趙艷爭，佘坤，郭青，季艷霞，王忠瑜，孫彩云

1 邯鄲市中心醫(yī)院腫瘤四科，河北邯鄲056000；2 河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，由于其早期多無癥狀或僅表現(xiàn)為上腹不適、反酸、喛氣等非特異性癥狀，很容易被患者忽視，超過80%患者出現(xiàn)典型癥狀或體征就診時已進(jìn)展至中晚期，預(yù)后較差[1]。但目前臨床上尚未發(fā)現(xiàn)一種靈敏度高、特異性強的早期胃癌生物標(biāo)志物。非編碼RNA是指轉(zhuǎn)錄組中不翻譯為蛋白質(zhì)的RNA分子，雖然不編碼蛋白質(zhì)，但在調(diào)節(jié)蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯及穩(wěn)定性等方面卻具有重要作用。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的RNA分子，微小RNA(miRNA)是一類長度21～25 nt的內(nèi)源性單鏈小分子RNA，二者不僅在基因表達(dá)調(diào)控中具有重要作用，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程中亦能發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，部分lncRNA、miRNA異常表達(dá)可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[2]。堿性亮氨酸拉鏈家族轉(zhuǎn)錄因子V-Maf鳥類肌筋膜纖維肉瘤癌基因同源物G(MAFG)-反義核糖核酸1(AS1)是近年新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA。有研究報道，lncRNA MAFG-AS1在肝癌、乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，并能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲[3-4]。miR-143-3p是miRNA家族成員之一。有研究報道，miR-143-3p在肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，并能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移[5]；但miR-143-3p在卵巢癌組織中表達(dá)下調(diào)，并抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移[6]。趙晨陽等[7]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MAFG-AS1 3′非翻譯區(qū)存在miR-143-3p的結(jié)合位點，lncRNA MAFG-AS1可能通過靶向miR-143-3p調(diào)控宮頸癌細(xì)胞增殖。但目前l(fā)ncRNA MAFG-AS1、miR-143-3p表達(dá)與胃癌的關(guān)系鮮見報道。本研究觀察了胃癌組織lncRNA MAFG-AS1、miR-143-3p表達(dá)變化，并探討其表達(dá)變化與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1月—2018年3月邯鄲市中心醫(yī)院收治的胃癌患者105例。所有患者經(jīng)術(shù)后病理檢查明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②初診，入組前未接受任何抗腫瘤治療；③年齡>18歲；④接受根治性或姑息性手術(shù)；⑤臨床病理資料和術(shù)后隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他胃部疾病者；②合并其他部位腫瘤者；③合并重要臟器嚴(yán)重疾病者。其中，男56例、女49例，年齡(65.07±7.85)歲(≥60歲62例、<60歲43例)；腫瘤直徑：≥3.5 cm 57例，<3.5 cm 48例；腫瘤部位：賁門或胃底37例，胃體19例，胃竇49例；組織分化程度：高中分化63例，低分化42例；浸潤深度：黏膜層或黏膜下層31例，肌層或漿膜層74例；pTNM分期：Ⅰ、Ⅱ期73例，Ⅲ期32例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移75例。本研究經(jīng)邯鄲市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(審批編號：ZXYY2021004)，所有患者或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 lncRNA MAFG-AS1、miR-143-3p表達(dá)檢測 取手術(shù)切除的新鮮胃癌組織及其配對的癌旁組織(距腫瘤組織邊緣5 cm以上，并經(jīng)病理檢查證實為正常胃組織)，采用TRIzol法提取組織總RNA，按PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit說明合成第一鏈cDNA。反應(yīng)條件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。以cDNA為模板，按SYBR Green qPCR Mix說明進(jìn)行PCR擴增。所有引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計合成。引物序列：lncRNA MAFG-AS1上游引物5′-ATGACGACCCCCAATAAAGGA-3′，下游引物5′-CACCGACATGGTTACCAGC-3′，擴增片段大小103 bp；miR-143-3p上游引物5′-CGAGAGTGAGATGCACTG-3′，下游引物5′-ATCCAGTGCAGGCGAGG-3′，擴增片段大小112 bp；內(nèi)參U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，擴增片段大小105 bp。PCR反應(yīng)體系共50 μL：cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，Premix Ex Taq DNA 聚合酶25 μL，RNase-Free ddH2O 21 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性2 s、67 ℃退火15 s、72 ℃延伸20 s共30個循環(huán)。所有操作于CFX96實時熒光定量PCR儀上完成。PCR擴增反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，收集循環(huán)閾值(CT)數(shù)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算lncRNA MAFG-AS1、miR-143-3p相對表達(dá)量。

