焦宏亮,王夢(mèng)飛,朱 紅,張婷婷,周 華,蔡 恒
(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,江蘇南京211800)
海藻糖是一種由兩個(gè)葡萄糖分子以1,1-糖苷鍵所構(gòu)成的非還原性二糖,因其糖苷鍵的結(jié)合方式不同而形成3種異構(gòu)體,即海藻糖(α,α)、異海藻糖(β,β)和新海藻糖(α,β)[1-2]。其中,α,α-海藻糖廣泛存在于藻類、細(xì)菌、昆蟲、無脊椎動(dòng)物及酵母等多種生物體內(nèi),但不存在于哺乳動(dòng)物中。海藻糖不含還原端羥基,是一種不能參與糖基化反應(yīng)的穩(wěn)定分子[3-4]。在惡劣環(huán)境下,海藻糖能夠在細(xì)胞表面形成獨(dú)特的保護(hù)膜,從而有效地保護(hù)蛋白不因變性而失活,對(duì)生物體具有保護(hù)作用[5-6]。此外,海藻糖還具有分子伴侶特性,可防止蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊或聚集,并通過促進(jìn)自噬,有助于去除聚集的蛋白質(zhì),在治療神經(jīng)性疾病方面也有著一定的作用[7-9]。在胞外添加的雷帕霉素和海藻糖可以治療小鼠的帕金森病(PD)模型的自噬激活和行為缺陷,這成了治療PD的一種潛在方向[10]。胞外添加α-突觸核蛋白(α-syn)聚集體則主要損害溶酶體活性,會(huì)導(dǎo)致受體細(xì)胞內(nèi)的α-syn積累,而海藻糖作為一種重要的自噬誘導(dǎo)劑,能阻止溶酶體活性的改變并減少胞內(nèi)的α-syn積累[11]。
海藻糖在釀酒酵母中是通過兩步途徑合成。第一步,在海藻糖-6-磷酸合成酶(由TPS1基因編碼)作用下,由尿苷-5-二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)和葡萄糖-6-磷酸形成海藻糖-6-磷酸;第二步,海藻糖-6-磷酸在海藻糖-6-磷酸磷酸酶(由TPS2基因編碼)的去磷酸化作用下形成海藻糖[12]。TPS1除了能編碼合成海藻糖之外,還具有調(diào)節(jié)糖代謝的功能;酵母TPS1Δ突變株在葡萄糖存在的情況下引起生長(zhǎng)缺陷[13-14]。迄今為止,大多數(shù)的高等植物基因組中都含有TPS基因家族,海藻糖在高等植物中有著重要的調(diào)節(jié)作用[15-16]。Tps1作為TPS復(fù)合物的關(guān)鍵亞基,未磷酸化的Tps3(海藻糖6-磷酸合酶/磷酸酶的調(diào)節(jié)亞基)可能作為Tps2的激活劑發(fā)揮作用,恢復(fù)海藻糖的合成[17]。Tps2和Pfk2(6-磷酸果糖激酶β亞基)的合成是釀酒酵母正常生長(zhǎng)和熱脅迫調(diào)節(jié)所必需的[18]。另外,TPS2基因的缺失對(duì)Tps1的活性無影響,但會(huì)導(dǎo)致海藻糖-6-磷酸磷酸酶活性完全喪失,并且在熱應(yīng)激時(shí)會(huì)積累過量的海藻糖-6-磷酸[19]。海藻糖并不能完全恢復(fù)因TPS1Δ或TPS2Δ突變菌所引起的生長(zhǎng)缺陷[20]。然而有研究人員認(rèn)為釀酒酵母對(duì)各種外界脅迫條件(氧化、滲透壓、溫度等)的耐受性依賴于海藻糖代謝途徑而非海藻糖自己本身[21-22]。雖然海藻糖作為一種滲透性保護(hù)劑,與其在體內(nèi)抗逆作用的相關(guān)性仍不完全明晰,但是TPS2基因的研究有助于解析細(xì)胞抗逆性系統(tǒng)的影響,為海藻糖用于治療相關(guān)疾病奠定理論基礎(chǔ)[23]。
酵母細(xì)胞與人體細(xì)胞有著類似的衰老代謝機(jī)制,因其具有多種優(yōu)勢(shì);已作為真核生物模式菌被應(yīng)用多年[24-25]。1996年酵母基因組測(cè)序完成后,發(fā)現(xiàn)其基因表達(dá)調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制與高等動(dòng)植物具有高度同源性[26]。目前已有許多研究者以釀酒酵母為模式生物進(jìn)行基礎(chǔ)性研究,成為當(dāng)今生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[27]。本研究采用 Cre-LoxP 系統(tǒng)、Kanr抗性標(biāo)記和同源重組技術(shù)敲除TPS2基因,構(gòu)建釀酒酵母TPS2基因缺失菌株,分析在外界脅迫條件下TPS2基因敲除對(duì)酵母菌海藻糖合成和細(xì)胞抗逆性的影響。
