朱毅，譙明，張海波，謝偉娜，楊建華

（新疆醫(yī)科大學1第一附屬醫(yī)院藥學部，烏魯木 830054；2藥學院，烏魯木齊 830011）

肺炎支原體為誘發(fā)兒童呼吸道疾病的一種常見病原體，會引起上呼吸道感染、支氣管炎、非典型肺炎等諸多病變，在學齡前、學齡兒童中肺炎支原體感染以肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniaePneu?monia，MPP）最為常見[1]。MPP疾病前期為外邪入侵，導致痰熱內蘊，氣道阻滯而致肺氣郁閉，肺絡不暢而出現(xiàn)咳嗽癥狀，疾病后期多為氣陰兩虛證[2]。中醫(yī)辨證理論認為MPP多屬溫邪上受，以肺為先，同時肺是多氣多血臟器，外邪入侵后易引起氣滯血瘀，目前對MPP的治療以清熱解毒、活血化瘀、化痰止咳為主[3]。肺炎合劑是新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院在治療小兒肺炎經(jīng)驗方的基礎上研制開發(fā)的院內制劑，臨床用于治療小兒支原體肺炎，具有清熱解毒、潤肺止咳之功效[4]。肺炎合劑是由麻黃、苦杏仁、石膏、甘草、黃芩、金銀花、板藍根和蘆根8味中藥配伍而成的中藥復方制劑，成分十分復雜，其治療MPP的作用機制尚未明確。中藥是基于中醫(yī)整體觀念、辨證論治理論，以藥物“四氣”、“五味”特性進行加減化裁的治療疾病的手段?，F(xiàn)代學者對中藥的作用機制進行了深入研究，但限于“時代”和“科學技術水平”，多數(shù)研究都只集中在單一藥物、單一單基因和單一作用機制方面，這與中醫(yī)“整體觀念”理論完全不符。網(wǎng)絡藥理學的誕生打破了單一藥物、單一靶點、單一通路研究的瓶頸，集整體、動態(tài)、分析于一體，提供了多成分-多靶點-多途徑的研究思路，為中藥復方制劑潛在機制研究提供了新的研究模式[5]。本研究在數(shù)據(jù)庫中搜索肺炎合劑的化合物和靶標蛋白，構建和分析靶標網(wǎng)絡，確定網(wǎng)絡中的核心靶標，并對其進行功能富集，以期在分子層面上探索肺炎合劑治療MPP的可能機制，流程見圖1。

圖1 基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術探究肺炎合劑治療肺炎支原體肺炎作用機制流程圖

1 材料與方法

1.1 藥物活性成分的篩選采用中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺[6]（TCMSP，http://tcmsp.com/tcmsp.php）檢索肺炎合劑中麻黃（Ephedra Herba，EH）、苦杏仁（Arme?niacae Semen Amarum，ASA）、甘草（Glycyrrhizae Ra?dix et Rhizoma，GRR）、黃芩（Scutellariae Radix，SR）、金銀花（Lonicerae Japonicae Flos，LJF）、板藍根（Isati?dis Radix，IR）和蘆根（Phragmitis Rhizoma，PR）7味藥材的化學成分；TCMSP數(shù)據(jù)庫中未檢索到石膏（Gyp?sum Fibrosum，GF），使 用TCMID數(shù) 據(jù) 庫（http://119.3.41.228:8000/tcmid/）查詢。參考文獻[7-9]的方法，設置化合物口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，獲取肺炎合劑活性成分。

1.2 活性成分作用靶點的獲取BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）設置參數(shù)為：Score cutoff≥20且P<0.05，選取符合參數(shù)要求的靶點；在Swiss Target Prediction平臺（http://www.swisstar?getprediction.ch/）上選取預測結果中參數(shù)Probability≥0.7的靶點，將兩個平臺檢索到的活性成分靶點合并，刪去重復靶點，將最終的靶點蛋白信息經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫10]（https://www.uniprot.org/）進行標準化，得到活性成分對應關鍵靶點的基因號。

1.3 疾病靶點的預測和篩選采用GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、CTD數(shù)據(jù)庫（http://ctd?base.org/）和MalaCards數(shù)據(jù)庫（https://www.malacards.org/）檢索肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniaePneumonia，MPP）疾病的靶點，將靶點合并后刪去重復項，采用韋恩平臺將藥物預測的靶點與疾病的靶點進行映射，獲得肺炎合劑治療肺炎支原體肺炎的潛在作用靶點。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡的構建將潛在靶點導入STRING[11]數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，設置蛋白互作綜合得分（interaction score）≥0.4作為篩選條件，構建PPI網(wǎng)絡，通過Cytoscape 3.8.0軟件對網(wǎng)絡進行可視化處理和分析，篩選出排名前10的核心靶點。

