司，美國(guó)）；RNA抽提試劑TRIzol、轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000、DMEM、非必需氨基酸（non-essential amino acids，NEAA）、glutamine、0.25%胰酶（trypsin）、胎牛血清及其他細(xì)胞培養(yǎng)試劑（Life technologies公司，美國(guó)）；熒光素酶報(bào)告基因試劑盒（Promega公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠實(shí)驗(yàn)

小鼠麻醉取血后處死，迅速收集褐色脂肪組織（intrascapular brown adipose tissue，iBAT）與皮下白色脂肪組織（inguinal white adipose tissue，iWAT）于液氮中速凍后保存于-80℃超低溫冰箱，待進(jìn)一步檢測(cè)。體內(nèi)miR-190 antagomir抑制劑作用通過定點(diǎn)注射iBAT與iWAT部位進(jìn)行。

1.2.2 代謝籠

將待檢測(cè)的小鼠稱量體重后每只單獨(dú)放入檢測(cè)小室，提供充足的糧食和飲用水后密封。啟動(dòng)自動(dòng)化小鼠新陳代謝監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，錄入小鼠體重后開始檢測(cè)。

1.2.3 HE染色

新鮮組織用8%多聚甲醛固定24～48 h后脫水，石蠟包埋；修石蠟塊、切片、展片、貼片、烤片（55～60℃）3～10 h；將切片依次放入二甲苯中10 min（2次）、無水乙醇中5 min（2次）、95%乙醇中5 min、80%乙醇中片刻、70%乙醇中片刻脫蠟，后雙蒸水洗5 min；將切片用蘇木素染液染色5 min后雙蒸水洗片刻；將切片用0.5%鹽酸酒精分色約10 s，自來水洗返藍(lán)（約20 min）；將切片置于70%乙醇中5 min、80%乙醇中5 min，然后用伊紅染液（95%乙醇配制）染色約20 s；將切片依次置于95%乙醇中5 min、無水乙醇中5 min、二甲苯+乙醇（1∶1）中5 min和二甲苯中5 min（2次）；中性樹膠封片，正置顯微鏡觀察拍攝照片。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)及分化

3T3L1脂肪前體細(xì)胞使用生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行普通傳代培養(yǎng)：DMEM+10%NCS+1%PS+1%生物素/泛酸酯，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右進(jìn)行傳代（生長(zhǎng)過密后傳代會(huì)影響之后的細(xì)胞分化效率）。需要分化的細(xì)胞鋪板生長(zhǎng)接觸抑制后繼續(xù)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中維持48 h左右（克隆增殖期），用誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)該狀態(tài)下的3T3L1細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)：DMEM+10%FBS+1%PS+1%生物素/泛酸+1 μg/mL insulin+500 μmol/L IBMX+1 μmol/L Dex。此時(shí)3T3L1細(xì)胞需在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中至少保持48 h，然后換為分化培養(yǎng)基：DMEM+10%FBS+1%PS+1%生物素/泛酸+1 μg/mL insulin，分化培養(yǎng)基每2 d換1次液，在誘導(dǎo)之后6～8 d細(xì)胞分化成熟，出現(xiàn)明顯的脂滴后進(jìn)行后續(xù)的其他實(shí)驗(yàn)。

BAC褐色脂肪前體細(xì)胞使用生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行普通傳代培養(yǎng)：DMEM+10%FBS+1%PS，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右進(jìn)行傳代。將要分化的BAC細(xì)胞鋪板后換為分化培養(yǎng)基：DMEM+10%FBS+1%PS+0.1 μg/mL insulin+1 nmol/L三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3），待其生長(zhǎng)至90%及以上用誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)：DMEM+10%FBS+1%PS+0.1 μg/mL insulin+1 nmol/L T3+500 μmol/L IBMX+5 μmol/L Dex+0.125 mmol/L Indo。將BAC細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中保持48 h以上，然后換為分化培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基每2 d換1次液，在誘導(dǎo)之后6～8 d細(xì)胞分化成熟，然后每天換新鮮分化培養(yǎng)基，出現(xiàn)明顯脂滴后進(jìn)行后續(xù)其他實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 細(xì)胞衰老模型構(gòu)建

