王曦敏 李續(xù)玲 仉曉紅 張明 李展 王海燕 侯應(yīng)龍

心臟生理功能的實現(xiàn)需要充足的血液供應(yīng)與精密的神經(jīng)支配。其中支配心臟的交感與迷走神經(jīng)以心房神經(jīng)叢的方式分布在心臟表面大血管附近的脂肪墊中[1]。這些神經(jīng)叢不僅能夠顯著影響附近心房組織的電與機械活動，同時也影響其靶心房組織的神經(jīng)營養(yǎng)支配。針對射頻消融治療心房顫動(簡稱房顫)的各種手術(shù)方式消融后除了完成肺靜脈-左房之間的電隔離、消除房顫維持的基質(zhì)外，同時也均實現(xiàn)了經(jīng)意或不經(jīng)意的不同程度的去神經(jīng)作用，并可能影響其所支配區(qū)域心房組織的結(jié)構(gòu)與功能。筆者前期研究也證實：針對犬右上與右下心房神經(jīng)叢消融后，與消融即刻相比，遠期(6月與12月)心房有效不應(yīng)期恢復(fù)到消融前水平且房顫易誘發(fā)，這一現(xiàn)象與心房出現(xiàn)顯著的神經(jīng)萌發(fā)及交感、迷走神經(jīng)的分布不平衡有關(guān)[2]。然而，神經(jīng)叢消融導(dǎo)致的心房去神經(jīng)化是否對靶心房肌組織存在不良影響，后者是否成為房顫遠期復(fù)發(fā)的新的潛在因素，目前尚不清楚。據(jù)此，本研究旨在通過構(gòu)建神經(jīng)叢消融犬模型來觀察心房去神經(jīng)支配對靶心房組織超微結(jié)構(gòu)的遠期影響，試圖尋求臨床實踐中射頻消融后房顫復(fù)發(fā)新的潛在線索。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取32 只雄性雜種犬(16～20 kg/只，購自山東大學(xué)實驗動物中心)，隨機分為4組，每組8只。通過Lead 7000電生理儀監(jiān)測和記錄，實驗設(shè)計和實施均通過了山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 神經(jīng)叢消融犬模型建立 第1組(對照組，n＝8)于右側(cè)第四肋間行開胸手術(shù)，未進行神經(jīng)叢消融，而第2～4組(消融組，每組n＝8)在右側(cè)第四肋間開胸后行右上及右下神經(jīng)叢消融。術(shù)后觀察第1、2組1個月，第3組6個月，第4組12個月。靜脈注射3%戊巴比妥鈉麻醉，氣管插管，維持正壓通氣，然后在每小時結(jié)束時追加劑量1 mg/kg；術(shù)后給犬注射鎮(zhèn)痛藥。在無菌手術(shù)條件下，于右側(cè)第四肋間開胸，充分暴露心房及右上、右下神經(jīng)叢。解剖定位：右上神經(jīng)叢位于右肺靜脈、上腔靜脈與右房交界處的脂肪墊內(nèi)；右下神經(jīng)叢位于下腔靜脈與左右心房交界處。確定好脂肪墊位置后，取射頻消融電極(7F，尖端4 mm)連接射頻消融儀，對右上及右下神經(jīng)叢行消融，每個點消融15～20 s(20 Hz 0.1 ms 2～5 V)，一邊消融一邊用冰鹽水沖洗避免局部溫度過高造成組織損傷。消融成功標準：高頻刺激(20 Hz 0.1 ms 2～5 V)消融后的神經(jīng)叢區(qū)域時，不再出現(xiàn)竇性心律減慢及房室傳導(dǎo)間期延長。

在研究結(jié)束時，一共有29只犬完成所需研究，1只因麻醉過量致死，1只因術(shù)后嚴重感染死去，第3只死于腹瀉。最終組1(對照組)有7只犬，組2～3分別有8只，組4有6只。

1.3 組織處理 根據(jù)Yuan等[3]報道，在犬的心臟內(nèi)在自主神經(jīng)系統(tǒng)中，心臟神經(jīng)節(jié)與周圍0.5～2 cm 之間的心房組織形成完整的神經(jīng)叢環(huán)路。據(jù)此，筆者選定距離消融神經(jīng)叢區(qū)域1 cm 以內(nèi)的心房肌組織為靶區(qū)域。造模結(jié)束后，應(yīng)用戊巴比妥鈉處死后，取出心臟，分別選取右上、右下神經(jīng)叢周圍的靶心房組織，切割成體積約1 mm3大小的立方體，固定于2.5%的戊二醛中，4℃保存2 h以上至組織完全固定，1 mmol/L 的磷酸緩沖液沖洗，1%四氧化俄固定4℃2 h，包埋于環(huán)氧樹脂中，包埋液固化，醋酸鈾染色后于透射電鏡(JEOL JEM－1200EX，日本電子公司)下觀察、拍片。采用1＋至3＋評分法對各組心肌細胞及心肌間質(zhì)損傷程度進行半定量評分。