1.1.1 菌種與質(zhì)粒
釀酒酵母模式菌BY4741(S.cerevisiaeBY4741,MATahis3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0)為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保藏菌株;質(zhì)粒pUG6(含抗遺傳霉素G418的Kanr篩選標(biāo)記和LoxP位點(diǎn))由廣西大學(xué)杜麗琴教授惠贈(zèng);質(zhì)粒pYX212(含有尿嘧啶篩選標(biāo)記)由南京工業(yè)大學(xué)陳勇老師惠贈(zèng);以上2種質(zhì)粒在大腸桿菌中均具有氨芐青霉素(Amp)抗性。
1.1.2 酶、試劑和儀器
rTaq酶、PrimeSTAR@Max DNA Polymerase、5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+plus)、T4 DNA Ligase、10×T4 DNA Ligase Buffer、DNA Marker DL10000、DNA Marker DL5000、DNA Marker DL2000、dNTP Mixture、Agarose Gel DNA Purification、酵母基因組提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及相關(guān)的常規(guī)限制酶,TaKaRa公司;G418、Amp,生工生物工程(上海)股份有限公司;PCR 儀,Biometra公司;凝膠成像系統(tǒng)、電轉(zhuǎn)儀,美國 Bio-Rad 公司;高速冷凍離心機(jī),德國Eppendorf公司;熒光顯微鏡,德國萊卡公司;超低溫冰箱,日本Sanyo公司;培養(yǎng)箱、水浴鍋,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;電泳儀,北京六一生物科技有限公司;其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)市售分析純。引物均由南京金斯瑞公司合成。
1.1.3 引物
根據(jù)SGD(Saccharomycesgenome database)數(shù)據(jù)庫的TPS2基因(S000002481)和GenBank 的pUG6 序列(登錄號(hào):AF298793.1)設(shè)計(jì)引物,敲除引物命名為QC-F、QC-R,基因TPS2驗(yàn)證引物為A、B、C、D。根據(jù)Hind Ⅲ、SacⅠ酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)TPS2回補(bǔ)引物HB-F、HB-R。所涉及的引物及其序列見表1。
表1 PCR引物及序列
1.1.4 培養(yǎng)基
YPD培養(yǎng)基:酵母膏0.5 g、蛋白胨1 g、葡萄糖2 g,去離子水定容至100 mL,自然pH;若需配制平板則加入瓊脂 2 g,用于酵母細(xì)胞的培養(yǎng)。
YPD+G418培養(yǎng)基:每50 mL培養(yǎng)基加入500 μL 10 mg/mL的G418母液,終質(zhì)量濃度100 μg/mL;若需配制平板則加入瓊脂 2 g,用于酵母轉(zhuǎn)化子的篩選。
LB培養(yǎng)基:酵母提取物0.5 g、胰蛋白胨 1 g、NaCl 1 g、去離子水定容至100 mL;若需配制平板則加入瓊脂 2 g,用于大腸桿菌的培養(yǎng)和保藏。
LB+Amp培養(yǎng)基:在100 mL培養(yǎng)基中加入100 μL 50 mg/mL的Amp母液,終質(zhì)量濃度為50 μg/mL,用于含質(zhì)粒大腸桿菌的培養(yǎng)與提取。
PBS緩沖液:KCl 0.2 g/L、KH2PO40.24 g/L、NaCl 8.0 g/L、Na2HPO41.44 g/L,調(diào)節(jié)pH至7.4。
以上培養(yǎng)基均須在高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min,葡萄糖單獨(dú)滅菌;G418與Amp須過濾除菌,在培養(yǎng)基降至合適溫度后再加入。
1.2.1 含G418抗性基因(kanr)及TPS2同源臂的PCR擴(kuò)增