利用H2O2與棕櫚酸（palmitic acid，PA）在體外構(gòu)建細(xì)胞衰老模型。在3T3L1白色脂肪前體細(xì)胞和BAC褐色脂肪前體細(xì)胞出現(xiàn)明顯脂滴后，進(jìn)行誘導(dǎo)衰老處理：分別配制用培養(yǎng)基稀釋的100 μmol/L的H2O2溶液和200 μmol/L的PA溶液，隨后將配制好的溶液加入模型組細(xì)胞24 h孵育。吸去含有H2O2和PA的培養(yǎng)基，收取細(xì)胞樣品。

1.2.6 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的HEK 293T細(xì)胞進(jìn)行鋪板，細(xì)胞增殖至80%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染，報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24～48 h后取出細(xì)胞板終止培養(yǎng)。根據(jù)試劑盒操作說明進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 定量PCR

采用TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國(guó)）按操作說明書提取脂肪組織和細(xì)胞中的總RNA。根據(jù)試劑盒操作說明進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 蛋白質(zhì)免疫印跡［11］

小鼠組織及細(xì)胞在勻漿后10 000 r/min離心20 min得到上清。使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度作為內(nèi)參，在保證蛋白量一致的情況下確定組織上清液體積。在組織上清液中加入5×上樣緩沖液（5×loading buffer）后100℃加熱10 min，即可獲得組織樣品。用10%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，待條帶跑開后轉(zhuǎn)膜，用5%TBST牛奶封閉1 h，分別加入內(nèi)參和相應(yīng)的一抗進(jìn)行孵育，TBST充分洗滌后再加入二抗進(jìn)行孵育，TBST充分洗滌后上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用GraphPad5.0進(jìn)行分析，除特別標(biāo)注外，定量實(shí)驗(yàn)各組數(shù)據(jù)以均數(shù)依標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析兩組數(shù)據(jù)之間的差異性，使用one way ANOVA分析多組數(shù)據(jù)之間的差異性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-190在衰老褐色脂肪組織與白色脂肪組織中的表達(dá)

Sirtuins蛋白家族又被稱為長(zhǎng)壽蛋白家族，其中SIRT3主要定位于線粒體，并被報(bào)道具有拮抗人干細(xì)胞衰老的作用。相關(guān)研究表明，SIRT3與衰老呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性［12］。隨著小鼠月齡的增加，小鼠iBAT與iWAT中SIRT3的表達(dá)水平逐漸下降，證明了衰老進(jìn)程的發(fā)展（圖1A、B）。為了進(jìn)一步確定miR-190與衰老之間的相關(guān)性，我們分別比較了不同年齡段小鼠iBAT與iWAT中miR-190的表達(dá)水平。RT-PCR的結(jié)果顯示，iBAT與iWAT中，隨著衰老進(jìn)程的發(fā)展，miR-190的表達(dá)水平呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)（圖1C、D），提示miR-190的表達(dá)水平與衰老呈現(xiàn)正相關(guān)性。眾所周知，褐色脂肪組織是一種“燃燒脂肪”，可以產(chǎn)生熱量。有意思的是，miR-190在褐色脂肪組織中的表達(dá)水平最高，而在內(nèi)臟白色脂肪組織（eWAT）中表達(dá)最低，說明miR-190的表達(dá)可能與脂肪組織的產(chǎn)熱有關(guān)（圖1E）。

圖1 不同月齡小鼠脂肪組織中SIRT3的表達(dá)Figure 1 Expression of SIRT3 in adipose tissue of mice at different months of age

2.2 miR-190在體外衰老脂肪細(xì)胞中的表達(dá)

此外，利用H2O2與PA在體外構(gòu)建細(xì)胞衰老模型［13］，以驗(yàn)證上述體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖2A～D證明了體外細(xì)胞衰老模型的構(gòu)建成功。RT-PCR的結(jié)果顯示，無論是在褐色脂肪細(xì)胞（BAC）還是白色脂肪細(xì)胞（3T3L1）中，H2O2和PA均可以使脂肪細(xì)胞中miR-190水平升高，這與體內(nèi)結(jié)果也是吻合的（圖2E～H）。

