孫梅雪，張長華，高 強，李 煒，賈芳曌，徐蓬軍*，任廣偉*

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東省青島市科苑經(jīng)四路11號 266101

2.貴州省煙草公司遵義市公司，貴州省遵義市匯川區(qū)人民路341號 563000

3.山東臨沂煙草有限公司沂水分公司，山東省沂水縣長安中路 276400

蠋蝽（Arma chinensis），又名蠋敵，隸屬半翅目（Hemiptera）蝽科（Pentatomidae）益蝽亞科（Asopinae）蠋蝽屬（Arma），其成蟲和若蟲均可捕食黏蟲、刺蛾、葉甲、蚧殼蟲和蚜蟲等40 余種常見害蟲［1］。蠋蝽分布較廣，國內(nèi)主要分布于黑龍江、北京、云南、貴州等近20 個省份［2-4］。蠋蝽的食性廣、適應(yīng)性強，可人工規(guī)?；曫B(yǎng)，是害蟲生物防治的一類重要天敵資源。

蠋蝽最初用于林業(yè)害蟲的防治，且防效較好［5-6］。近年來，貴州省煙草公司遵義市公司率先建立了蠋蝽繁育基地，構(gòu)建了蠋蝽規(guī)?；庇夹g(shù)體系。該技術(shù)體系現(xiàn)已成為煙草行業(yè)綠色防控重大專項推薦的關(guān)鍵技術(shù)之一，并在全國主要煙區(qū)進(jìn)行了示范推廣。目前，在蠋蝽的生物學(xué)特性［7］、捕食能力、人工飼料和規(guī)?；庇夹g(shù)等方面已有較為完善的研究。唐藝婷等［8］研究表明蠋蝽5 齡若蟲和雌蟲對斜紋夜蛾具有較好的捕食能力。人工飼料在蠋蝽規(guī)?；曫B(yǎng)過程中起著至關(guān)重要的作用，鄒德玉等［9-10］通過對飼喂人工飼料的蠋蝽和飼喂柞蠶蛹的蠋蝽分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)了一些與營養(yǎng)相關(guān)的代謝途徑和差異表達(dá)基因，獲得了更多關(guān)于人工飼料配方的信息反饋。就飼養(yǎng)密度而言，雷庭等［11］研究表明室內(nèi)飼養(yǎng)蠋蝽應(yīng)嚴(yán)格控制飼養(yǎng)密度，密度過高會導(dǎo)致種群自殘，產(chǎn)卵前期推遲，產(chǎn)卵量降低。然而，蠋蝽規(guī)?；庇龝r常出現(xiàn)蠋蝽因染病導(dǎo)致個體大量死亡的問題，嚴(yán)重威脅蠋蝽的規(guī)模化生產(chǎn)及推廣應(yīng)用，但有關(guān)蠋蝽病原物方面的研究還鮮見報道。為此，本研究中采用高通量測序技術(shù)在蠋蝽體內(nèi)鑒定出一種新病毒，將其命名為Arma chinensis virus-1（AcV-1），并分析了AcV-1 的基因組序列，旨在明確其基因組結(jié)構(gòu)特征及遺傳進(jìn)化情況，為蠋蝽病原物防控提供依據(jù)，從而提高蠋蝽成活率，為蠋蝽規(guī)?；庇峁┘夹g(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蠋蝽樣品于2019 年5 月采自貴州省煙草公司遵義市公司天敵繁育基地（27.45°N，106.53°E）。收集的蠋蝽樣本（200 頭）包括若蟲和成蟲（每個時期各100 頭），樣本保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所。

1.2 方法

1.2.1 文庫的構(gòu)建

每10 頭蠋蝽為一組，在液氮下混合研磨，每組取0.1 g 粉末置于1.5 mL 無菌無酶離心管中，加入1 mLReagent（美國Thermo Fisher 公司），剩余粉末儲存于-80 ℃冰箱備用。加入TRIzol?Reagent 的樣品4 ℃12 000 r/min 離心5 min，將每份樣品中的50 μL 上清液混合在一起提取總RNA。用Oligo（dT）（美國Thermo Fisher 公司）提取mRNA，然后在片段化緩沖液（美國Thermo Fisher 公司）中將mRNA 剪切成短片段。隨后，使用TruSeq RNA Sample Prep Kit（美國Thermo Fisher 公司），參照其說明書，用合適的插入片段［約（200±50）bp］構(gòu)建文庫。使用Illumina HiSeq?儀器（美國Illumina 公司）對樣品進(jìn)行RNA-seq 分析［12］。

