張向前，李楠，解新明

表觀遺傳學綜合性實驗設(shè)計與探討

張向前1，李楠2，解新明1

1. 華南農(nóng)業(yè)大學林學與風景園林學院，廣州 510642 2. 華南農(nóng)業(yè)大學基礎(chǔ)實驗與實踐訓(xùn)練中心，廣州 510642

表觀遺傳學是構(gòu)筑完整的遺傳學架構(gòu)的必要內(nèi)容，是現(xiàn)代遺傳學教學的重點和難點之一。為了使學生更好地掌握這方面知識，本文以科學研究中發(fā)現(xiàn)的一個具有表觀遺傳特性的水稻突變體(,)為實驗材料，設(shè)計了一個表觀遺傳學綜合性實驗。水稻突變體植株變矮、穗長縮短、穗型直立且著粒密度增加。突變機理研究表明，DNA甲基化修飾變異引起過量表達是產(chǎn)生突變表型的原因。該實驗以突變體表型觀測作為切入點，將科學研究與課程教學、課程實驗與開放實驗深度融合，向?qū)W生展現(xiàn)了一個典型表觀遺傳學研究課題的完整脈絡(luò)和前沿技術(shù)。通過該實驗，學生能對表觀遺傳學有一個更為直觀的認識，可深入理解表型與基因型、表觀遺傳修飾與基因表達之間的關(guān)系，有助于培養(yǎng)學生的科學思維和創(chuàng)新能力。

表觀遺傳學；綜合性實驗；實驗教學；DNA甲基化

遺傳學是探究生物遺傳和變異規(guī)律的科學，是生命科學領(lǐng)域的基礎(chǔ)學科。表觀遺傳學則是遺傳學的重要分支，研究一切非DNA序列改變引起的可遺傳變異。表觀遺傳變異擴大了真核生物的表型多樣性，能夠?qū)ι锏谋硇秃桶l(fā)育進程產(chǎn)生重要影響，可以解釋很多經(jīng)典遺傳學所無法解釋的現(xiàn)象[1,2]。然而如何突破傳統(tǒng)遺傳學知識架構(gòu)，將表觀遺傳學更好地融入現(xiàn)代遺傳學教學中，向?qū)W生呈現(xiàn)系統(tǒng)、完整的遺傳學知識，是目前教學改革中值得深入思考的問題。

目前，華南農(nóng)業(yè)大學遺傳學實驗教學中應(yīng)用的綜合性實驗，以傳授經(jīng)典遺傳學理論知識和實驗技能為主的內(nèi)容較為成熟，且在教學應(yīng)用上已形成相對穩(wěn)定的課程實驗和課程開放性實驗相結(jié)合的教學模式，但在知識的深度和廣度方面還有提升空間。當前，為適應(yīng)高等農(nóng)林教育發(fā)展改革的需要，遺傳學需開展科教融合人才培養(yǎng)模式探索[3]。擬在已有課程教學內(nèi)容的基礎(chǔ)上，融合科學研究的前沿性和創(chuàng)新性等優(yōu)勢，設(shè)計創(chuàng)新、有挑戰(zhàn)的新實驗項目提升學生實踐應(yīng)用能力和創(chuàng)新研究能力。

華南農(nóng)業(yè)大學科學研究團隊從粳稻“中花11”中篩選到一個不完全顯性遺傳的突變體，該突變雜合體植株略矮而穗長顯著變短，命名為()，是一個典型的表觀遺傳突變體[4]。本文利用該特異材料，設(shè)計了一個表觀遺傳學綜合性實驗項目。該項目有助于學生對遺傳學知識的全面認識和理解，能幫助學生理清表型與基因型、表觀遺傳修飾與基因表達之間的關(guān)系。從技術(shù)層面上，通過該實驗項目，學生可學習到RT-PCR和甲基化檢測等新技術(shù)。就教學層面而言，本實驗項目著力于培養(yǎng)學生在觀察中發(fā)現(xiàn)并提出問題，在實踐中獨立思考并探索解決問題的能力。同時，在自主探究實驗中鼓勵學生運用已有知識去嘗試解決新問題，對培養(yǎng)學生的實際應(yīng)用和創(chuàng)新研究能力有著重要的實踐意義。