1.5 “藥物-成分-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡構建根據(jù)獲得的潛在靶點數(shù)據(jù)，利用Cytoscape 3.8.0軟件（http://www.cytoscape.org/）進行蛋白網(wǎng)絡結構可視化處理，構建“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡。

1.6 生物過程分析和代謝通路分析將篩選得到的潛在靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫，identifier設置為offi?cial gene symbol，list type設置為gene list，物種設置為人類，進行基因本體（GO，http://www.geneontology.org）富集分析[12]和京都基因和基因組百科全書（KEGG，http://www.kegg.jp/pathway.html）代謝通路分析[13]（P<0.01）。

1.7 分子對接驗證利用AutoDock vina軟件對肺炎合劑核心成分與核心靶點進行分子對接驗證。從PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）下載核心靶點蛋白結構（pdb格式），將受體蛋白（pdb格式）導入Pymol 2.3.4軟件，去除水分子和其原配體，再將其導入AutoDock Tools軟件，加極性氫，保存為pdbqt格式，受體蛋白的對接口袋根據(jù)其原配體的位置確定。將核心成分的mol2文件導入ChemBioOffice軟件進行結構優(yōu)化，得到配體結構的最優(yōu)構象，保存為mol2文件。采用AutoDock Vina軟件將核心成分與核心靶點蛋白進行分子對接，設置能量范圍為10，精度為20，迭代次數(shù)為100。通常認為結合能小于-5 kJ/mol時[14]，配體與受體可以較好結合。

2 結果

2.1 肺炎合劑活性成分的篩選通過TCMSP數(shù)據(jù)庫中搜索肺炎合劑各味藥的化合物成分得到結果：麻黃363個、苦杏仁113個、甘草280個、黃芩143個、金銀花236個、板藍根169個、蘆根31個；根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18的標準進行篩選，排除相同名稱共計得到110個活性成分，其中來源于麻黃6個、苦杏仁3個、甘草73個、黃芩14個、金銀花5個、板藍根7個、蘆根1個；利用TCMID數(shù)據(jù)庫檢索石膏活性成分1個。肺炎合劑中活性成分基本信息見表1。

表1 肺炎合劑中活性成分的基本信息

2.2 潛在靶點的預測通過BATMAN-TCM和Swis?sTargetPrediction平臺檢索得到活性成分靶點110個；GeneCards、CTD和MalaCards數(shù)據(jù)庫檢索得到與肺炎支原體肺炎相關靶點336個；通過Venn平臺將成分靶點與疾病靶點取交集，得到42個關鍵靶點，見圖2。

圖2 肺炎合劑治療肺炎支原體肺炎靶點韋恩圖

續(xù)表

續(xù)表

2.3 蛋白質-蛋白質相互作用PPI網(wǎng)絡的構建蛋白質-蛋白質相互作用PPI網(wǎng)路中共有42個節(jié)點（靶點蛋白），351條邊（蛋白相互作用），平均節(jié)點為16.7。度值表示連接到1個節(jié)點的線條數(shù)，用來評估網(wǎng)絡中每個節(jié)點的重要性；節(jié)點顏色越深，表明度值越大。將網(wǎng)絡導入Cytoscape軟件，通過CytoHubba插件以度（degree）為條件進行拓撲分析，篩選出排名前10的核心靶點，分別為IL6（degree=33）、MAPK8（de?gree=31）、VEGFA（degree=31）、CASP3（degree=30）、MYC（degree=29）、EGFR（degree=28）、CCND1（degree=27）、ESR1（degree=26）、CASP8（degree=23）和RELA（degree=23），見圖3、4。

圖3 潛在靶點PPI網(wǎng)絡圖

2.4 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡的構建肺炎合劑治療肺炎支原體肺炎的“藥物-成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡，在交互網(wǎng)絡中，槲皮素（degree=77）、山柰酚（degree=34）和木犀草素（degree=28）等化合物具有較多的作用靶點，提示在肺炎合劑治療肺炎支原體肺炎中發(fā)揮關鍵作用，見圖5。

