吳 薇，袁 帥，鄭 璽，葉愛(ài)萍，徐 磊，董洪旭，劉 偉，劉 祥，鄧金華，張立新*

1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西省楊凌農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)示范區(qū)西農(nóng)路22號(hào) 712100

2.陜西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，陜西省寶雞市高新大道100號(hào) 721013

隨著我國(guó)煙草行業(yè)的持續(xù)發(fā)展，對(duì)優(yōu)質(zhì)煙葉原料的需求量進(jìn)一步增加，對(duì)烤煙原料質(zhì)量的要求也逐步提高［1］。其中，烤煙上部葉占整株煙葉的30%～40%，但由于其成熟度不夠、葉片偏厚、組織結(jié)構(gòu)緊密、淀粉和煙堿含量偏高、糖堿比低、內(nèi)在化學(xué)成分不協(xié)調(diào)和刺激性較大等問(wèn)題，使烤煙上部葉的工業(yè)可用性降低［2-5］。為了解決這一問(wèn)題，前人曾通過(guò)完善栽培技術(shù)［1］、改變上部煙葉的采收方式［6］、使用先進(jìn)烘烤設(shè)備［7］等措施，在一定程度上使上部煙葉的工業(yè)可用性有所提高。但因產(chǎn)量降低、費(fèi)工費(fèi)時(shí)、投資增加等問(wèn)題，影響了技術(shù)的推廣應(yīng)用。劉勇等［8］通過(guò)改進(jìn)烘烤工藝，提高了上部煙葉烘烤品質(zhì)和可用性，但由于只對(duì)烘烤環(huán)節(jié)中的烘烤溫度和時(shí)間進(jìn)行調(diào)整，煙葉可用性的改善程度有限。

煙葉的內(nèi)源酶在烘烤過(guò)程中對(duì)煙葉淀粉的轉(zhuǎn)化與香氣物質(zhì)的形成具有重要作用。有研究表明，在烘烤過(guò)程中煙葉淀粉含量在內(nèi)源酶的作用下顯著下降，香氣物質(zhì)含量顯著提高［9］。但煙葉內(nèi)源酶含量較低，在煙葉烘烤過(guò)程中依靠自身酶的作用不足以有效調(diào)節(jié)影響烤煙品質(zhì)的各種成分含量。因此，通過(guò)發(fā)酵的方法，利用酶降解煙堿，合成香氣物質(zhì)及改善煙葉、再造煙葉和煙梗品質(zhì)的技術(shù)已得到重視［10-11］。在煙葉烘烤過(guò)程中噴施果膠酶可降低煙葉的胞壁物質(zhì)和果膠含量，減少雜氣，減輕刺激性［12-14］。烘烤過(guò)程中噴施纖維素酶和果膠酶后烤煙煙葉香氣質(zhì)、香氣量增加，雜氣減少，刺激性降低，香氣協(xié)調(diào)［15-17］。噴施中性蛋白酶、α-淀粉酶、糖化酶等外源復(fù)合酶制劑后，烤煙蛋白質(zhì)含量降低，游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)中性香氣成分含量提高，煙葉總體香氣物質(zhì)種類增多，含量增加［18-21］。表明添加外源酶制劑對(duì)提高烤煙品質(zhì)具有一定效果。前人在烘烤過(guò)程中噴施酶制劑以提高煙葉品質(zhì)方面做了大量研究，但關(guān)于陜南煙區(qū)煙葉的相關(guān)研究報(bào)道則較少。為此，以陜南煙區(qū)生態(tài)條件為背景，以云煙87 為材料，烘烤前通過(guò)在煙葉上噴灑酶制劑后分析陜南上部煙葉化學(xué)成分的變化規(guī)律，旨在為陜南煙區(qū)通過(guò)添加酶制劑提高烤煙上部煙葉香氣品質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2017 年在陜西省安康市旬陽(yáng)縣神河鎮(zhèn)豐家?guī)X村進(jìn)行，種植土壤為黃棕土，基本理化性質(zhì)為pH 7.34，有機(jī)質(zhì)14.66 g/kg，速效氮55.03 mg/kg，速效磷10.62 mg/kg，速效鉀160.30 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)品種與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)所用酶制劑為天津市諾奧科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)，淀粉酶活力為4 000 U/g，纖維素酶活力為10 000 U/g，酶活力單位定義依據(jù)GB 1886.174—2016［22］。供試煙草品種為云煙87。將酶制劑按試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1）與適量蒸餾水混勻，對(duì)照為等量蒸餾水，用小型噴霧器均勻噴灑在煙葉表面，以葉面濕露不滴水為原則，在陰涼通風(fēng)處晾制6 h 后進(jìn)行烘烤，每處理設(shè)置3 次重復(fù)。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Experimental design

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 樣品處理

煙葉烘烤結(jié)束后，依據(jù)GB 2635—1992［23］在各處理中挑取B2F 等級(jí)的樣品，一部分由陜西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司制作成卷煙用于評(píng)吸，另一部分將煙葉主脈去除后放入烘箱中于45 ℃干燥2 h，取出后用小型粉碎機(jī)粉碎并過(guò)0.180 mm 篩，裝入塑封袋中并標(biāo)記，用于化學(xué)成分和香氣物質(zhì)含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的測(cè)定。