1 實驗材料的背景與設(shè)計思路

稻穗和花序的形態(tài)結(jié)構(gòu)對水稻穗型塑造及提高水稻產(chǎn)量有著重要意義。在高等植物中，由表觀遺傳變異引起稻穗突變的例子有限。本文所述的水稻突變體是1例不完全顯性遺傳的自然變異突變體。該突變雜合體植株略矮而穗長顯著變短，突變純合體更加矮小，頂端分生組織異常，稻穗分化嚴重受損。有趣的是，該突變有低頻率的自發(fā)回復(fù)突變現(xiàn)象，因而個別單株的不同分蘗甚至同一稻穗的不同穗分支都可呈現(xiàn)野生型與突變型共存的現(xiàn)象[4]。這些嵌合體表型是表觀遺傳變異的典型特征，暗示可能是1個表觀遺傳突變體。水稻突變體可跨代穩(wěn)定遺傳，目前已通過圖位克隆(map-based cloning)技術(shù)將該基因定位在第1染色體上。進一步研究表明，基因的DNA序列沒有改變，而基因的DNA甲基化修飾變異引起過量表達是造成突變體表型的原因[4]。

為使水稻突變體更好的應(yīng)用于實驗教學，課題組進行如下教學設(shè)計。首先，與學生一起回顧孟德爾遺傳學理論知識，提出“不完全顯性遺傳會在后代表型中表現(xiàn)出怎樣的特征？”，提供給學生突變體與野生型稻穗，引導(dǎo)學生觀察表型差異。并對該材料的F1雜合體和F2群體進行表型調(diào)查和遺傳分析，以闡明突變表型不完全顯性遺傳現(xiàn)象和低頻率的自發(fā)回復(fù)突變現(xiàn)象，由此提出科學問題與研究方法。其次，在遺傳分析的基礎(chǔ)上，進一步開展目的基因的圖位克隆和候選基因突變位點分析，引導(dǎo)學生分析DNA序列變異和基因表達變化，發(fā)現(xiàn)DNA序列無差異而基因表達有差異，有悖于經(jīng)典的突變，進一步提出可探索的問題。最后，引導(dǎo)學生進入自主探究性實驗，獨立開展表觀遺傳修飾與基因表達關(guān)系的研究。該實驗整個教學設(shè)計基于問題引導(dǎo)式教學模式(problem based learning, PBL)，即“觀察現(xiàn)象——提出科學研究問題——實踐研究問題——分析問題——再實踐研究問題——得出科學結(jié)論”，實現(xiàn)學生科學研究思維和創(chuàng)新研究能力的培養(yǎng)[5]。

2 教學實驗設(shè)計

2.1 實驗?zāi)康?/h3>

掌握基因圖位克隆和RT-PCR技術(shù)，了解表觀遺傳學理論基礎(chǔ)及研究方法，探究DNA甲基化修飾與基因表達的關(guān)系，提升學生科學思維與創(chuàng)新研究的能力。

2.2 實驗涉及理論知識點

該實驗涉及的理論知識點主要包括表觀遺傳學、DNA甲基化修飾、圖位克隆等。表觀遺傳學是研究基因在核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，DNA甲基化、基因組印記、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑及核仁顯性等因素的改變，導(dǎo)致基因表達甚至生物表型發(fā)生的可遺傳變異，是遺傳學中非常重要的分支學科。DNA甲基化(DNA methylation)是在動植物體內(nèi)廣泛存在的一種DNA共價修飾形式，在DNA甲基化酶/去甲基化酶的作用下，對DNA的胞嘧啶(C)或腺嘌呤(A)(主要是C)進行甲基化的添加/移除修飾，能夠在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)[6～8]。

DNA 甲基化修飾與基因表達調(diào)控密切相關(guān)。一般來說，DNA序列尤其是基因的啟動子區(qū)發(fā)生甲基化，往往抑制基因表達，而去甲基化則會造成基因過量表達[9,10]。此外，有證據(jù)表明，基因下游區(qū)段的甲基化狀態(tài)也參與了基因表達調(diào)控[4,11]。