1.2.2 組裝和注釋

使用Illumina HiSeqTM儀器進(jìn)行測序時，選擇成對末端和讀取長度為150 nt 的選項，而不選用鏈特異性選項。使用Trinity 2.0.6 修剪接頭，舍棄低質(zhì)量讀取并使用清晰高質(zhì)量讀取從頭組裝［13］，使用BLASTx（E-value ≤1×10-5）將組裝的重疊群與非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫、STRING、Swissprot 和KEGG 比對，進(jìn)行功能注釋。

1.2.3 病毒檢測、基因組擴(kuò)增

（1）RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄

取儲存于-80 ℃冰箱的蠋蝽粉末樣品0.1 g 于1.5 mL 無菌無酶離心管中，加入TRIzol?Reagent混勻，用于提取總RNA，具體操作參照說明書進(jìn)行。提取的RNA 用50～100 μL DEPC 水溶解，檢測RNA 濃度和純度后，置于-80 ℃冰箱中保存。

（2）AcV-1 基因組擴(kuò)增

根據(jù)RNA-Seq 得到的AcV-1 基因組已知序列，設(shè)計7 對特異性引物（表1），以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，各片段擴(kuò)增體系：TaKaRa LA Taq 0.5 μL、10×LA Taq Buffer II（Mg2+Plus）5 μL、dNTP Mixture（2.5 mM each）8 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 32.5 μL，總體積50 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1.5 min，循環(huán)35 次；72 ℃7 min。AcV-5R 和AcV-3F1/AcV-3F2分別用于5′和3′cDNA 末端快速擴(kuò)增（Rapid amplification of cDNA ends，RACE），使用SMARTer?RACE 5′/3′Kit（美國TaKaRa 公司），按照產(chǎn)品說明進(jìn)行實驗。上述PCR 產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，目的片段參照EasyPure?Quick Gel Extraction Kit［全式金（北京）生物技術(shù)有限公司］說明進(jìn)行切膠回收?；厥漳康钠闻c載體pEASY-T1 25 ℃連接30 min，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）的培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，挑取平板上的克隆進(jìn)行菌落PCR，將PCR 結(jié)果中大小正確條帶對應(yīng)的菌液樣品送上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行序列測定。

表1 AcV-1 基因組擴(kuò)增引物Tab.1 Amplificɑtion primers used for AcV-1 genome

1.2.4 基因組結(jié)構(gòu)分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

序列測定完成后，根據(jù)擴(kuò)增引物去除兩端的載體序列，通過拼接獲得AcV-1 的基因組序列。使用ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）搜索病毒基因組的ORF，用Clustal W軟件來比對核苷酸序列和氨基酸序列，用NCBI 保守域搜索預(yù)測保守域。使用BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進(jìn)行序列多重比對及同源性分析。將獲得的新病毒基因組序列與雙順反子病毒科（Dicistroviridae）目前接受的15 種雙順反子病毒的相應(yīng)氨基酸序列進(jìn)行比對，用MAGE-X軟件進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［14］，采用鄰接 法（Neighbor-joining，NJ）分別構(gòu)建ORF1 和ORF2 預(yù)測氨基酸的系統(tǒng)發(fā)育樹，距離模型選擇差異位點比例（p-distance），并使用自舉法（Bootstrap）1 000 次進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗；采用最大似然法（Maximum likelihood，ML），以隸屬伴生豇豆病毒科（Secoviridae）的水稻東格魯球狀病毒（Rice tungro spherical virus）、歐防風(fēng)黃點病毒（Parsnip yellow fleck virus）和隸屬傳染性軟腐病病毒科（Iflaviridae）的褐飛虱蜜露病毒-2（Nilaparvata lugens honeydew virus-2）為外群（Outgroup），構(gòu)建保守結(jié)構(gòu)域RdRp 的系統(tǒng)發(fā)育樹，其可信度使用1 000 次自舉重復(fù)驗證。

