徐斌，崔萍，丁逸梅,2，周衛(wèi)

(1.江蘇省藥物研究所有限公司，江蘇 南京 210009；2.南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210009;3.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009)

替米沙坦是長效、低毒的血管緊張素Ⅱ受體(AT)拮抗劑，聯(lián)合鈣離子通道阻滯劑氨氯地平使用，不僅使降壓作用增強(qiáng)，促進(jìn)療效；減少單一用藥劑量過大引起的不良反應(yīng)，同時(shí)可延緩高血壓的病理改變[1]。單用氨氯地平會(huì)出現(xiàn)劑量依賴型的不良反應(yīng)如外周水腫的增多，而替米沙坦可擴(kuò)張靜脈容量血管，恢復(fù)毛細(xì)血管內(nèi)正常壓力，因而減少液體從毛細(xì)血管滲出，從而減少氨氯地平導(dǎo)致的水腫[2]。替米沙坦氨氯地平片由德國勃林格殷格翰(Boehringer Ingelheim)制藥公司研制，商品名為Twynsta，2009年10月獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市[3]。

雙層片是一種具有雙層結(jié)構(gòu)的釋藥系統(tǒng)，單方可制成速緩釋兩層，既可快速釋放藥物減輕癥狀，又可緩慢維持有效劑量；復(fù)方是將兩種不同的藥物組合在一個(gè)雙層片中，可以提高有配伍反應(yīng)藥物的穩(wěn)定性；臨床上根據(jù)需要還可以制成口腔黏附雙層片或胃內(nèi)漂浮雙層片，實(shí)現(xiàn)定位、定時(shí)和定量釋放藥物。本文中替米沙坦難溶于水，在氫氧化鈉溶液中可與葡甲胺形成絡(luò)鹽，改善水溶性，增加其溶出度[4-5]。氨氯地平在堿性環(huán)境下酯鍵容易水解[6]，所以勃林格殷格翰公司將Twynsta制成了上下雙層片。我們以Twynsta為原研參比制劑，采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)法對替米沙坦層進(jìn)行了優(yōu)化，并對其在不同介質(zhì)中的溶出行為進(jìn)行考察。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ZRS-8G智能溶出試驗(yàn)儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司)；電子天平(Sartorius公司)；ZP37A型旋轉(zhuǎn)式壓片機(jī)(聊城萬合工業(yè)制造有限公司)；GL5-50干法制粒機(jī)(張家港市開創(chuàng)機(jī)械制造有限公司)；2010A 型高效液相色譜(日本島津)；SD-05噴霧干燥儀(英國Labplant公司)。

1.2 試藥 原研藥Twynsta(德國勃林格殷格翰制藥公司，批號：100971)；替米沙坦對照品(常州亞邦制藥股份有限公司，批號：M110505)；苯磺酸氨氯地平對照品(浙江新賽科藥業(yè)，批號：110606)；氫氧化鈉(湖南爾康制藥股份有限公司)；葡甲胺(西安立邦制藥有限公司)；聚維酮K30(安徽山河藥用輔料有限公司)；山梨醇(南寧化學(xué)制藥有限公司)；微晶纖維素(安徽山河藥用輔料有限公司)；聚醚砜(水系PES，德國Membrana公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法學(xué)研究

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.075 mol·L-1乙酸銨溶液(pH 5.5)(660∶340)為流動(dòng)相；檢測波長為237 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。理論板數(shù)分別按替米沙坦、氨氯地平峰計(jì)算應(yīng)不低于2×103，兩個(gè)峰的分離度應(yīng)大于1.5(見圖1)。

A.樣品；B.對照品 1.氨氯地平；2.替米沙坦

2.1.2 空白輔料干擾試驗(yàn) 按處方制備空白輔料樣品，置溶出介質(zhì)pH 7.5緩沖溶液中，按時(shí)取樣，濾過，注入液相色譜儀。結(jié)果表明，空白輔料對樣品測定無干擾(見圖1)。

2.1.3 線性關(guān)系的考察 精密稱取苯磺酸氨氯地平對照品適量(約含苯磺酸氨氯地平11 mg)，替米沙坦對照品約88.9 mg，置同一100 mL量瓶中，先加0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液5 mL，充分振搖后加甲醇適量，并超聲10 min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲(chǔ)備液。分別精密量取上述對照品儲(chǔ)備溶液2.5、3.5、5.0、6.5、7.5、10.0、13.0 mL，置100 mL量瓶中，加pH 7.5緩沖溶液稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液各20 μL，依法進(jìn)樣測定，以濃度C(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。計(jì)算的回歸方程分別為：苯磺酸氨氯地平A=5.510×104C-6.889×103(r=0.999 9)；替米沙坦A=9.836×104C+2.902×104(r=0.999 9)。結(jié)果表明苯磺酸氨氯地平在2.805～14.59 μg·mL-1，替米沙坦在22.31～116.0 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好線性。