圖位克隆又稱定位克隆(positional cloning)，該方法利用目標性狀分離群體，通過分析目標性狀與已知分子標記的遺傳連鎖關(guān)系，“按圖索驥”地實現(xiàn)目的基因的初步定位、精細定位、物理作圖，直至克隆目的基因[12]。

2.3 實驗材料

水稻突變體是來自粳稻品種“中花11”的1例自然變異突變體。該突變體植株略矮而穗長顯著變短，呈不完全顯性遺傳。水稻突變體自2013年發(fā)現(xiàn)以來已連續(xù)繁殖17個世代，其候選基因()已通過圖位克隆策略獲得。

將水稻突變體與野生型雜交，并將F1自交獲得F2群體(A群體)，以突變體、野生型、F1植株及F2群體的成熟小穗，F(xiàn)2群體對應(yīng)的水稻葉片作為突變體表型鑒定及遺傳特性分析實驗材料。將來自與秈稻品種華粳秈74構(gòu)建的F2群體用作突變體基因定位的分離群體(B群體)。所有材料均種植于華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)場，單株種植，常規(guī)管理。

2.4 實驗方法

2.4.1 突變體的鑒定和遺傳分析

將學生分組，提供給每組同學野生型、突變純合體、突變雜合體小穗各3株，先讓學生觀察和測量表型差異。再提供給學生A群體小穗210株，結(jié)合親本及F1雜合體表型進行遺傳分析。配置直尺測量，并運用SPSS18.0軟件進行卡方檢驗和檢驗。

2.4.2 目的基因的圖位克隆和候選基因突變位點分析

選取4對SSR多態(tài)性標記和2對Indel (insertion- deletion)標記(表1)，檢測B群體200株中突變體表型單株基因型，比較其電泳帶型類別，掌握圖位克隆中連鎖分析的遺傳學原理，學習遺傳距離的計算方法。隨后，結(jié)合科學研究結(jié)果要求學生進一步分析圖位克隆所獲得的4個候選基因，鑒定候選基因突變位點。

2.4.3 基因表達分析

通過半定量RT-PCR方法完成基因表達分析，具體步驟如下：提取水稻樣品總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 純度及完整程度，–20℃保存或者直接進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。以cDNA為模板，設(shè)計引物(引物序列見表1)，擴增目的片段，經(jīng)電泳檢測，分析相關(guān)基因表達變化。

2.4.4 DNA甲基化分析和甲基化抑制劑處理

DNA甲基化分析：通過亞硫酸氫鹽修飾后測序法分析基因甲基化修飾變異情況，方法參照文獻[10]，操作步驟簡述如下：

(1)用亞硫酸氫鹽處理野生型(野生型“中花11”) 和突變體基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；

表1 實驗所用引物

(2)設(shè)計引物，以處理前后的基因組DNA為模板進行PCR擴增；

(3)將目的片段純化進行TA克隆，挑選陽性克隆測序；

(4)將用亞硫酸氫鹽處理測得的序列與未處理序列比對，統(tǒng)計甲基化位點和數(shù)量，并分析野生型和突變體的甲基化差異。

甲基化抑制劑處理：利用甲基化抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine, 5-aza-dC)處理野生型“中花11”萌發(fā)的種子，一周后取樣進行表達量分析，具體處理參照Zhang等[10]方法。

3 實驗結(jié)果與討論

3.1 水稻esp突變體的表型特征和遺傳分析

與野生型“中花11”相比，該突變雜合體植株略矮，而穗長及枝梗長度顯著縮短，引起穗粒數(shù)減少，而突變純合體相關(guān)表型更加嚴重，植株明顯矮化，頂端分生組織異常，稻穗分化嚴重受損(圖1)。對210株的F2群體(A群體)進行遺傳分析，野生型58株，短穗型103株，嚴重矮桿49株，其分離比例符合1∶2∶1 (χ2= 0.85,>0.05)，表明突變表型為不完全顯性遺傳。有趣的是，該突變有低頻率的自發(fā)回復(fù)突變現(xiàn)象，因而個別單株不同分蘗甚至同一稻穗的不同的穗分支可呈現(xiàn)野生型與突變型共存的現(xiàn)象(圖1)。

