李凱，陳克河，康繼厚

（信陽(yáng)市中心醫(yī)院 消化內(nèi)科，河南 信陽(yáng) 464000）

手術(shù)切除后輔助化療通常是治療早期胰腺癌的首選方案，但由于胰腺解剖位置相對(duì)較深，多數(shù)胰腺癌患者在確診時(shí)已處于中晚期，不宜進(jìn)行手術(shù)治療［1］?；熓且认侔┲匾闹委熓侄?，雖然逐漸有新的化療藥物被研發(fā)，但胰腺癌化療耐藥的發(fā)生仍導(dǎo)致臨床療效不佳，病死率未見明顯下降［2］。因此，分析與胰腺癌化療耐藥性相關(guān)的因素，為后續(xù)采取措施降低化療耐藥性，改善胰腺癌預(yù)后情況較為重要。微小核糖核酸（microRNA,miR）目前已被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其中，miR-34a 在胰腺癌中起著重要的作用［3］。研究表明，miR-34a 可跨越細(xì)胞膜，下調(diào)靶向基因原癌基因的表達(dá)，外源性miR-34a 對(duì)胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，與胰腺癌預(yù)后有關(guān)［4］。親吻素-1（kisspeptin 1,KISS-1）在結(jié)直腸癌、膀胱癌、肝癌等多種癌癥中均被證實(shí)具有抑制作用［5］。研究表明，KISS-1 與癌癥的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，尤其與癌癥的分化程度、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移程度及臨床分期密切相關(guān)，可作為治療癌癥的新靶點(diǎn)［6］。結(jié)合上述miR-34a、KISS-1 在腫瘤組織中的特點(diǎn)，由此推測(cè)，血清miR-34a、KISS-1 水平可能與胰腺癌患者化療耐藥性存在關(guān)聯(lián)，但目前尚無研究證實(shí)?；诖耍狙芯糠治鲅錷iR-34a、KISS-1 水平與胰腺癌患者化療耐藥性的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究的實(shí)施經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)執(zhí)行，前瞻選擇2018 年3 月至2019 年3 月信陽(yáng)市中心醫(yī)院95 例胰腺癌化療患者作為研究對(duì)象，患者與家屬均對(duì)此次研究知情同意。研究對(duì)象中，男59例，女36 例；年齡43～72 歲，中位年齡51.00（45.00,55.00）歲；體質(zhì)量指數(shù)18.17～25.36 kg/m2，中位體質(zhì)量指數(shù)22.03（21.61,22.43）kg/m2；TNM分期［7］：Ⅲ期54 例，Ⅳ期41 例。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《胰腺癌診療規(guī)范》［8］中胰腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②接受化療；③卡氏評(píng)分［9］＞60 分。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入院前已接受化療、放療或免疫治療；②已接受手術(shù)；③合并其他惡性腫瘤；④肝、腎臟等慢性疾?。虎輫?yán)重免疫性疾病。

1.3 方法

1.3.1 血清指標(biāo)檢測(cè)方法 ①化療前，采集患者3 mL 空腹靜脈血，離心機(jī)（鄭州中谷機(jī)械設(shè)備，型號(hào)TGL-16）3 000 r/min 離心（半徑20 cm）10 min，-80℃下保存待測(cè)，加入Trizol RNA，Trizol 法提取總RNA，經(jīng)檢驗(yàn)合格（紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 總純度1.8～2.0）后，加入0.5 μL 逆轉(zhuǎn)錄酶，于37℃下水浴，將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems?7500）擴(kuò)增，采用2-△△Ct法計(jì)算血清miR-34a 相對(duì)表達(dá)量。②化療前，采集患者3 mL 空腹靜脈血，離心機(jī)3 000 r/min 離心（半徑20 cm）10 min，-70℃下保存待測(cè)，用上海恒遠(yuǎn)生化試劑有限公司提供的試劑盒，以酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清KISS-1水平。

1.3.2 化療方案 開始化療第1 d、第8 d、第15 d，每天在30 min 內(nèi)靜脈滴注1 000 mg/m2吉西他濱（連云港杰瑞藥業(yè)，生產(chǎn)批號(hào)：20171114，規(guī)格：0.2 g），開始化療第1～14 天，口服替吉奧（日本大鵬藥品工業(yè)株式會(huì)社，生產(chǎn)批號(hào)：20171108，規(guī)格：20 mg），40～60 mg/次，2 次/d，21 d 為1 個(gè)周期，連續(xù)治療4 個(gè)周期。