2 結(jié)果

第1組(對照組)犬靶心房肌透射電鏡觀察可見心肌細胞質(zhì)膜完整，高度排列有序的肌絲，閏盤清晰可見，與形態(tài)正常大小密度均一的線粒體和肌漿網(wǎng)有序的分布。心肌間質(zhì)無異常改變，無膠原沉著(圖1A)。

第2組(消融1個月)靶心房肌出現(xiàn)明顯的超微結(jié)構(gòu)異常改變(圖1B)。透射電鏡下觀察，心房肌細胞明顯腫脹、變小，膜性細胞器較少。線粒體也表現(xiàn)出形態(tài)異常，包括嵴膜腫脹、空泡及不連續(xù)。胞內(nèi)間隙增大，質(zhì)膜破壞，間盤解體。心臟間質(zhì)無明顯膠原沉積。

第3組(消融6個月)靶心房肌也呈現(xiàn)出顯著異常改變(圖1C)，大部分肌節(jié)排列不規(guī)則，肌節(jié)明顯長于鄰近的肌細胞。肌節(jié)表現(xiàn)出收縮或擴張的差異，肌絲結(jié)構(gòu)消失，肌原纖維與線粒體之間規(guī)律排列的形式已不復(fù)存在。線粒體腫脹異常，閏盤結(jié)構(gòu)扭曲，心肌間質(zhì)可見膠原纖維聚集。

第4組(消融12個月)靶心房肌組織也出現(xiàn)顯著的超微結(jié)構(gòu)異常(圖1D)。心肌細胞總體形態(tài)與3組相似。細胞水腫，線粒體部分明顯腫脹，嵴碎裂，閏盤在結(jié)構(gòu)上也出現(xiàn)了扭曲。然而，觀察到嚴重的間質(zhì)膠原沉積和相對較少的受損細胞器，表明修復(fù)正在進行。

4組的半定量評分見表1。

表1 各組電子顯微鏡檢查半定量分析

3 討論

本研究的主要發(fā)現(xiàn)，不論是心房神經(jīng)叢消融后的急性期，還是遠期模型犬中均觀察到靶心房肌組織顯著的超微結(jié)構(gòu)異常改變，包括線粒體腫脹、空泡，糖原聚集，膜性細胞器減少，心肌間質(zhì)膠原沉積隨時間增加，損傷組織被纖維組織取代。這可能是一種有重要潛在意義的發(fā)現(xiàn)。

神經(jīng)叢消融后靶心房組織超微結(jié)構(gòu)損傷改變的機制目前不甚清楚，可能包括以下幾個因素：①神經(jīng)叢消融后的炎癥反應(yīng)。Schwartzman 等[4]觀察發(fā)現(xiàn)，對豬行單純的心房線性消融后，炎癥引起的右房壁組織水腫發(fā)展迅速，并在消融后4周內(nèi)消退。但筆者的研究發(fā)現(xiàn)，消融后1個月心房超微結(jié)構(gòu)損傷嚴重，12個月后仍未恢復(fù)正常水平。據(jù)報道，神經(jīng)叢刺激可顯著減少術(shù)后炎癥細胞因子的釋放[4]，而神經(jīng)叢消融導(dǎo)致的自主神經(jīng)系統(tǒng)失衡，可能誘發(fā)炎癥反應(yīng)，后者可進一步引起細胞肥大、凋亡和壞死，進而引發(fā)心房超微結(jié)構(gòu)損傷和心房間質(zhì)纖維化。②心房去神經(jīng)支配。Havranek等[6]報道了射頻消融術(shù)后左房壁的水腫變化通常延伸到遠離肺靜脈消融區(qū)域，這些區(qū)域并沒有受到射頻消融能量的直接影響。同樣的，所獲得的靶心房組織區(qū)域也是消融熱量難以到達的部位，但電鏡下所呈現(xiàn)的心肌超微結(jié)構(gòu)卻發(fā)生顯著損傷性改變。