2 結(jié)果及分析

2.1 蠋蝽中AcV-1 高通量測序

RNA-Seq 數(shù)據(jù)提交到NCBI Sequence Read Archive（SRA）數(shù)據(jù)庫（登錄號：SRR10098905）。通過RNA-seq獲得了60億個堿基，總共產(chǎn)生了27 058個重疊群，其中包括21 972 個單基因。通過功能注釋的方法，發(fā)現(xiàn)了一個組裝的重疊群（長度為9 176 nt），通過Blast 分析，發(fā)現(xiàn)其與蟋蟀麻痹病毒（Cricket paralysis virus，CrPV）分離物CrPV-3（GenBank：KP974707.1）全基因組的核苷酸序列相似性達(dá)89.4%，將該重疊群命名為AcV-contig1。

2.2 AcV-1 基因組序列分析

成功擴(kuò)增了AcV-1 基因組的3′端和5′端（圖1a、圖1b），拼接后得到的AcV-1 基因組序列長度為9 192 nt［不包含Poly（A）］，堿基組成分別為33.3% A、27.6% T、18.2% C、20.9% G（圖1c）。該序列已上傳至GenBank（登錄號為MW846634）。拼接的AcV-1 病毒基因組序列與RNA-seq 獲得的序列相比無堿基變異，但在5′端多出25 個堿基，另外，可能由于RNA-seq 測序拼接的問題，3′端存在2 個堿基的缺失?；蚪M序列與CrPV（GenBank：KP974707.1）的結(jié)構(gòu)和長度相似，其中核苷酸相似性最高達(dá)89.40%，表明本研究中獲得了含有完整讀碼框的AcV-1 基因組序列。該病毒基因組包含2 個非重疊的ORFs，ORF1 含有5 316 個核苷酸，該ORF 起始于717 nt，終止于6 032 nt，分子質(zhì)量為203.68 kDa，pI 為6.67，編碼一個長度為1 771 個氨基酸的非結(jié)構(gòu)蛋白，包含3 個保守結(jié)構(gòu)域，分別是依賴RNA 的RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）、蛋白酶（Protease，P）、RNA 解旋酶（RNA helicase，HEL）。對ORF1 推導(dǎo)出氨基酸序列進(jìn)行BLASTp 分析，結(jié)果表明其與雙順反子病毒（Dicistroviruses）和微小核糖核酸病毒（Picorna-like viruses）的非結(jié)構(gòu)蛋白關(guān)系較近，其中與CrPV 的非結(jié)構(gòu)蛋白（UniProtKB/Swiss-Prot：AKA63263.1，相似性97.74%，覆蓋率100%）的相似性最高。ORF2含有2 529個核苷酸，該ORF起始于6 384 nt，終止于8 912 nt，分子質(zhì)量為94.3 kDa，pI 為7.2，編碼一個包含842 個氨基酸的結(jié)構(gòu)蛋白，包括蟋蟀麻痹病毒樣衣殼蛋白、蟋蟀麻痹病毒VP4 衣殼蛋白以及兩個小核糖核酸病毒樣衣殼蛋白。2 個ORFs 中間由一個長度為351 nt 的基因間隔區(qū)（Intergenic region，IGR）隔開，其兩端為非翻譯區(qū)（Untranslated regions，UTRs），5′和3′非翻譯區(qū)分別含有716個和280個核苷酸，且3′端具有Poly（A）尾。BLASTp 分析表明，ORF2 同樣也是與雙順反子病毒和微小核糖核酸病毒關(guān)系較近，其中與CrPV 的結(jié)構(gòu)蛋白（UniProtKB/Swiss-Prot：AKA63264.1，相似性93.70%，覆蓋率99%）的相似性最高。

圖1 AcV-1 基因組3′端/5′端擴(kuò)增及基因組結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Amplification of the 3′/5′ends and structural analysis of AcV-1 genome

2.3 AcV-1 系統(tǒng)發(fā)育分析

通過Blastp 對推導(dǎo)的ORF1 和ORF2 氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示其與雙順反子病毒科中的CrPV 具有高度相似性。采用系統(tǒng)發(fā)育分析方法對推導(dǎo)的ORF1、ORF2 以及RdRp 的氨基酸序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，進(jìn)一步確定AcV-1 和雙順反子病毒科之間的關(guān)系。

