劉鈺坤，周東波，汪耀富，沈程文，李彥，戴林建*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，湖南 長沙 410007)

煙葉調(diào)制是烤煙品質(zhì)形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1-3]，目前主要采用密集烘烤方式調(diào)制[4]。筆者以云煙87 中部葉為原料，借鑒傳統(tǒng)紅茶加工工藝[5-8]，即萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥4 個(gè)階段，通過調(diào)控反應(yīng)條件進(jìn)行調(diào)制，檢測煙葉調(diào)制過程中產(chǎn)生的代謝物，對不同處理的煙葉樣本進(jìn)行評吸，研究不同工藝參數(shù)對調(diào)制結(jié)果的影響，探討煙草仿紅茶調(diào)制工藝的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

供試烤煙品種為云煙87。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019 年在湖南省瀏陽市永安鎮(zhèn)進(jìn)行。取適熟中部(8～9 有效葉位)煙葉。借鑒紅茶加工方法，即萎凋→揉捻→發(fā)酵→干燥加工煙葉。A1，覆膜萎凋；A2，烤房萎凋。B1，發(fā)酵6 h；B2，發(fā)酵8 h。C1，68 ℃烘干；C2，85～105 ℃烘干(兩段式烘干)。共8 個(gè)處理：A1B1C1、A1B1C2、A1B2C1、A1B2C2、A2B1C1、A2B1C2、A2B2C1、A2B2C2，以常規(guī)三段式密集烘烤[9]為對照(CK)。

覆膜萎凋：將煙葉平鋪于萎凋槽(6CWD-5M)中，攤?cè)~2～3 層，用塑料薄膜覆蓋萎凋槽，開機(jī)萎凋?？痉课颍簩熑~掛桿，放入烤房，促變黃萎凋。揉捻：將萎凋后的煙葉去除主脈，均勻切成小塊(10 cm×10 cm)投入揉捻機(jī)(6CR-40)中揉捻20 min。發(fā)酵：將揉捻后煙葉置入發(fā)酵筐，堆葉厚度10 cm，留出氣孔，在煙葉上下均勻地鋪蓋潤濕的紗布，放入發(fā)酵機(jī)(6CHFJ-5B)中或置于干燥陰涼處進(jìn)行發(fā)酵。干燥：煙葉平鋪于干燥盤中，提香機(jī)(6CHT-6.0)預(yù)熱，達(dá)到指定溫度后進(jìn)行干燥。兩段式烘干：先在85 ℃條件下烘干15 min，取出煙葉靜置20 min回潮，其間將提香機(jī)溫度提升至105 ℃，再烘干煙葉。

烤煙樣香氣化學(xué)成分檢測(LC-MS 和GC-MS)參照鄭慶霞等[10]的方法進(jìn)行。

邀請湖南中煙有限責(zé)任公司技術(shù)中心具有煙草行業(yè)評吸資質(zhì)的7 位專家，對仿紅茶調(diào)制煙葉樣品進(jìn)行評吸，評吸指標(biāo)包括香氣質(zhì)、香氣量、濃度、勁頭、刺激性、雜氣、余味、燃燒性等?？紤]到調(diào)制產(chǎn)品與常規(guī)烤煙有異，評吸結(jié)果只用文字表述記錄。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；采用Python、MetaboAnalyst 在線應(yīng)用進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 仿紅茶調(diào)制工藝煙葉的評吸結(jié)果

仿紅茶調(diào)制工藝煙葉的評吸結(jié)果(表1)表明，仿紅茶調(diào)制工藝煙葉樣品的評吸結(jié)果優(yōu)于對照三段式烤煙樣品的；覆膜萎凋(A1)評吸結(jié)果優(yōu)于烤房萎凋(A2)的，85～105 ℃兩段式烘干(C2)優(yōu)于68 ℃恒溫烘干(C1)的；對照樣品有稍有枯焦氣息等負(fù)面評價(jià)，烤房萎凋(A2)樣品除A2B2C1外都出現(xiàn)了有青雜氣等負(fù)面評價(jià)，總體評吸結(jié)果與對照樣品基本一致；覆膜萎凋(A1)樣品都具有干草香、甜度、香氣細(xì)膩柔和；68 ℃烘干(C1)樣品都具有甜香、香氣細(xì)膩柔和等優(yōu)點(diǎn)；85～105 ℃兩段式烘干(C2)樣品都具有干草香、香氣細(xì)膩、香氣濃度中等偏大等優(yōu)點(diǎn)。

表1 仿紅茶調(diào)制工藝煙葉樣本的評吸結(jié)果Table 1 Smoking quality analysis of tobacco leaves imitating black tea modulation process

2.2 仿紅茶調(diào)制工藝煙葉與常規(guī)烤煙化學(xué)成分的差異

由仿紅茶調(diào)制工藝煙葉與常規(guī)烤煙化合物含量分布(圖1)可看出，試驗(yàn)樣本與對照樣本中化合物含量存在差異。基于統(tǒng)計(jì)分析，將對照樣本化合物含量與試驗(yàn)樣本化合物含量相差超過三倍標(biāo)準(zhǔn)差的化合物，作為對照樣本與試驗(yàn)樣本間的差異化合物，共鑒定到2380 種差異化合物，如亞油酸、亞麻酸、油酸、亞油酸甘油、十六酰胺、水仙苷、L-精氨酸、6-羥基氰基、2,3’-聯(lián)吡啶、金絲桃苷等，占化合物總數(shù)的43.26%，其中LC-MS 共檢出2303種差異化合物，GC-MS 共檢出77 種差異化合物。

圖1 仿紅茶工藝調(diào)制煙葉與常規(guī)烤煙化合物含量分布熱圖Fig.1 Heat m ap of c ompound c ontent dis tribution i n flue-cured to bacco le aves b y im itating b lack te a pr ocess and i n c onventional flue-cured tobacco leaves