圖2 衰老細(xì)胞模型中miR-190的表達(dá)Figure 2 miR-190 expression of cellular senescence model

2.3 miR-190抑制脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱基因的表達(dá)

由于脂肪組織衰老會(huì)引起脂肪組織產(chǎn)熱基因表達(dá)的降低，我們首先檢測(cè)了衰老細(xì)胞模型和衰老小鼠中產(chǎn)熱相關(guān)基因PR結(jié)構(gòu)域蛋白16（PR domain containing 16，PRDM16）的mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，PRDM16的mRNA表達(dá)水平在兩種衰老細(xì)胞模型中均顯著下降（圖3A、B）。在衰老小鼠的iBAT與iWAT中也得到了相似的結(jié)果（圖3C、D）。接著向褐色脂肪細(xì)胞與白色脂肪細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-190 agomir，并進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果顯示，miR-190的過表達(dá)會(huì)顯著降低褐色脂肪細(xì)胞中產(chǎn)熱相關(guān)基因解耦聯(lián)蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）、PRDM16、細(xì)胞死亡誘導(dǎo)DFFA樣效應(yīng)蛋白A（recombinant cell death inducing DFFA like effector A，CIDEA）、碘甲腺原氨酸脫碘酶Ⅱ（recombinant deiodinase，iodothyronine，typeⅡ，DIO2）的mRNA表達(dá)水平（圖4A）；在白色脂肪細(xì)胞中也獲得了類似結(jié)果（圖4B）。

圖3 衰老細(xì)胞模型和衰老小鼠脂肪組織中產(chǎn)熱基因PRDM16的變化Figure 3 Changes of thermogenesis gene PRDM16 in senescent cell models and adipose tissue of aging mice

圖4 miR-190過表達(dá)對(duì)脂肪細(xì)胞中產(chǎn)熱基因的影響Figure 4 Influence of miR-190 overexpression on thermogenesis genes in adipocytes

2.4 PRDM16是miR-190的直接靶基因

通過對(duì)數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，脂肪產(chǎn)熱的關(guān)鍵基因PRDM16［14］可能是miR-190的靶基因并在多個(gè)物種間保守（圖5A）。為了驗(yàn)證miR-190對(duì)脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱的影響是否依賴于PRDM16，進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，miR-190會(huì)抑制PRDM16 3′-UTR的轉(zhuǎn)錄活性，而將miR-190結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變以后則無該效果（圖5B）。向3T3L1細(xì)胞中過表達(dá)miR-190會(huì)抑制PRDM16 RNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，而敲減miR-190，則會(huì)促進(jìn)PRDM16 RNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)（圖5C～E）。以上結(jié)果均表明，PRDM16是miR-190的直接靶基因。miR-190可能通過介導(dǎo)PRDM16的表達(dá)抑制脂肪組織產(chǎn)熱進(jìn)而影響代謝穩(wěn)態(tài)。

圖5 PRDM16是miR-190的靶基因Figure 5 PRDM16 is the target gene of miR-190

2.5 miR-190敲減可以改善老年小鼠的代謝穩(wěn)態(tài)