1.3.3 化療耐藥和敏感評(píng)估方法 化療4 個(gè)周期后隨訪1 個(gè)月，根據(jù)美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）胰腺癌臨床實(shí)踐指南［10］評(píng)估化療耐藥與敏感情況，無效為化療耐藥，有效為化療敏感。療效根據(jù)《RECIST 指南（1.1 版）》［11］評(píng)估，完全緩解（CR）：病灶完全消失，維持時(shí)間＞1 個(gè)月；部分緩解（PR）：腫瘤最長(zhǎng)徑之和較治療前縮小≥30%，維持時(shí)間＞1 個(gè)月；疾病穩(wěn)定（SD）：腫瘤最長(zhǎng)徑之和較治療前縮小＜30%，維持時(shí)間＞1 個(gè)月；疾病進(jìn)展（PD）：出現(xiàn)新病灶或者腫瘤最長(zhǎng)徑增大程度≥20%，有效率=CR 率+PR 率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料均經(jīng)Shapiro-Wilk 正態(tài)性檢驗(yàn)，偏態(tài)分布計(jì)量資料用中位數(shù)和四分位數(shù)間距［M（P25,P75）］表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，血清miR-34a、KISS-1水平與胰腺癌患者化療耐藥性的關(guān)系采用Logistic回歸分析檢驗(yàn)；繪制受試者工作曲線（ROC），并計(jì)算曲線下面積（AUC）值，檢驗(yàn)血清miR-34a、KISS-1 水平預(yù)測(cè)胰腺癌患者化療耐藥的價(jià)值，AUC 值＞0.9 表示預(yù)測(cè)性能較高，＞0.7～0.9 表示有一定預(yù)測(cè)性能，0.5～0.7 表示預(yù)測(cè)性能較低，＜0.5表示無預(yù)測(cè)性能，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥情況

化療4 個(gè)周期，95 例胰腺癌患者中耐藥患者有70 例，占73.68%（70/95），其中SD 患者38 例，PD 患者32 例；敏感患者有25 例，占26.32%（25/95），其中CR 患者0 例，PR 患者25 例。

2.2 基線資料和血清指標(biāo)比較

兩組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、TNM 分級(jí)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），耐藥組血清miR-34a、KISS-1 水平低于敏感組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組基線資料和血清指標(biāo)比較

2.3 血清miR-34a、KISS-1 水平與胰腺癌患者化療耐藥關(guān)系的Logistic 回歸分析

將2.2 中比較結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入作為自變量（均為連續(xù)變量），將胰腺癌患者的耐藥情況作為因變量（1=耐藥，0=敏感），經(jīng)Logistic 回歸分析檢驗(yàn)結(jié)果顯示，血清miR-34a、KISS-1 水平與胰腺癌患者化療耐藥有關(guān)，兩者高表達(dá)可能是胰腺癌患者化療耐藥的保護(hù)因素（,P＜0.05）。見表2。

表2 血清miR-34a、KISS-1 水平與胰腺癌患者化療耐藥關(guān)系的Logistic 回歸分析結(jié)果

2.4 血清miR-34a、KISS-1 單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測(cè)胰腺癌患者化療耐藥的價(jià)值

將胰腺癌患者的耐藥情況作為狀態(tài)變量（1=耐藥，0=敏感），將化療前血清miR-34a、KISS-1水平作為檢驗(yàn)變量，繪制ROC 曲線圖（見圖1），結(jié)果顯示，化療前血清miR-34a、KISS-1 水平單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測(cè)胰腺癌患者化療耐藥的AUC 分別為0.753、0.770、0.775，均有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，且當(dāng)兩者的cut-off 值分別取0.898、119.563 pg/mL 時(shí)，可獲得最佳預(yù)測(cè)價(jià)值。見表3。

表3 血清miR-34a、KISS-1 單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測(cè)胰腺癌患者化療耐藥的價(jià)值

圖1 血清miR-34a、KISS-1 單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測(cè)胰腺癌患者化療耐藥的ROC 曲線圖

3 討論

胰腺癌早期診斷存在較大的困難，多數(shù)患者在確診時(shí)已出現(xiàn)其他器官侵襲或腫瘤轉(zhuǎn)移，無法進(jìn)行手術(shù)切除，因此，化療治療對(duì)于胰腺癌患者較為重要［12］。雖然新型的治療藥物或聯(lián)合治療方案已被證實(shí)可提升治療效果，但部分患者在化療過程中易出現(xiàn)耐藥情況，增加腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)［13］。