實(shí)驗(yàn)所用的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至大腸感受態(tài)細(xì)胞中,參照分子克隆中的電擊轉(zhuǎn)化法操作。利用堿裂解法從大腸桿菌中提取質(zhì)粒pUG6,以該質(zhì)粒為模板,以 QC-F、QC-R 為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增獲得同源臂TPS2基因敲除組件。擴(kuò)增條件:退火溫度54 ℃,延伸時(shí)間3 min,總體系為100 μL,30個(gè)循環(huán);待PCR結(jié)束后取 2 μL PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
1.2.2 釀酒酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備
將釀酒酵母BY4741單菌落接種到50 mL YPD液體培養(yǎng)基中,在30 ℃、200 r/min條件下?lián)u床過夜培養(yǎng);按體積比2%接種量將種子液接種至100 mL YPD培養(yǎng)基中,接種4瓶,再于30 ℃、250 r/min搖床振蕩培養(yǎng)3~5 h;將培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移至冰預(yù)冷的離心管中,并于冰上冰浴30 min,并將離心機(jī)預(yù)冷至4 ℃,4 000 r/min 離心15 min,棄上清液;用200 mL冰預(yù)冷的超純水洗滌重懸菌體,4 ℃、4 000 r/min離心15 min,重復(fù)洗滌2次;用100 mL冰預(yù)冷的1 mol/L山梨醇溶液洗滌并重懸菌體,4 000 r/min離心15 min,棄上清液;再用100 mL冰預(yù)冷的山梨醇溶液洗滌并重懸菌體,4 ℃、4 000 r/min離心15 min后棄上清液,用殘留的山梨醇溶液將菌體溶解,不需加入新的山梨醇溶液溶解;溶解后的菌體,每管分裝100 μL至冰預(yù)冷的1.5 mL EP離心管中,于-80 ℃保存。
1.2.3TPS2基因敲除菌的構(gòu)建
將含G418抗性(kanr)及TPS2同源臂 PCR產(chǎn)物(約400 ng)加入 100 μL感受態(tài)細(xì)胞中,混勻后轉(zhuǎn)移至2 mm電轉(zhuǎn)杯預(yù)冷5 min,并使用Eppendorf公司的電轉(zhuǎn)化儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化(參數(shù):電壓1.5 kV、電容25 μF、電阻400 Ω、電擊間距2 mm)。電轉(zhuǎn)后立即加入 1 mL預(yù)冷山梨醇溶液在30 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)2~3 h進(jìn)行復(fù)蘇,結(jié)束后5 000 r/min 離心1 min,棄去部分上清液,留下100 μL濃縮液涂布于含 100 μg/mL G418 的 YPD篩選平板上,30 ℃培養(yǎng)2~3 d以觀察是否有轉(zhuǎn)化子。
1.2.4 釀酒酵母轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定
將平板上出現(xiàn)的單菌落挑選至含 100 μg/mL G418 的YPD 液體培養(yǎng)基中,在30 ℃、200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)過夜后,12 000 r/min離心2 min收集菌體,使用試劑盒提取重組菌DNA,并以獲得的基因組為模板,用 Taq DNA 聚合酶和引物對(duì) A/B、C/D 進(jìn)行PCR驗(yàn)證TPS2基因的敲除菌,驗(yàn)證成功的敲除菌命名為TPS2Δ。酵母基因提取步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。
1.2.5TPS2基因回補(bǔ)菌的構(gòu)建及驗(yàn)證