采用最大似然法構(gòu)建保守結(jié)構(gòu)域RdRp 的系統(tǒng)發(fā)育樹時，應(yīng)首先對模型進(jìn)行選擇，經(jīng)過篩選，此次分析選擇貝葉斯信息標(biāo)準(zhǔn)得分最低的LG+伽馬分布（Gamma distributed，G）模型。基于RdRp的ML 樹表明，AcV-1 與褐飛虱C 病毒（Nilaparvata lugens C virus，NLCV）聚集在一起，但自舉值（54，圖2）較低，而基于ORF1 和ORF2 的氨基酸序列的NJ 樹表明，AcV-1 與CrPV 聚集在一起且具有較高自舉值（分別為100 和81，圖3a、圖3b）。

圖2 基于RdRp 的ML 樹Fig.2 Maximum-likelihood（ML）tree based on RdRp

圖3 基于ORF1/ORF2 的NJ 樹Fig.3 Neighbor-joining（NJ）tree based on ORF1/ORF2

2.4 不同來源蠋蝽感染AcV-1 情況檢測

利用特異性引物AcV-1-F/AcV-1-R（AcV-1-F：CACAGGGGATTTTACTGAAGG，AcV-1-k：CGTC GGGTGTACCTGTAGAAA；擴(kuò)增片段長度為725 bp）通過RT-PCR 方法對供試蠋蝽樣品中AcV-1 侵染情況進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，146 份樣品中，55 份樣品呈AcV-1 陽性，即感染率為37.67%（表2）。

表2 不同來源蠋蝽感染AcV-1 情況檢測Tab.2 Infection rates of AcV-1 in Arma chinensis from different sources

3 討論

本研究中利用RNA-seq 測序技術(shù)在蠋蝽體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的AcV-1 是一種新雙順反子病毒。雙順反子病毒是一類小型無包膜RNA 病毒，此類病毒含有一個長度約8～10 kb 的正義單鏈RNA 基因組［15］。雙順反子病毒科分為3 個屬：蜜蜂急性麻痹病毒屬（Aparavirus），蟋蟀麻痹病毒屬（Cripavirus）和吸血獵蝽病毒屬（Triatovirus），該分類基于IGR-IRES表現(xiàn)出的系統(tǒng)發(fā)育差異和獨特特征［16-17］，通過病毒蛋白衣殼和RdRp 的系統(tǒng)發(fā)育分析也支持了這種分類［18］。蠋蝽病毒AcV-1 基于ORF1 和ORF2 氨基酸序列的NJ 樹表明，該病毒與CrPV 聚在一起，而基于RdRp 氨基酸序列的ML 樹表明，其與NLCV 聚在一起。上述聚類分析結(jié)果表明AcV-1與CrPV、NLCV 具有很高的同源性，但又不盡相同，推測其為蟋蟀麻痹病毒屬的一個新成員。

利用檢測引物AcV-1-F/AcV-1-R 檢測146 份蠋蝽樣本，其中有55 份樣本呈陽性，即感染率為37.67%。昆蟲與病毒之間存在多種互作關(guān)系，可以將這些互作關(guān)系分為3 大類：致病、共生和潛伏侵染［19-21］，科學(xué)利用寄主與病毒之間的關(guān)系，有益于農(nóng)作物病蟲害綠色防控技術(shù)的發(fā)展。目前AcV-1 的功能尚不清楚，通過帶毒蠋蝽成活率及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，推測該病毒可能無致死功能，但其對蠋蝽生長發(fā)育和生殖是否有顯著影響及其與蠋蝽的互作機制尚待進(jìn)一步研究。若為有害病毒，可根據(jù)其傳播途徑等構(gòu)建防控技術(shù)體系；若為有益病毒，可進(jìn)一步加以利用，為蠋蝽商業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究中在蠋蝽體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種新的雙順反子病毒，并將其命名為Arma chinensis virus-1（AcV-1）。該病毒含有完整讀碼框的基因組序列，長度為9 192 nt（不包含Poly A），包含2 個ORFs。ORF1 編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，包含3 個保守結(jié)構(gòu)域，分別是RdRp、蛋白酶和RNA 解旋酶；ORF2 主要編碼衣殼蛋白。