圖5 “藥物-成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡

2.5 GO和KEGG富集分析在GO富集分析中，生物過程、分子功能和細胞成分分別選取富集的前20個條目繪制柱狀圖，見圖6。生物過程涉及RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控，凋亡過程的負調控，藥物反應和炎癥反應等方面；分子功能主要涉及蛋白結合，酶結合，相同蛋白結合和轉錄因子結合等方面；細胞組成涉及細胞質，細胞液，細胞核，核質和細胞膜等方面。KEGG通路分析中，按P值進行排序，選取前20條代謝通路繪制氣泡圖，見圖7。肺炎合劑治療肺炎支原體肺炎的信號通路主要包括腫瘤壞死因子信號通路，重組人白介素-17信號通路，細胞凋亡，糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路，乙型肝炎，卡波濟肉瘤相關皰疹病毒感染，人類巨細胞病毒感染等。

圖4 核心靶點互作網(wǎng)絡圖

圖6 肺炎合劑潛在靶點的GO富集分析

圖7 肺炎合劑潛在靶點的KEGG通路富集分析

2.6 分子對接驗證對接結果顯示，槲皮素、山柰酚、木犀草素3個核心成分與IL6、MAPK8、VEGFA、CASP3、MYC、EGFR、CCND1、ESR1、CASP8、RELA 10個核心靶點對接結果的Vina分值（即結合能）均小于-5 kJ/mol，其中核心成分與RELA蛋白的相互作用最佳，Vina分值均小于-8 kJ/mol，說明核心成分與核心蛋白靶點均能較好結合，見表2。核心成分槲皮素、山柰酚、木犀草素與RELA蛋白的分子對接圖見圖8。

圖8 蛋白分子對接構象圖

表2 核心成分與核心靶蛋白的對接結果

3 討論

本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法構建藥物、靶點、通路、疾病之間的多重網(wǎng)絡，深度解析肺炎合劑治療肺炎支原體肺炎的多成分-多靶點-多通路作用機制。在肺炎合劑治療MPP核心網(wǎng)絡中，篩選出3個核心潛在活性成分及10個潛在活性靶點。經(jīng)分子對接驗證，槲皮素、山柰酚、木犀草素3個核心成分與IL6、MAPK8、VEGFA、CASP3、MYC、EGFR、CCND1、ESR1、CASP8、RELA核心蛋白靶點顯示出較強的結合能力，體現(xiàn)了肺炎合劑多成分、多靶點協(xié)同發(fā)揮作用的特點。研究表明，槲皮素可激活細胞內信號轉導通路調控機體的炎癥反應和免疫應答，通過降低炎癥因子IL-6、IL-1β等的分泌，對支氣管上皮細胞炎癥反應有一定的保護作用[15]。山柰酚可以通過拮抗NF-κB和STAT3信號通路的激活，減弱IL-6水平，在體內炎性調節(jié)中發(fā)揮重要作用[16]。木犀草素具有較強的消炎、抗病毒、抗菌等作用[17]。由上可知，肺炎合劑中篩選出的活性化合物主要有抗炎、抗病毒等作用，可能在MPP引發(fā)的炎癥反應中發(fā)揮一定的干預作用。PPI網(wǎng)絡中，IL6、MAPK8、VEGFA、CASP3、MYC等為肺炎合劑治療MPP的核心靶點，主要涉及炎癥反應、病毒感染、免疫調節(jié)、細胞凋亡等方面。

KEGG通路分析顯示，前20條代謝通路中有7條通路與病毒感染相關，包括卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染、人類巨細胞病毒感染、EB病毒感染、沙門氏菌感染、乙型肝炎、麻疹、幽門螺桿菌感染，表明肺炎合劑在抗病毒中起重要作用。另外，基因數(shù)目在IL-17信號通路、TNF信號通路、糖尿病并發(fā)癥AGERAGE信號通路、凋亡等通路上富集較多。IL-17可激活MAPKs和NF-κB下游信號通路，從而使趨化因子和細胞因子的表達增加，在炎癥調節(jié)中起關鍵作用[18]。TNF信號通路可以誘導細胞凋亡、炎癥和免疫[19]。AGEs通過與其受體結合，激活MAPK和NFκB信號通路，促進炎性細胞因子的表達，從而誘導慢性細胞活化和組織損傷[20]。

綜上所述，肺炎合劑發(fā)揮治療MPP的作用是多成分、多靶點、多通路的協(xié)同作用，體現(xiàn)了中醫(yī)整體性的特點。本研究為肺炎合劑發(fā)揮治療MPP作用提供依據(jù)，同時也為其進一步實驗探究和臨床應用提供參考。