迄今為止，導(dǎo)致發(fā)生上述變化的機制仍不清楚。推測心房去神經(jīng)支配可能是造成這些變化的原因。眾所周知，心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)形成了由多個神經(jīng)叢和Marshall韌帶組成的相互連接的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。這些神經(jīng)叢通常嵌入位于心外膜的脂肪墊中，調(diào)節(jié)和影響心肌內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[7]，以及附近心房組織的功能[8]。動物實驗表明，心臟內(nèi)在自主神經(jīng)系統(tǒng)釋放的乙酰膽堿可以引起心房復(fù)雜碎裂電位激活[9]。本研究中消融部位及臨床上的房顫消融術(shù)式，其消融區(qū)域往往都是神經(jīng)叢和神經(jīng)纖維分布最集中、最密集的部位，消融后除了完成肺靜脈-左房之間的電隔離、消除房顫維持的基質(zhì)外，同時也均實現(xiàn)了經(jīng)意或不經(jīng)意的不同程度的去神經(jīng)作用。大量研究表明，周圍神經(jīng)損傷后，失神經(jīng)骨骼肌會出現(xiàn)體積縮小、收縮功能喪失等肌萎縮現(xiàn)象，肌纖維萎縮的同時存在廣泛的纖維化。在本研究中，也觀察到神經(jīng)叢消融導(dǎo)致心房肌肉去神經(jīng)支配的這種慢性損傷，導(dǎo)致靶組織周圍細胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生和積累。由于心房神經(jīng)叢具有復(fù)雜的神經(jīng)化學(xué)解剖結(jié)構(gòu)，具有顯著影響心肌功能和調(diào)節(jié)心肌營養(yǎng)的副交感神經(jīng)和交感神經(jīng)元，因此推測上述現(xiàn)象可能是由于神經(jīng)元到靶心房組織的突觸傳遞中斷所致。除了上述機制外，免疫反應(yīng)和Ca2＋超載可能會導(dǎo)致靶心房的超微結(jié)構(gòu)損傷，但這些解釋迫切需要進一步研究證實。

在過去的約30年中，房顫射頻消融逐漸成為維持竇性心律的一種重要的非藥物治療方法[10]。對于陣發(fā)性房顫患者，盡管射頻消融的首次成功率達到了70%～80%，但依然有不少患者在射頻消融后房顫再發(fā)，并成為影響房顫射頻消融遠期獲益的的重要因素。而持續(xù)性房顫的消融成功率更低，復(fù)發(fā)率更高。在Schreiber等[11]的一項研究中，493 名持續(xù)性房顫患者接受了導(dǎo)管消融術(shù)。單次和多次手術(shù)成功率分別為20.1%和55.9%，且消融后房顫復(fù)發(fā)率隨時間增加。以往的研究表明，單次導(dǎo)管射頻消融成功的患者中約有40%在隨后的3年內(nèi)復(fù)發(fā)房顫，20%～30%的患者需要多次消融術(shù)[12－14]。筆者前期動物實驗發(fā)現(xiàn)，犬神經(jīng)叢消融遠期房顫誘發(fā)率增加[2]。就房顫復(fù)發(fā)的機制而言，環(huán)肺靜脈隔離的不連續(xù)性和非透壁損傷引起的電傳導(dǎo)恢復(fù)是一個重要因素，在本研究中，從透射電鏡下觀察，消融后即刻及遠期均可出現(xiàn)線粒體形態(tài)異常、心肌細胞肌原纖維排列紊亂、閏盤不連續(xù)、并出現(xiàn)糖原聚集、心肌間質(zhì)纖維化。這種射頻消融后心房去神經(jīng)支配引起的心房組織超微結(jié)構(gòu)損傷，是否能夠為無法解釋的臨床房顫消融后復(fù)發(fā)提供新的線索，值得關(guān)注。

有趣的是，一項多中心、前瞻性、觀察性隊列研究對260名房顫患者在消融前接受延遲增強MRI成像檢測，發(fā)現(xiàn)左房纖維化每增加1%，射頻消融術(shù)后房顫復(fù)發(fā)率增加15.3%[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，射頻消融遠期消融區(qū)周圍失神經(jīng)支配的靶心房肌發(fā)生纖維化，而心房纖維化則是影響房顫復(fù)發(fā)的強烈潛在因素[16]，心肌纖維化破壞心肌細胞偶聯(lián)的過程，導(dǎo)致細胞束之間細胞外基質(zhì)擴張，改變了心房超微結(jié)構(gòu)逐漸形成房顫發(fā)生的基質(zhì)。然而，心房去神經(jīng)支配與心房組織纖維化之間的關(guān)系仍不清楚。許多基礎(chǔ)和臨床研究表明，神經(jīng)損傷等因素引起的去神經(jīng)支配不僅會導(dǎo)致神經(jīng)支配區(qū)肌肉組織萎縮，還會改變多種神經(jīng)生長因子的表達水平，如GDNF、BDNF、NT3、NT4、NGF[17]。一些神經(jīng)生長因子不僅參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和神經(jīng)元的髓鞘形成，而且在生物體中發(fā)揮著更廣泛的作用，如促進多種內(nèi)臟纖維化的發(fā)生[18]。進一步闡明心房去神經(jīng)作用與房顫遠期復(fù)發(fā)及其確切機制是我們未來面臨的重要研究課題。