2.1.4 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 取同一份溶出度測定液，重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果表明進(jìn)樣精密度良好，RSD為0.41%。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取6個(gè)杯中溶出度測定液，測定30 min時(shí)的釋放量，結(jié)果，平均釋放量的RSD=1.89%，表明該方法重現(xiàn)性好。

2.1.6 回收率試驗(yàn) 照處方比例制備空白片，在溶出杯中精密加入對照品適量，約相當(dāng)于標(biāo)示量的50%、70%、100%、130%，以pH 7.5磷酸鹽緩沖溶液900 mL為溶劑、轉(zhuǎn)速為75 r·min-1、溫度(37±0.5)℃的條件下，分別于30 min時(shí)取樣經(jīng)0.45 μm水系PES濾膜過濾依法測定回收率分別為：苯磺酸氨氯地平99.60%(RSD=1.6%，n=12)，替米沙坦100.1%(RSD=0.6%，n=12)。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)下同一份溶出度測定液，分別于0、2、4、8、12、24 h測定樣品溶液濃度，結(jié)果表明在水、0.01 mol·L-1鹽酸溶液、pH 4.0、pH 7.5介質(zhì)中溶出度測定液24 h內(nèi)穩(wěn)定(RSD為0.85%)。

表1 苯磺酸氨氯地平回收率試驗(yàn)(n=12)

2.2 處方及制備工藝研究

2.2.1 替米沙坦氨氯地平片的制備工藝 取處方量的氫氧化鈉、葡甲胺與聚維酮K30溶于適量純水中，再取規(guī)定量的替米沙坦加入并攪拌至溶液澄清透明。通過蠕動(dòng)泵將上述溶液逐批泵入噴霧設(shè)備，所制得含替米沙坦鈉鹽的物料與山梨醇混合均勻，進(jìn)行干法制粒，尾料依次循環(huán)投料，最終所得顆粒與適量硬脂酸鎂混合均勻，備用。

在本品單方經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，取處方量苯磺酸氨氯地平先與預(yù)交化淀粉、氧化鐵黑混合，再與淀粉及微晶纖維素混合均勻，加適量純水濕法制粒，置通風(fēng)恒溫箱中干燥，定時(shí)翻動(dòng)顆粒，整粒，最后與適量硬脂酸鎂、微粉硅膠總混，備用。

將上述顆粒分別測定主藥含量并計(jì)算各自的理論片重，壓制成上下雙層片，采用雙層鍍鋁膜袋密封保存，片劑硬度與脆碎度均符合《中國藥典》要求。

2.2.2 替米沙坦氨氯地平片工藝參數(shù) 替米沙坦在堿化成鹽過程中維持溶液溫度50～70 ℃，溶液澄清后以流速10 mL·min-1，霧化壓力0.2～0.4 MPa，進(jìn)風(fēng)溫度150 ℃，出風(fēng)溫度100 ℃進(jìn)行噴霧干燥；所得物料與山梨醇混合均勻后以滾軸12～18 r·min-1、物料輸送6～12 r·min-1、制粒10～20 r·min-1的速度進(jìn)行干法制粒，取上層10目與下層24目之間顆粒，壓力6～7 kg。苯磺酸氨氯地平用24目篩濕法制粒后，置60 ℃環(huán)境下干燥，20目篩整粒。采用多層壓片機(jī)壓制上下雙層片，模具為16×8 mm橢圓形，替米沙坦層片重約0.48 g，氨氯地平層約0.2 g，片劑硬度11～13 kg。替米沙坦成鹽后易吸濕，制作環(huán)境相對濕度控制在30%～50%。

2.2.3 替米沙坦層處方的正交試驗(yàn)優(yōu)化 原研處方中氨氯地平在不同pH介質(zhì)中15 min內(nèi)藥物釋放均超過90%，所以參考原研處方選擇微晶纖維素、淀粉和預(yù)膠化淀粉為主要輔料按常規(guī)制作顆粒。本試驗(yàn)主要對替米沙坦層處方進(jìn)行優(yōu)化，由于替米沙坦鈉鹽易溶解于水和具有較強(qiáng)的引濕性需采用干法制粒，這樣對填充的輔料就有了較高要求。我們先后采用了乳糖、山梨醇、微晶纖維素等分別作主要填充劑進(jìn)行單因素篩選，結(jié)果經(jīng)平行比較以山梨醇作填充劑片重差異較小，流動(dòng)性最好，所以將山梨醇的用量作為考察因素A；在預(yù)試驗(yàn)中黏合劑用量和添加方式對主藥溶出均存在影響，將聚維酮K30以固體粉末與主藥及其他輔料直接混合后干法制粒和在主藥堿化成鹽時(shí)將聚維酮K30同時(shí)溶解后噴霧干燥，經(jīng)對兩種工藝比較發(fā)現(xiàn)后者主藥溶出效果更佳，故在確定工藝后將聚維酮K30用量作為考察因素B；片劑的硬度通常對主藥溶出也有一定影響，故將雙層片硬度大小作為考察因素C。綜合以上分析取3個(gè)水平(見表2)，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表安排試驗(yàn)，以pH 7.5磷酸鹽緩沖液為介質(zhì)作溶出曲線試驗(yàn)并與原研片進(jìn)行擬合，將相似因子(f2)作為考察指標(biāo)。