3.2 突變基因的圖位克隆和候選基因分析

利用與秈稻品種華粳秈74 構(gòu)建的F2群體(B群體)突變株對進行基因定位，發(fā)現(xiàn)與第1染色體上的標記RM140和RM466連鎖，遺傳距離分別為0.7 cM 和5 cM。利用兩標記間發(fā)展的Indel標記，已將該基因(突變位點)定位于51.2 kb 區(qū)間(圖2A)。在這個區(qū)間內(nèi)有4個基因，分別為、、和。為了鑒定突變位點，本實驗依據(jù)水稻基因組序列數(shù)據(jù)設(shè)計引物，擴增野生型和突變體的目的區(qū)段，測序分析表明，在51.2 kb定位區(qū)間內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)DNA序列的改變。

圖1 水稻esp突變體表型特征

圖2 ESP基因圖位克隆和表達分析

此外，我們對定位區(qū)間的4個基因在突變體和野生型中的表達量進行了檢測，結(jié)果顯示，、和這3個基因在突變體中的表達量和野生型相比沒有顯著差異(數(shù)據(jù)略)。基因在野生型中幾乎檢測不到，但是在突變體中其表達水平顯著上調(diào)，且該基因的表達量在純合體中高于雜合體(圖2B)。以上基因表達分析結(jié)果表明，可能是的候選基因。

進一步對突變嵌合體植株(既有正常表型稻穗又有突變表型稻穗的突變體植株)表達量進行分析，結(jié)果表明，嵌合體有直立密穗表型的分蘗其基因的表達量高于同一植株上正常表型的分蘗(圖2C)。以上結(jié)果表明，突變體中的直立密穗表型是由于基因的過量表達所引起，進一步支持就是的候選基因。

3.3 表觀遺傳修飾與ESP的表達調(diào)控

由于基因DNA序列沒有改變，但是候選基因的表達量卻有極顯著的差異，因此，我們推測目的基因可能發(fā)生了表觀遺傳變異。DNA甲基化是最常見的表觀遺傳變異。為此，本實驗通過氫鹽分析了甲基化修飾變異情況，結(jié)果表明，與野生型(高甲基化狀態(tài))相比突變體基因的3′端下游發(fā)生了DNA去甲基化，其具體的甲基化變異位點發(fā)生在基因下游289～601 bp區(qū)間(圖3A)。研究表明，DNA去甲基化通?？梢詫?dǎo)致基因的過量表達[11]。本研究中突變體基因下游區(qū)段的去甲基化引起了基因的過量表達，進而導(dǎo)致突變表型，與上述結(jié)論相吻合。

5-aza-dC是一種胞苷類似物，能夠通過限制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶來抑制DNA甲基化，進而調(diào)節(jié)基因表達。為了進一步闡明基因的表達與甲基化修飾的關(guān)系，本實驗利用甲基化抑制劑5-aza-dC處理野生型“中花11”幼苗(高甲基化狀態(tài))，然后對基因進行表達量分析。結(jié)果表明，相比于未處理的幼苗，經(jīng)甲基化抑制劑5-aza-dC處理的幼苗中，基因的表達量顯著上調(diào)(圖3B)，說明野生型基因下游區(qū)段的去甲基化可引起基因的過量表達，是調(diào)控基因表達的關(guān)鍵因素，是導(dǎo)致突變表型的原因。

圖3 ESP基因DNA甲基化和基因表達分析

4 實踐教學中的課堂組織方式

4.1 以科研思路為導(dǎo)向，創(chuàng)新課堂教學方法

本實驗主要以科學研究的思路作為教學主線，以有趣的材料表型為切入點，以表型調(diào)查、遺傳特性分析、圖位克隆、DNA甲基化分析及RT-PCR檢測技術(shù)為學習重點。首先，結(jié)合孟德爾遺傳定律與不完全顯性理論知識，引導(dǎo)學生通過表型觀察發(fā)現(xiàn)有趣的表型現(xiàn)象，提出科學研究問題；其次，將基因擴增與測序分析相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)基因的DNA序列無差異而基因表達有差異，有悖于經(jīng)典遺傳的突變類型，進一步提出可探索的問題；最后，將課程實驗與課程開放實驗相結(jié)合，引入DNA甲基化理論知識和RT-PCR技術(shù)，引導(dǎo)學生運用科學研究的思維和方法分析突變的本質(zhì)原因，幫助學生理清表型與基因型、基因修飾與基因表達的內(nèi)在聯(lián)系，學會科學研究的思維方法與技術(shù)手段，提升理論與實踐、知識與技術(shù)的整合運用能力。