1.3.2 煙葉化學(xué)成分測(cè)定

參照YC/T 159—2002［24］、YC/T 216—2013［25］、YC/T 161—2002［26］、YC/T 217—2007［27］、YC/T 468—2013［28］標(biāo)準(zhǔn)方法分別測(cè)定煙葉總糖、還原糖、淀粉、總氮、鉀和煙堿含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

1.3.3 煙葉香氣物質(zhì)測(cè)定

采用減壓蒸餾萃取法（VDE 法）［29］提取煙葉中香氣物質(zhì)，采用Trace-1310-ISQLT 氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）進(jìn)行定性分析。分析條件：

色譜柱：TG-5MS 毛細(xì)管柱（30 m ×0.25 mm ×0.25 μm）；程序升溫:初始溫度40 ℃，保持3 min，以4 ℃/min 升溫至300 ℃；進(jìn)樣口溫度310 ℃；載氣及流速：He，流速1.000 mL/min；不分流進(jìn)樣。傳輸線溫度：290 ℃；離子源溫度：300 ℃；電離方式：EI；轟擊電壓：70 eV。利用隨機(jī)Excalibur 工作站和NIST2002 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索定性，定量用內(nèi)標(biāo)法（硝基苯）計(jì)算，內(nèi)標(biāo)校正因子為1，計(jì)算公式：

ms=（mi×As）/（m0×Ai） （1）

式中：ms為香氣物質(zhì)含量，μg/g；mi為內(nèi)標(biāo)物含量，μg；As為香氣成分的峰面積；Ai為內(nèi)標(biāo)物的峰面積；m0為粉碎煙樣的質(zhì)量，g。

1.3.4 煙葉感官品質(zhì)鑒定

依據(jù)YC/T 415—2011［30］，由陜西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心具備煙草行業(yè)評(píng)吸資質(zhì)的9人組成評(píng)吸小組，對(duì)添加酶制劑后煙葉的感官品質(zhì)進(jìn)行評(píng)吸鑒定，對(duì)烤后煙葉香氣質(zhì)、香氣量、濃度、勁頭、雜氣、刺激性和余味等7 項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行打分，各指標(biāo)評(píng)吸總分以9 名評(píng)吸員的評(píng)分加權(quán)平均值為最后分值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及制圖，用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Tukey 法進(jìn)行數(shù)據(jù)間差異的顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶制劑對(duì)上部煙葉常規(guī)化學(xué)成分的影響

煙葉化學(xué)成分含量的高低與煙葉品質(zhì)密切相關(guān)［31］。不同酶制劑處理下煙葉常規(guī)化學(xué)成分含量結(jié)果見表2。與CK 相比，噴施酶制劑后，煙葉總糖和還原糖含量升高至適宜范圍內(nèi)或更接近適宜范圍，總糖較CK 增加1.3%～10.7%，還原糖較CK增加2.7%～15.0%；煙葉總氮與鉀含量增加，總氮含量較CK 增加2.8%～9.1%，鉀含量較CK 增加6.2%～17.7%，且均表現(xiàn)出高濃度酶處理的增加效果好于低濃度酶處理；煙葉煙堿含量下降，降幅為6.3%～13.2%。結(jié)合前人文獻(xiàn)報(bào)道，煙葉總氮含量的提高可能與酶本身含氮、酶制劑的噴施激活了氮代謝相關(guān)酶活性以及煙葉的干基質(zhì)量減少有關(guān)，煙葉鉀含量增加可能與酶制劑噴施后干物質(zhì)總量損失有關(guān)［12］；煙堿含量降低可能與酶制劑的噴施影響煙堿代謝相關(guān)的酶活性，進(jìn)而促進(jìn)煙堿降解有關(guān)［29,32］。

表2 不同酶制劑處理對(duì)煙葉常規(guī)化學(xué)成分含量的影響①Tab.2 Effects of treatments with different enzyme preparations on chemical components of tobacco leaves

2.2 酶制劑對(duì)上部煙葉香氣品質(zhì)的影響

不同酶制劑處理下煙葉質(zhì)體色素降解產(chǎn)物含量見表3。質(zhì)體色素降解產(chǎn)物中新植二烯、類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、香葉基丙酮、巨豆三烯酮和二氫獼猴桃內(nèi)酯對(duì)烤煙香氣影響較大［33-34］，與CK 相比，噴施酶制劑后煙葉質(zhì)體色素降解產(chǎn)物含量提高，60 U/g 纖維素酶（T4）處理的煙葉新植二烯、香葉基丙酮、巨豆三烯酮含量較CK 增加最顯著，分別增加35.5%、30.1%和75.7%。30 U/g 纖維素酶處理的煙葉二氫獼猴桃內(nèi)酯較CK 增加最顯著，增加27.8%。

表3 不同酶制劑處理對(duì)煙葉質(zhì)體色素降解產(chǎn)物含量的影響Tab.3 Effects of treatments with different enzyme preparations on contents of plastid pigment degradation products in tobacco leaves （μg·g-1）