表2 替米沙坦回收率試驗(yàn)(n=12)

表3 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平

由表4可知，各因素對替米沙坦溶出行為影響程度大小為：B>C>A，較優(yōu)處方工藝條件是A3B2C2。由表5可知，黏合劑聚維酮用量和片劑硬度對主藥溶出度有顯著影響。故綜合考慮確定本品替米沙坦層最優(yōu)處方組成為：替米沙坦80 g、氫氧化鈉6 g、葡甲胺25 g、山梨醇360 g、聚維酮24 g，硬度約12 kg，共制成1 000片。

表4 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)和結(jié)果

注：F0.05(2,2)=19.00

2.3 自制制劑和與進(jìn)口制劑的體外溶出行為比較 根據(jù)《已有國家標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，需對自制樣品與進(jìn)口產(chǎn)品在不同溶出介質(zhì)中的溶出行為進(jìn)行比較。參照《中國藥典》2010年版(二部)附錄C 第二法項(xiàng)下規(guī)定進(jìn)行試驗(yàn)，采用4種不同的溶出介質(zhì)：蒸餾水、0.01 mol·L-1鹽酸溶液、pH 4.0枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液和pH 7.5磷酸鹽緩沖液，溶出杯中加入900 mL介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為75 r·min-1，比較自制樣品與進(jìn)口產(chǎn)品的體外溶出行為，分別于5、10、15、30、45、60 min時(shí)取樣經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾依法測定，以取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，累積溶出度為縱坐標(biāo)繪制體外溶出曲線(見圖2～5)。

圖2 自制片和市售制劑在水中的溶出曲線

圖3 自制片和市售片在0.01 mol·L-1鹽酸溶液中的溶出曲線

圖4 自制片和參比制劑在pH 4.0枸櫞酸磷酸二氫鈉緩沖液中的溶出曲線

圖5 自制片和參比制劑在pH 7.5緩沖液中的溶出曲線

將自制樣品與市售片中的替米沙坦在純水、0.01 mol·L-1鹽酸溶液、pH 4.0枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液和pH 7.5磷酸鹽緩沖液介質(zhì)中的溶出數(shù)據(jù)采用相似因子法(f2)進(jìn)行擬合，f2= 50×lg{[1+(1/n)Σt=1n(Rt-Tt)2]-0.5×100}，Rt和Tt分別代表自制樣品和市售片第t點(diǎn)的平均累積釋放度，n為測試點(diǎn)數(shù)。f2的變化范圍是0～100，當(dāng)兩條釋放曲線間的f2值大于50時(shí)則可認(rèn)為兩者相似。f2的數(shù)值越大，兩條釋放曲線的相似性越高[7]。

結(jié)果表明，除pH 4.0介質(zhì)中的藥物溶出未能達(dá)到80%以上，其他介質(zhì)中市售片與自制品溶出曲線相似因子均>50，兩者在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上具有一致性。

2.4 溶出模型的擬合 市售片與自制片氨氯地平層在4種介質(zhì)中15 min內(nèi)藥物釋放均超過90%，表明體外藥物釋放迅速且現(xiàn)象相似，沒有必要對其溶出行為進(jìn)行比較。替米沙坦層在pH 4.0介質(zhì)中的藥物溶出未能達(dá)到80%以上，因此不適采用相似因子法對其相似性進(jìn)行評價(jià)。根據(jù)累積溶出度和時(shí)間數(shù)據(jù)，選用不同方程對自制制劑中的替米沙坦層溶出行為進(jìn)行擬合,相關(guān)系數(shù)(r)越接近1擬合效果越好。由表6可知，在3種溶出介質(zhì)中，替米沙坦層的溶出動(dòng)力學(xué)特征以一級方程及Peppas方程擬合較好。根據(jù)Peppas方程可以判斷藥物釋放規(guī)律和藥物釋放機(jī)制，當(dāng)n≤0.45時(shí)，藥物主要以Fick擴(kuò)散機(jī)制釋放，當(dāng)0.450.89時(shí)藥物主要以溶蝕方式釋放；因此可以判斷本品替米沙坦層藥物以擴(kuò)散和溶蝕并存的方式釋放[8]。根據(jù)對累積溶出度相似因子擬合及體外溶出現(xiàn)象比較，表明自制片處方工藝合理且與市售片的體外釋藥行為一致。