將釀酒酵母BY4741與TPS2敲除菌接種于YPD液體培養(yǎng)基中,于30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)過夜后,離心2 min收集菌體,使用生工生物工程(上海)股份有限公司的試劑盒提取BY4741的總DNA,并以總DNA為模板,用高保真酶、引物對(duì)HB-F/HB-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增好的序列先與質(zhì)粒pUC18進(jìn)行連接,再進(jìn)行測(cè)序;測(cè)序成功后的序列再與pYX212質(zhì)粒連接,進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化,將轉(zhuǎn)化子涂布于具有Amp抗性的LB平板上,篩選出連接成功的轉(zhuǎn)化子,再提取質(zhì)粒后電轉(zhuǎn)化至TPS2敲除菌感受態(tài)中,涂布在尿嘧啶缺陷型培養(yǎng)基中進(jìn)行重組子的篩選,然后用pYX212上多克隆位點(diǎn)(MSC)區(qū)域兩端的驗(yàn)證引物YZ-F/YZ-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證,從而得到TPS2回補(bǔ)菌(記作TPS2Δ-tps2)。
1.2.6 不同應(yīng)激條件下的表型實(shí)驗(yàn)分析
將BY4741、TPS2Δ-tps2和TPS2Δ菌培養(yǎng)過夜制備種子液,再將菌液稀釋至相同OD600后分別接種后在以下條件下培養(yǎng):在30 ℃和42 ℃ YPD液體中、含1 mol/L NaCl的YPD液體及含4 mmol/L H2O2的YPD液體中,180 r/min進(jìn)行培養(yǎng),每隔2 h取菌液測(cè)定OD600,一直持續(xù)到菌液OD600趨于平穩(wěn)。
1.2.7 活性氧的測(cè)定
用活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒(南京建成公司)測(cè)定酵母胞內(nèi)ROS水平。將BY4741、TPS2Δ-tps2和TPS2Δ單菌落分別接種于YPD液體培養(yǎng)基中,在30 ℃、180 r/min條件下?lián)u床過夜培養(yǎng),隔夜培養(yǎng)物稀釋于新鮮YPD中,調(diào)整OD600為0.1,在30 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)4 h后,分別加入4 mmol/L H2O2進(jìn)行氧化處理0.5 h,離心后加入PBS洗滌緩沖液2次,再用磷酸緩沖液(PBS)重懸,加入適量2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)探針,30 ℃孵育40 min,PBS洗滌重懸2~3次,取10 μL于熒光顯微鏡中觀察。
1.2.8 海藻糖含量的測(cè)定
海藻糖的提取操作如下:將BY4741、TPS2Δ-tps2和TPS2Δ單菌落分別接種于25mL普通YPD液體培養(yǎng)基中,180r/min、30 ℃搖床過夜培養(yǎng)。將BY4741、TPS2Δ-tps2和TPS2Δ菌液各取l0 mL菌液分別于30和42 ℃進(jìn)行處理2 h,結(jié)束后10 000 r/min離心10 min,棄上清液并用預(yù)冷的雙蒸水洗滌菌體3次。向每個(gè)試管中加入4 mL 0.5 mol/L的三氯乙酸(TCA)溶液,將菌體懸浮后置于冰水浴中,30 min后提取海藻糖,重復(fù)3次后合并上清液。取1 mL上清液,加入4 mL的蒽酮試劑,搖勻后置于冰水中冷卻,然后沸水浴中煮沸10 min,迅速取出放入冰水中冷卻,室溫靜置10 min,在620 nm處測(cè)吸光值,每組設(shè)置2個(gè)平行[ 28]。
PCR擴(kuò)增得到的G418抗性基因同時(shí)引入TPS2基因同源臂用于后續(xù)基因同源重組。以 QC-F、QC-R 為引物,利用 PCR 獲得帶有 2 個(gè) LoxP位點(diǎn)和kanr篩選標(biāo)記基因片段,進(jìn)行電泳驗(yàn)證,結(jié)果如圖1所示。由圖1可知:擴(kuò)增得到片段大小與理論預(yù)計(jì)(1 880 bp)一致,說明該P(yáng)CR 產(chǎn)物即為TPS2基因敲除組件。
M—DL5000;1—TPS2Δ PCR產(chǎn)物圖1 TPS2敲除組件的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of TPS2 gene disruption cassettes