本部分共4次課的課程實驗內(nèi)容，每周1次課，每次課4個學時。

(1)突變體鑒定及遺傳特性分析1次課

首先結(jié)合孟德爾遺傳學理論知識，和學生探討遺傳分析方法與不完全顯性現(xiàn)象。拋出一個問題“不完全顯性遺傳會在后代表型中如何表現(xiàn)？”讓學生結(jié)合突變體、野生型及F1雜合體稻穗材料進行觀察，發(fā)現(xiàn)三者在稻穗長度與形態(tài)上的差異。再次提供給每組學生200株F2群體(A群體)的小穗進行遺傳分析，提醒學生留意觀察嵌合突變體表型，通過與常規(guī)變異相比較引導(dǎo)學生總結(jié)出突變體表型特征(表型的可逆性)，并獨立提出科學研究問題。

(2)基因定位和候選基因突變位點分析2次課

第一次課：水稻葉片DNA和幼穗RNA提取。結(jié)合遺傳學中遺傳物質(zhì)的分子基礎(chǔ)章節(jié)知識，講授基因定位方法和RNA提取技術(shù)。引導(dǎo)學生提取親本、雜合體及F2群體中突變純合體的DNA和RNA。

第二次課：講解分子標記在實踐中的設(shè)計與應(yīng)用，學會分析電泳和測序結(jié)果。用已提取的基因定位群體DNA為模板，比較6對標記帶型，掌握基因定位的本質(zhì)—標記與表型的連鎖分析。待學生完成標記連鎖分析后，結(jié)合研究結(jié)果，教師向?qū)W生揭示該突變基因的位置。引導(dǎo)學生學會分析突變體和野生型候選基因測序結(jié)果，并啟迪學生思考“候選基因DNA序列無改變而引起表型變異的可能原因”。

(3)候選基因表達分析1次課

重點結(jié)合基因表達與轉(zhuǎn)錄理論知識點，講解反轉(zhuǎn)錄方法和RT-PCR技術(shù)。用上次課提取的RNA為模板開展實驗，要求學生以野生型和突變體幼穗為材料分組獨立完成定位區(qū)間4個候選基因表達分析。通過該實驗學生會發(fā)現(xiàn)候選基因的表達量有著極顯著的差異，由此可以引導(dǎo)學生推測目的基因可能發(fā)生了表觀遺傳變異。結(jié)合表觀遺傳變異的理論知識點，和學生開展表觀遺傳變異的討論與思考。

4.2 引導(dǎo)學生進入自主探究性實驗

通過以上實驗，已為學生打開表觀遺傳學研究的大門。如何引領(lǐng)學生進一步獨立探索引起該表型變異的核心原因，是該研究型實驗教學的重點和難點之一。在接下來的自主探究性實驗中，將采用任務(wù)驅(qū)動和自主學習相結(jié)合的方法，以學生為主體，引導(dǎo)學生進行文獻查閱、自主設(shè)計實驗方案、獨立開展相關(guān)實驗，以培養(yǎng)學生的獨立思考與探索研究能力。具體教學方法如下：

首先老師向?qū)W生提出問題：表觀遺傳學修飾有哪些？應(yīng)該先從哪里入手開展研究？讓學生帶著問題去查閱文獻資料，了解表觀遺傳修飾的類型及其研究方法。并引導(dǎo)學生總結(jié)分析前人研究結(jié)果，通過比較各種表觀遺傳修飾，理解DNA甲基化是植物基因組DNA最常見的一種表觀遺傳修飾，是維持基因組穩(wěn)定性的主要手段，在調(diào)節(jié)植物發(fā)育中起著重要作用，讓學生應(yīng)用科學研究思維去推測發(fā)生DNA甲基化的可能性。