1.3 隨訪 所有患者出院后電話隨訪3年，每3個月一次。以患者出現(xiàn)全因死亡或隨訪3年結(jié)束時終止隨訪，統(tǒng)計隨訪期間患者生存情況。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織與癌旁正常組織lncRNA MAFG-AS1、miR-143-3p表達(dá)比較 胃癌組織與癌旁正常組織lncRNA MAFG-AS1相對表達(dá)量分別為3.02±1.11、1.05±0.27，miR-143-3p相對表達(dá)量分別為1.63±0.34、3.79±1.25。胃癌組織lncRNA MAFG-AS1相對表達(dá)量高于癌旁正常組織，miR-143-3p相對表達(dá)量低于癌旁正常組織(t分別為17.671、17.086，P均<0.05)。

2.2 胃癌組織lncRNA MAFG-AS1、miR-143-3p表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 胃癌組織lncRNA MAFG-AS1、miR-143-3p表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 胃癌組織lncRNA MAFG-AS1表達(dá)與miR-143-3p表達(dá)的關(guān)系 胃癌組織lncRNA MAFG-AS1表達(dá)與miR-143-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.699，P<0.05)。見圖1。

圖1 胃癌組織lncRNA MAFG-AS1表達(dá)與miR-143-3p表達(dá)關(guān)系的散點圖

2.4 胃癌組織lncRNA MAFG-AS1、miR-143-3p表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 105例胃癌患者中，隨訪期間死亡34例。以lncRNA MAFG-AS1、miR-143-3p相對表達(dá)量的均數(shù)為臨界值，將患者分為lncRNA MAFG-AS1高表達(dá)者55例與lncRNA MAFG-AS1低表達(dá)者50例、miR-143-3p高表達(dá)者48例與miR-143-3p低表達(dá)者57例。lncRNA MAFG-AS1高表達(dá)者與lncRNA MAFG-AS1低表達(dá)者3年總生存率分別為58.18%(32/55)、78.00%(39/50)，lncRNA MAFG-AS1高表達(dá)者3年總生存率低于lncRNA MAFG-AS1低表達(dá)者(χ2=4.783，P<0.05)；miR-143-3p高表達(dá)者與miR-143-3p低表達(dá)者3年總生存率分別為79.17%(38/48)、57.89%(33/57)，miR-143-3p高表達(dá)者3年總生存率高于miR-143-3p低表達(dá)者(χ2=5.383，P<0.05)。見圖2、3。

圖2 胃癌組織不同lncRNA MAFG-AS1表達(dá)者的生存曲線

圖3 胃癌組織不同miR-143-3p表達(dá)者的生存曲線

3 討論

胃癌是一種發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤，其發(fā)病機制尚不完全清楚，通常認(rèn)為是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。早期胃癌的治療效果較好，患者5年總生存率多在95%以上。但胃癌早期多無癥狀或僅表現(xiàn)為上腹不適、反酸、喛氣等非特異性癥狀，很容易被患者忽視，大部分胃癌患者就診時已進(jìn)展至中晚期，預(yù)后較差[8]。目前臨床上尚未發(fā)現(xiàn)一種靈敏度高、特異性強的早期胃癌診斷生物標(biāo)志物。因此，深入探索胃癌發(fā)病的分子機制，尋找一種能夠早期篩查的腫瘤生物標(biāo)志物，對胃癌早期診斷具有重要意義。