接著，使用miR-190基因敲除（knockout，KO）小鼠模型來測(cè)試miR-190在老年小鼠代謝穩(wěn)態(tài)中是否起作用。對(duì)12月齡的老年小鼠進(jìn)行miR-190 antagomir注射，抑制脂肪組織中miR-190的水平。代謝籠的結(jié)果顯示，抑制miR-190后，老年小鼠的能量消耗和耗氧量都得到了明顯的提升（圖6A、B）。HE染色的結(jié)果則表明，抑制miR-190可以明顯改善衰老小鼠皮下白色脂肪和褐色脂肪細(xì)胞的形態(tài)，降低脂滴大?。▓D6C）。此外，本研究檢測(cè)了正常小鼠、老齡小鼠、KO小鼠中相關(guān)產(chǎn)熱基因的mRNA表達(dá)水平。RT-PCR結(jié)果顯示，在衰老小鼠的褐色脂肪組織中產(chǎn)熱基因UCP1、PRDM16、CIDEA、DIO2的mRNA表達(dá)水平顯著下降，而抑制miR-190可以明顯抑制衰老導(dǎo)致的相關(guān)產(chǎn)熱基因mRNA表達(dá)的下降（圖6D）；在白色脂肪組織中也獲得了類似的結(jié)果（圖6E）。上述結(jié)果證實(shí)敲除miR-190可以有效改善老年小鼠的代謝穩(wěn)態(tài)。

圖6 miR-190敲減對(duì)衰老小鼠的影響Figure 6 Influence of miR-190 knock-down on aging mice

3 討論

眾所周知，衰老是機(jī)體代謝下降的病因之一。microRNA已經(jīng)被廣泛報(bào)道參與了代謝疾病的調(diào)控，但是對(duì)于衰老相關(guān)代謝穩(wěn)態(tài)失衡的作用仍不夠清晰。研究衰老相關(guān)代謝紊亂與microRNA之間的關(guān)系有利于加深人們對(duì)于衰老機(jī)制及進(jìn)程的了解，也為其提供了潛在的有效治療靶點(diǎn)。在人體中，脂肪細(xì)胞是營(yíng)養(yǎng)和代謝平衡的中心?？刂浦炯?xì)胞的形成和衰老不僅可以改善新陳代謝健康，還能有效減緩衰老［15］。以往研究已經(jīng)表明miR-190是肥胖學(xué)齡前兒童胰島素抵抗和宮頸癌的生物標(biāo)志物；miR-190通過調(diào)控相關(guān)靶基因在多種類型的人類腫瘤中表達(dá)失調(diào)，并可預(yù)測(cè)腫瘤的診斷和預(yù)后，但目前對(duì)其在脂肪細(xì)胞衰老進(jìn)程中的作用還不清楚。本研究首次發(fā)現(xiàn)了miR-190參與了衰老進(jìn)程中脂肪能量代謝穩(wěn)態(tài)的調(diào)控，miR-190通過抑制PRDM16的表達(dá)導(dǎo)致脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱降低從而導(dǎo)致了能量代謝紊亂。

本研究首先通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)衰老小鼠的褐色脂肪組織和白色脂肪組織中miR-190的表達(dá)水平均是升高的，并且體外衰老模型的結(jié)果也與之相吻合，說明miR-190與衰老呈正相關(guān)性。由于在衰老進(jìn)程中，產(chǎn)熱減少，因此進(jìn)一步向褐色脂肪細(xì)胞和白色脂肪細(xì)胞中過表達(dá)miR-190，并對(duì)相關(guān)產(chǎn)熱基因進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果表明過表達(dá)miR-190均會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)熱基因的表達(dá)降低，說明miR-190抑制脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱。進(jìn)一步機(jī)制探究發(fā)現(xiàn)，脂肪產(chǎn)熱的關(guān)鍵基因PRDM16是miR-190的直接靶基因，miR-190通過對(duì)PRDM16的負(fù)調(diào)控抑制脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱。因此直接調(diào)控PRDM16表達(dá)可能對(duì)miR-190誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱下降有顯著抑制作用。

最后，在衰老小鼠中通過miR-190 antagomir抑制脂肪組織中miR-190的表達(dá)，結(jié)果顯示，抑制miR-190的表達(dá)后，衰老小鼠的能量消耗和耗氧量都得到改善提升，脂肪組織中脂滴縮小，形態(tài)得到明顯改觀，并且衰老誘導(dǎo)的產(chǎn)熱相關(guān)基因的下降受到抑制。綜上所述，本研究為衰老相關(guān)代謝紊亂提供了理論支持，并為其提供了可能的潛在治療干預(yù)策略，但是還需要進(jìn)一步研究miR-190在脂肪組織中的其余靶點(diǎn)和作用。