表6 自制片與市售片替米沙坦在不同pH介質(zhì)中的釋放比較(n=6)

表7 替米沙坦層在不同介質(zhì)中溶出方程的擬合

3 討論

處方設(shè)計(jì)初期資料顯示由于替米沙坦水溶性差，影響了替米沙坦在體內(nèi)的生物利用度，因此加入氫氧化鈉，使主藥和葡甲胺形成內(nèi)絡(luò)鹽，改善其水溶性，提高體內(nèi)生物利用度，減少不良反應(yīng)。苯磺酸氨氯地平在堿性環(huán)境下酯鍵容易水解，如果直接將替米沙坦鈉鹽和氨氯地平混合后制粒壓片，有關(guān)物質(zhì)明顯增加，處方穩(wěn)定性差。因此將替米沙坦和氨氯地平壓制成上下雙層片，增加穩(wěn)定性。

雙層片的制備工藝技術(shù)要求高，工藝復(fù)雜，壓片前需要二次制粒，填料時(shí)需要兩次連貫操作，先預(yù)壓再總壓，所以對預(yù)先填料的顆粒流動(dòng)性要求非常高。在生產(chǎn)實(shí)踐中通常占比大的一項(xiàng)先填料預(yù)壓，所以本品中替米沙坦層顆粒的優(yōu)劣會(huì)直接影響氨氯地平層顆粒填料的準(zhǔn)確度，如果影響過大會(huì)直接導(dǎo)致片重差異不合格。在交替填料清潔時(shí)，因?yàn)槎鄬訅浩瑱C(jī)性能的差異，使得預(yù)先填料的替米沙坦層顆?？赡芮鍧嵅怀浞?，這樣不但會(huì)導(dǎo)致與氨氯地平層顆粒發(fā)生交叉污染，還會(huì)使顆粒物料損耗過大，影響產(chǎn)品得率。所以在對本品的預(yù)試驗(yàn)中不僅要對替米沙坦層主要輔料進(jìn)行篩選，而且對處方工藝和生產(chǎn)設(shè)備都要進(jìn)行嚴(yán)格控制。

考慮本品外購鈉鹽原料會(huì)有一定的差異性，同時(shí)替米沙坦鈉鹽容易吸濕，使得濕法制粒過篩時(shí)異常困難。所以我們在自制鈉鹽時(shí)將黏合劑聚維酮K30與主藥一起溶解，不但有助于主藥溶出，而且增加了工藝的穩(wěn)定性和可操作性。鈉鹽的吸濕性使得在顆粒制備過程中，對工藝及輔料要求比較高，經(jīng)過單因素平行篩選，最終選用山梨醇與鈉鹽直接混合后進(jìn)行干法制粒，制得顆粒可壓性強(qiáng)，不易吸濕，流動(dòng)性良好。樣品經(jīng)檢測片劑硬度、脆碎度及重量差異均符合《中國藥典》要求，外觀亦色澤均一，光潔美觀。為避免儲(chǔ)存和患者使用時(shí)樣品受環(huán)境濕度的影響，并考慮到在運(yùn)輸過程中片劑間相互碰撞可能會(huì)導(dǎo)致雙層片裂片和交叉污染，我們采用了雙層鍍鋁膜袋單片密封保存的包裝。

替米沙坦的釋放快慢主要受填充劑、黏合劑以及硬度影響較大，我們采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，將自制片和參比制劑在pH 7.5緩沖溶液中溶出度的相似因子(f2)作為主要考察指標(biāo)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得到了最優(yōu)處方和工藝，方差分析亦表明黏合劑的用量和片劑硬度對片劑溶出有顯著影響。按照優(yōu)選處方和工藝制得的樣品經(jīng)在不同溶出介質(zhì)與參比制劑進(jìn)行溶出度比較，相似因子f2值均大于50。替米沙坦除在pH 4.0介質(zhì)中外，其他介質(zhì)中的溶出動(dòng)力學(xué)特征以一級方程及Peppas方程擬合較好。不同介質(zhì)中Peppas方程擬合的n均在0.45～0.89之間，因此判斷溶出行為以擴(kuò)散和溶蝕兩種方式并存為主。根據(jù)對累積溶出度相似因子擬合及體外溶出現(xiàn)象比較，表明自制片替米沙坦溶出行為與原研藥基本一致，替米沙坦氨氯地平片處方合理，工藝可行。