研究顯示，胰腺癌患者出現(xiàn)化療耐藥的頻率高達(dá)78.1%［14］。本研究結(jié)果顯示，化療4 個(gè)周期，95 例胰腺癌患者中，耐藥患者有70 例，占73.68%，與上述研究相符。說明，胰腺癌化療患者耐藥風(fēng)險(xiǎn)較高，因此，分析胰腺癌化療耐藥的相關(guān)因素，對(duì)提升化療效果，改善預(yù)后較為重要。miRNA 異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系密切，miR-34 家族是其中的一種，具有抑癌基因p53 高度結(jié)合位點(diǎn)，包括miR-34a、miR-34b 和miR-34c［15］，其中，miR-34a 被證實(shí)既能作為促癌基因，誘導(dǎo)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，又能作為抑癌基因，抑制惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［16］。目前，已有研究證實(shí)miR-34a 的缺失與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切的聯(lián)系［17］。而腫瘤的發(fā)展受耐藥影響，由此推測(cè)，miR-34a 可能與胰腺癌化療耐藥相關(guān)。KISS-1 是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，對(duì)癌癥細(xì)胞的的增殖、遷移、侵襲等各種生物學(xué)行為具有明顯的抑制作用，KISS-1 水平在多種惡性腫瘤中呈低表達(dá)［18］。研究顯示，KISS-1 基因可促進(jìn)人胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［19］。由此推測(cè)，KISS-1 表達(dá)可能也與胰腺癌化療耐藥有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，耐藥組血清miR-34a、KISS-1 水平低于敏感組，進(jìn)一步經(jīng)Logistic 回歸分析檢驗(yàn)結(jié)果顯示，血清miR-34a、KISS-1 水平與胰腺癌患者化療耐藥有關(guān)，兩者高表達(dá)可能是胰腺癌患者化療耐藥的保護(hù)因素。說明，血清miR-34a、KISS-1 水平可能與胰腺癌患者化療耐藥有關(guān)。分析原因?yàn)椋簃iR-34a 能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，阻滯腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)展，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而增加腫瘤細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性，因而缺少miR-34a 會(huì)增加腫瘤細(xì)胞的化療耐藥性［20］。miR-34a 可能通過影響耐藥相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)耐藥株的凋亡，而miR-34a 呈低表達(dá)時(shí)，miR-34a 促進(jìn)耐藥株凋亡的能力降低，造成化療耐藥發(fā)生［21］。劉明明等［22］研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a與癌癥患者化療耐藥有關(guān)，miR-34a 能逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性，與本研究結(jié)果相符。KISS-1 作為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，不僅能弱化細(xì)胞質(zhì)內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear transcription factor-κB,NF-κB）活性，抑制NF-κB 結(jié)合基質(zhì)金屬蛋白酶-9，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和浸潤(rùn)，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性［23］。而且，KISS-1 具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，KISS-1 衍生的肽能通過G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)，達(dá)到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等活動(dòng)進(jìn)行干擾，誘導(dǎo)擴(kuò)散的癌癥細(xì)胞進(jìn)入休眠狀態(tài)，增加其對(duì)化療藥物的敏感性，而KISS-1不足會(huì)影響這種轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，增加化療耐藥風(fēng)險(xiǎn)［24］。研究表明，KISS-1 在胰腺癌診斷和預(yù)后判斷中具有一定的價(jià)值［25］。最后，本研究繪制ROC 曲線圖，結(jié)果顯示，化療前血清miR-34a、KISS-1 水平單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測(cè)胰腺癌患者化療耐藥的AUC 分別為0.753、0.770、0.775，均有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。未來臨床若監(jiān)測(cè)到上述指標(biāo)異常，可考慮補(bǔ)充外源miR-34a、KISS-1，以減少耐藥情況發(fā)生，改善胰腺癌化療患者預(yù)后結(jié)局。但本文未分析miR-34a、KISS-1 兩者間是否互相影響，共同發(fā)揮對(duì)胰腺癌化療耐藥的作用，后續(xù)應(yīng)增加研究繼續(xù)探索。

綜上所述，血清miR-34a、KISS-1 低表達(dá)與胰腺癌患者化療耐藥性有關(guān)，可應(yīng)用于胰腺癌患者化療耐藥的預(yù)測(cè)。