確定DNA甲基化修飾研究方向后，需要學生理清DNA甲基化修飾與基因表達的關(guān)系，因此要求學生查閱前沿研究成果，例如Ichino等[13]發(fā)表的最新研究論文，幫助學生了解DNA甲基化介導(dǎo)基因沉默的發(fā)生與維持的機制等。在此基礎(chǔ)上，學生需思考如何開展DNA甲基化修飾變異研究，并提出DNA甲基化檢測可供選擇的方案(例如甲基化特異性PCR、氫鹽測序法或全基因組的甲基化分析)，通過比較分析，選用其中一種方法開展研究。在此過程中，教師需及時跟進、解疑答惑，并做好引導(dǎo)。教學實踐表明，大部分學生會優(yōu)先考慮氫鹽測序法鑒定DNA甲基化修飾。

確定該方法后，師生共同討論并完善實驗方案，開展DNA甲基化研究。在該研究方案中因氫鹽處理樣品及其后續(xù)產(chǎn)物，需根據(jù)實際教學學時數(shù)進行調(diào)整，如果時間充裕，會引導(dǎo)學生完成該實驗。若時間有限，至少需讓學生氫鹽發(fā)現(xiàn)甲基化位點，分析野生型和突變體的甲基化差異。教學實踐表明，在完成甲基化變異位點分析后，大多數(shù)學生對DNA甲基化修飾程度與基因表達活性呈反比關(guān)系都會有較好的把握，但是對DNA甲基化發(fā)生位點的總結(jié)多有疏漏，如對基因啟動子區(qū)DNA甲基化修飾影響基因表達活性容易理解，而對基因下游DNA甲基化修飾與基因表達調(diào)控關(guān)注不多，會對本文的研究結(jié)果存疑。鑒于此，教師可提出下一步研究問題“如何證實突變體中DNA去甲基化修飾是基因高表達的原因”。

為了進一步闡明基因的表達與甲基化修飾的關(guān)系，還需引導(dǎo)學生從突變體自身特點入手，討論表達調(diào)控的實驗方案。本文的突變體是1例自然變異突變體，相較與野生型基因的高甲基化修飾狀態(tài)，突變體中位點是低甲基化修飾(去甲基化)。因此如果通過某種途徑人工創(chuàng)制變異，將野生型的高甲基化修飾轉(zhuǎn)變?yōu)榈图谆癄顟B(tài)，那么野生型的基因表達水平亦會隨之改變。學生經(jīng)過分析，思路會更加清晰，通過查閱文獻，會選擇甲基化抑制劑處理野生型，并通過基因表達分析，驗證假設(shè)。正如預(yù)期，在甲基化抑制劑處理的幼苗中，基因的表達量顯著上調(diào)(圖3B)，表明基因甲基化是導(dǎo)致突變表型的原因。另外，由于基因具有長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA, lncRNA)屬性，其甲基化區(qū)段是典型的CpG island，仍有很多值得學生進一步探索和思考的科學問題。

5 表觀遺傳在遺傳學案例教學中的思考

科研與教學是緊密結(jié)合并相互促進的，科研的研究思路和前沿信息，常常被帶入教學中激發(fā)學生對遺傳學理論知識的學習興趣，培養(yǎng)學生的科學研究能力和知識應(yīng)用能力[14]。本實驗在進行科教融合的實驗設(shè)計中，發(fā)現(xiàn)有幾個問題值得探討。表觀遺傳學教學無論是從材料的特異性要求，還是知識的廣度深度上，都是遺傳學教學中的一個難點。首先，在表觀遺傳學實驗設(shè)計中材料是關(guān)鍵，典型的材料可以將復(fù)雜的表觀遺傳學知識形象化和簡單化，更有利于學生深刻的理清表型與基因型、基因修飾與基因表達的本質(zhì)聯(lián)系。其次，在當前的基礎(chǔ)課程之上，如何能更好的幫助學生拓寬知識深度與廣度，提升學生的知識整合與應(yīng)用能力，實驗的巧妙設(shè)計非常關(guān)鍵。該實驗在目的基因克隆及候選基因突變位點分析中，為下一步表觀遺傳學研究埋下了伏筆，即引導(dǎo)學生發(fā)現(xiàn)基因的DNA序列未發(fā)生改變，而通過基因表達分析，發(fā)現(xiàn)基因在突變體中表達顯著提高，以推測目的基因可能發(fā)生了表觀遺傳變異。同時，為了培養(yǎng)學生嚴謹、勤思、獨立創(chuàng)新的科學研究習慣，特結(jié)合課程開放實驗平臺，設(shè)計了自主探索性實驗。學生通過自主探索性實驗，不僅可檢驗學生對已學知識的靈活運用能力，且能大大改觀學生對科學研究高不可攀的心理，增強研究的自信。