不同酶制劑處理煙葉苯丙氨酸類致香物質(zhì)含量見表4。表4 表明，與CK 相比，不同處理煙葉苯丙氨酸類降解產(chǎn)物含量不同，總量均降低，這與王林等［18］的研究結(jié)果相悖，可能與施用酶的來(lái)源、種類和濃度不同有關(guān)。

表4 不同酶制劑處理對(duì)煙葉苯丙氨酸類致香物質(zhì)含量的影響Tab.4 Effects of treatments with different enzyme preparations on contents of phenylalanine aroma substances in tobacco leaves （μg·g-1）

不同酶制劑處理煙葉美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量見表5。表5 表明，與CK 相比，不同處理煙葉美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量均有提高，增幅6.5%～16.8%，與石志發(fā)等［35］的研究結(jié)果一致。

表5 不同酶制劑處理對(duì)煙葉美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量的影響Tab.5 Effects of treatments with different enzyme preparations on contents of Maillard reaction products in tobacco leaves （μg·g-1）

不同酶制劑處理煙葉類西柏烷類致香物質(zhì)降解產(chǎn)物含量見表6。表6 表明，與CK 相比，不同處理煙葉類西柏烷類致香物質(zhì)降解產(chǎn)物含量不同，60 U/g 纖維素酶處理的類西柏烷類致香物質(zhì)較CK 增加28.6%，其余酶制劑處理與CK 相比則顯著降低，與石志發(fā)等［35］的研究結(jié)果一致。

表6 不同酶制劑處理對(duì)煙葉類西柏烷類致香物質(zhì)含量的影響Tab.6 Effects of treatments with different enzyme preparations on contents of cembrane aroma substances in tobacco leaves （μg·g-1）

此外，煙葉中除檢測(cè)到的上述4 類主要的致香物質(zhì)外，還包括醇類和烷烴類等10 多種致香物質(zhì)，但在2 種濃度的纖維素酶處理后的煙葉中均檢測(cè)到麥斯明，為0.80～0.90 μg/g；烷烴類物質(zhì)以2-甲基二十烷含量最高，且60 U/g 纖維素酶處理顯著高于其他處理，達(dá)89.59 μg/g，醇類中的寸拜醇含量以60 U/g 纖維素酶處理最高，為12.34 μg/g。

2.3 酶制劑對(duì)上部煙葉感官品質(zhì)的影響

不同酶制劑處理上部煙葉感官鑒定結(jié)果見表7。從表7 中可以看出，與CK 相比，噴施纖維素酶后煙葉香氣質(zhì)、香氣量與余味分值增加或持平，雜氣、刺激性降低，感官品質(zhì)提高，總分分別較CK 增加1.65 分和2.93 分。這可能是由于纖維素酶的噴施降低了煙葉纖維素含量，而纖維素含量的降低可減少刺激性與雜氣。這與李國(guó)棟等［15］的研究結(jié)果一致。噴施淀粉酶、淀粉酶與纖維素酶的復(fù)合酶制劑后煙葉的感官品質(zhì)下降，這與楊述元等［36］、王林等［18］的研究結(jié)果相悖?？赡苁怯捎诘矸勖概c纖維素酶的噴施雖然在一定程度上降低了煙葉淀粉、纖維素含量，但同時(shí)也導(dǎo)致其他化學(xué)成分含量發(fā)生變化，這并不利于煙葉品質(zhì)的提高。例如樊文舉等［37］研究發(fā)現(xiàn)，噴施外源淀粉酶后，煙葉淀粉含量下降，同時(shí)煙葉糖含量升高，總氮和總植物堿含量下降，煙葉總體品質(zhì)下降。總體來(lái)看，以纖維素酶60 U/g 處理的煙葉評(píng)吸總分最高，效果較好。

表7 不同酶制劑處理對(duì)煙葉感官品質(zhì)的影響①Tab.7 Effects of treatments with different enzyme preparations on sensory quality of tobacco leaves （分）

3 結(jié)論

①同等酶用量條件下，不同酶制劑處理的效果依次為纖維素酶＞淀粉酶＞復(fù)合酶。②同種酶制劑不同用量條件下，60 U/g 纖維素酶制劑的處理效果優(yōu)于30 U/g 纖維素酶制劑；而淀粉酶制劑處理效果則相反，30 U/g 淀粉酶制劑的處理效果優(yōu)于60 U/g 淀粉酶制劑。③噴施纖維素酶、淀粉酶及復(fù)合酶制劑可顯著提高上部煙葉可溶性總糖、還原糖和鉀含量；噴施纖維素酶制劑可顯著降低上部葉煙堿含量，噴施淀粉酶制劑還可顯著降低上部煙葉淀粉含量。④纖維素酶處理可通過(guò)增加上部煙葉香氣質(zhì)，降低雜氣和刺激性而提高上部煙葉的感官品質(zhì)。⑤總體來(lái)看60 U/g 纖維素酶制劑處理效果最好，可通過(guò)協(xié)調(diào)上部煙葉化學(xué)成分，增加致香物質(zhì)含量，改善感官品質(zhì)，進(jìn)而改善上部煙葉品質(zhì)。