lncRNA是一類具有高度組織特異性的非編碼RNA，能夠在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后等層面上調(diào)控基因的表達(dá)[9]。lncRNA作為miRNA的前體，可通過誘導(dǎo)染色質(zhì)修飾、調(diào)控信使RNA或作為競爭性內(nèi)源RNA與靶基因競爭性結(jié)合miRNA，從而調(diào)控miRNA表達(dá)，繼而通過引起DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑等誘發(fā)腫瘤發(fā)生[10]。lncRNA MAFG-AS1是近年新發(fā)現(xiàn)的一種具有致癌作用的lncRNA，與MAFG共享一個頭對頭啟動子并擁有CpG島，可通過誘導(dǎo)DNA甲基化促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。lncRNA MAFG-AS1可作為miRNA海綿靶向調(diào)控其基因表達(dá)，從而參與惡性腫瘤的生物學(xué)行為[11]。有研究報道，lncRNA MAFG-AS1在膀胱癌組織中表達(dá)上調(diào)，并且其高表達(dá)與膀胱癌組織學(xué)分級、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；lncRNA MAFG-AS1可能通過靶向miR-125b-5p調(diào)節(jié)下游靶標(biāo)鞘氨醇激酶1表達(dá)，從而促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[12]。lncRNA MAFG-AS1在肝癌組織中表達(dá)增加，lncRNA MAFG-AS1可通過負(fù)性調(diào)控miR-6852促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[3]。lncRNA MAFG-AS1在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)升高，lncRNA MAFG-AS1通過靶向抑制miR-339-5p促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶15表達(dá)，增強腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[4，13]。有研究報道，lncRNA MAFG-AS1過表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌組織lncRNA MAFG-AS1表達(dá)上調(diào)，并且其表達(dá)與胃癌組織分化程度、浸潤深度、pTNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后有關(guān)。提示lncRNA MAFG-AS1在胃癌中可能發(fā)揮促癌基因作用，但其具體機制仍不十分清楚，尚需進(jìn)一步研究。

miRNA是一類在真核生物中廣泛存在的、在進(jìn)化上高度保守的小分子非編碼RNA，可通過作用于相應(yīng)靶信使RNA，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)行為。miR-143-3p是miRNA家族成員之一，是一種潛在的腫瘤調(diào)控因子，通過調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖或凋亡，在惡性腫瘤中發(fā)揮致癌或抑癌基因作用[6]。有研究報道，miR-143-3p可通過直接靶向抑制Bcl-2、IGF-1R表達(dá)，抑制鼻鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和遷移[15]；miR-143-3p還可通過靶向FGF1促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[16]。但在原發(fā)性肺癌腦轉(zhuǎn)移組織中miR-143-3p表達(dá)上調(diào)，miR-143-3p可通過靶向Vasohibin-1 3′非翻譯區(qū)增強腫瘤細(xì)胞的血腦屏障侵襲能力，促使肺癌腦轉(zhuǎn)移[5]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-143-3p在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，并且其表達(dá)與胃癌組織分化程度、浸潤深度、pTNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后有關(guān)。提示miR-143-3p可能作為抑癌基因參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展，與牛榮等[17]研究結(jié)果基本一致。究其原因，miR-143-3p能夠直接靶向抑制抗凋亡基因AKT2表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[18]，或通過靶向環(huán)氧合酶2誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[19]。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，胃癌組織lncRNA MAFG-AS1表達(dá)與miR-143-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示lncRNA MAFG-AS1可能通過負(fù)向調(diào)控miR-143-3p表達(dá)參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展。LI等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MAFG-AS1通過靶向miR-143-3p調(diào)節(jié)環(huán)氧合酶2表達(dá)，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。陳軍芳等[21]研究報道，lncRNA MAFG-AS1可通過調(diào)控miR-143-3p/AKT2軸促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。

綜上所述，胃癌組織lncRNA MAFG-AS1表達(dá)上調(diào)、miR-143-3p表達(dá)下調(diào)，二者表達(dá)變化與胃癌惡性生物學(xué)行為和患者預(yù)后不良有關(guān)。但lncRNA MAFG-AS1是否通過負(fù)向調(diào)控miR-143-3p表達(dá)參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展尚需進(jìn)一步研究。