2.3 影響仿紅茶調(diào)制工藝煙葉化合物含量的主要因素

通過仿紅茶工藝參數(shù)(凋萎方式、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、烘干條件)與化合物含量的皮爾森相關(guān)系數(shù)來反映各因素對煙葉樣本中化合物含量的影響，相關(guān)系數(shù)大于0.5 且相關(guān)系數(shù)顯著性小于0.05，則認(rèn)為該參數(shù)與該化合物相關(guān)。萎凋方式(A)與2595 種化合物含量相關(guān)，占比47%；發(fā)酵時(shí)間(B)與196種化合物相關(guān)；干燥條件(C)與490 種化合物相關(guān)。說明與發(fā)酵時(shí)間和干燥條件相關(guān)的化合物數(shù)量相對較少，因此，覆膜萎凋和烤房萎凋是影響煙葉樣本中化合物含量的主要因素。

根據(jù)聚類結(jié)構(gòu)(圖2)，將試驗(yàn)處理分為兩大類：A1B1C1、A1B1C2、A1B2C1、A1B2C2稱為F 類；A2B1C1、A2B1C2、A2B2C1、A2B2C2稱為C 類。該分類結(jié)果與煙葉樣本的前處理方案對應(yīng)，即F 類樣本的萎凋方式為覆膜萎凋，C 類樣本的萎凋方式為烤房萎凋。該結(jié)果表明烤房萎凋和覆膜萎凋?qū)熑~樣本中的化合物含量有顯著影響。

圖2 仿紅茶調(diào)制工藝煙葉樣本的主成分分析與聚類分析結(jié)果Fig.2 PCA and HCA analysis of tobacco samples prepared imitating black tea modulation process

2.4 仿紅茶調(diào)制不同工藝煙葉的差異化合物

由圖3 可知，利用OPLS-DA 差異檢驗(yàn)方法鑒定到2708 種標(biāo)志性化合物(圖3-a)，烤房萎凋樣品分布在置信區(qū)間左側(cè)，覆膜萎凋樣品分布在置信區(qū)間右側(cè)，2 類樣品區(qū)分效果非常明顯；利用倍性變化與t檢驗(yàn)鑒定到757 種差異化合物(圖3-b)；整合2 種差異化合物鑒定方法的結(jié)果，共鑒定出關(guān)鍵差異化合物757 種(圖3-c)。

圖3 不同萎凋方式烘烤煙葉的差異化合物Fig.3 Differential compounds in tobacco samples with different withering methods

針對鑒定到的共同差異化合物(前25 種)進(jìn)一步進(jìn)行熱圖(圖4)展示，有7 種差異化合物在烤房萎凋時(shí)上調(diào)，18 種差異化合物下調(diào)，而覆膜萎凋反之。隨機(jī)選取4 種化合物展示萎凋方式間化合物的相對含量，結(jié)果表明煙葉烤房和覆膜萎凋主要影響黃酮、多酚、脂質(zhì)、生物堿、氨基酸等的含量。

圖4 仿紅茶調(diào)制工藝樣本不同萎凋方式的差異化合物(前25)的熱圖聚類Fig.4 Thermogram clustering of differential compounds(top25) in samples(prepared imitating black tea preparation process) with different withering methods

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，仿紅茶調(diào)制工藝煙葉與常規(guī)烘烤煙葉有2380 種差異化合物，占化合物總量的43.26%，說明仿紅茶調(diào)制工藝煙葉與常規(guī)烘烤2 種調(diào)制方法區(qū)別較大；比較萎凋方式、發(fā)酵時(shí)間和干燥方式，萎凋方式對煙葉化合物含量影響最大，有2595 種化合物含量與其有顯著相關(guān)性，占比47%。這與煙葉烘烤過程中萎凋期作用類似，董志堅(jiān)等[11]的研究表明，萎凋期的主要作用是使煙葉內(nèi)部大分子物質(zhì)充分代謝，形成香氣前體物質(zhì)，使煙葉香氣更加醇和。武圣江[12]認(rèn)為，萎凋期是煙葉調(diào)制過程中生理生化變化最為關(guān)鍵的步驟之一，對煙葉品質(zhì)的形成至關(guān)重要。這說明不論是常規(guī)烘烤還是仿紅茶調(diào)制工藝試制，萎凋都是極為重要的調(diào)制步驟。合理的萎凋可以調(diào)控?zé)熑~內(nèi)相關(guān)酶活性，從而控制煙葉內(nèi)部大分子物質(zhì)的降解速度和降解程度，并控制煙葉細(xì)胞水平的脂膜破壞時(shí)間和程度，保障煙葉酶促反應(yīng)的正常進(jìn)行[13]，由此可推斷萎凋是煙葉調(diào)制過程中主要香氣物質(zhì)的形成時(shí)期。從評吸結(jié)果來看，烤房萎凋煙葉多具有青雜氣，而覆膜萎凋具有干草香等特征香氣。綜合來看，覆膜萎凋效果好于烤房萎凋的。

發(fā)酵時(shí)間對煙葉化合物含量影響較小，這可能與試驗(yàn)設(shè)置有關(guān)。本研究結(jié)果也表明，有490種化合物與干燥方式有顯著相關(guān)性，與萎凋方式相比較少；而從評吸結(jié)果來看，2 種干燥方式結(jié)果差異較大，兩段式烘干有干草香等特征香氣，且與傳統(tǒng)烤煙評吸具有較大不同，說明干燥方式不僅影響煙葉香氣成分物質(zhì)和常規(guī)化學(xué)成分，還影響煙葉的香氣量、香氣質(zhì)和刺激性等感官評吸質(zhì)量。