考慮到實驗學時數(shù)的限制，本試驗方案簡化了圖位克隆實驗，然而在該實驗中有2個關(guān)鍵知識點需提醒學生注意：(1)正確選配親本，構(gòu)建基因定位分離群體。一般來講，除突變體作為親本外，有別于表型遺傳分析時的親本選擇，構(gòu)建基因定位分離群體需要選擇與突變體遺傳差異大的材料為另一親本，以便定位分析時有數(shù)量充足、類型多樣的多態(tài)性標記供選擇。比如本文中突變體來自粳稻品種“中花11”，那么另一親本選擇了一個秈稻品種“華粳秈74”；(2)正確選擇基因定位分離群體中表型單株類型，進行連鎖分析。對于典型的隱性突變基因定位而言，選擇分離群體中的突變體表型單株開展連鎖分析即可(可與學生討論野生型單株不作為連鎖分析的原因，進一步提出如果是顯性突變?nèi)绾芜x擇表型單株呢？不完全顯性突變又該作何選擇？)。深刻理解上述2點的前提，就是要求學生必須深刻理解基因定位(或圖位克隆)的遺傳學本質(zhì)—分子標記(基因型)與表型的連鎖分析。此外，由于DNA甲基化位點鑒定實驗的難度較大且周期偏長，受限于教學時數(shù)，本實驗方案僅要求學生通過已測序列進行DNA甲基化位點分析。但為保證研究思路和方法的完整性，需要求學生了解亞硫酸氫鹽測序法檢測基因組DNA甲基化的基本原理和基本步驟。

多年的實踐教學表明，在遺傳學教學實踐中選取典型的遺傳突變材料開展綜合性實驗是學生深入掌握相關(guān)知識的有效途徑，也是汲取最新的研究成果積極引導(dǎo)學生進行創(chuàng)新思維，開闊學生思路的有效途徑。

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Design and exploration of epigenetic comprehensive experiments

Xiangqian Zhang1, Nan Li2, Xinming Xie1

Epigenetics is the necessary content to constitute a complete genetic framework, and has become one of the focuses and difficulties of modern genetics education. Here we design a comprehensive experiment for epigenetics by utilizing a rice() mutant identified previously in our research project. Themutants show a shortened and compressed panicle phenotype, which is associated with hypomethylation in the transcriptional termination region ofgene, causingoverexpression in themutants. This experiment uses mutant phenotypic observation as a starting point, integrates scientific research and course teaching, course experiment and open experiment, and demonstrates to students the full picture of a typical epigenetic science research and leading technology. The comprehensive experiment will deepen students’ understanding of the relationship between phenotypes and genotypes, epigenetic modification and gene expression, and help them master the effective way of thinking for scientific research to further improve their ability of innovative abilities.

epigenetics; comprehensive experiment; experimental teaching; DNA methylation

2021-08-10;

2021-10-10

國家自然科學基金面上項目(編號：31671594)和華南農(nóng)業(yè)大學教學改革與研究項目(編號：JG19104, JG20046)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31671594) and Teaching Reform and Research Projects of South China Agricultural University (Nos. JG19104, JG20046)]

張向前，博士，教授，研究方向：植物分子育種。E-mail: aacrav@163.com

10.16288/j.yczz.21-294

2021/10/22 14:57:56

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20211021.1708.002.html

(責任編委: 陳德富)