采用電擊轉(zhuǎn)化法將TPS2基因敲除序列組件轉(zhuǎn)入釀酒酵母中。由于TPS2基因敲除序列組件中包含異源顯性的kanr標(biāo)記,將構(gòu)建好的序列組件轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞后,其兩端與酵母基因組同源的序列將引發(fā)同源重組替換,最終以loxp-kanr-loxp取代基因組中的TPS2從而賦予轉(zhuǎn)化子G418(遺傳霉素)抗性。2~3 d后可在含G418的平板上獲得轉(zhuǎn)化子。
提取轉(zhuǎn)化子基因組,以A/B、C/D為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,進(jìn)行電泳驗(yàn)證,結(jié)果見圖2。由圖2可知:使用引物A與B配對(duì)得到261 bp左右的產(chǎn)物,使用引物C與D得到了840 bp左右的產(chǎn)物,由此說明TPS2基因敲除成功。
M—DL2000;1—A/B PCR產(chǎn)物;2— C/D PCR產(chǎn)物圖2 TPS2基因A/B及C/D PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.2 Agarose gel electrophoresis analysis of TPS2 gene A/B and C/D products
為了進(jìn)一步驗(yàn)證TPS2基因敲除成功,將擴(kuò)增出的A/D PCR產(chǎn)物送南京金斯瑞公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果表明TPS2基因敲除成功。
通過將TPS2與pYX212質(zhì)粒連接后,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細(xì)胞中,隨后提取質(zhì)粒用Hind Ⅲ和SacⅠ進(jìn)行雙酶切,再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證分析,結(jié)果見圖3。由圖3可知:質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后產(chǎn)物大小分別約為8 300與2 700 bp。由此可見,TPS2基因已成功與pYX212質(zhì)粒連接。
M—DL10000;1—重組子酶切產(chǎn)物圖3 TPS2回補(bǔ)菌重組子酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.3 Agarose gel electrophoresis analysis of TPS2 replenishing bacteria recombinant digestion products
酶切驗(yàn)證成功后,通過將質(zhì)粒pYX212-TPS2轉(zhuǎn)入TPS2Δ中,并使用驗(yàn)證引物進(jìn)行PCR后,然后進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果見圖4。由圖4可知:PCR產(chǎn)物大小約為2 700 bp,由此可見,質(zhì)粒pYX212-TPS2已成功轉(zhuǎn)入TPS2Δ中,TPS2回補(bǔ)菌構(gòu)建成功。
M—DL5000;1—轉(zhuǎn)化子菌落PCR產(chǎn)物圖4 TPS2回補(bǔ)菌PCR驗(yàn)證的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.4 Verification of TPS2 replenishing bacteria PCR by agarose gel electrophoresis
將BY4741、TPS2Δ和TPS2Δ-tps2菌株進(jìn)行過夜培養(yǎng)制備種子液,稀釋至OD600相同后分別接種于25 mL 的普通YPD液體培養(yǎng)基中,通過在不同溫度(30 或42 ℃)、不同鹽濃度(0或1 mol/L NaCl)、不同H2O2濃度(0或4 mmol/L H2O2)進(jìn)行培養(yǎng),每過2 h取200 μL于96孔板上測(cè)定OD600,一直持續(xù)到菌液OD600平緩,結(jié)果見圖5。
圖5 BY4741/TPS2Δ/TPS2Δ-tps2在不同應(yīng)激條件下的生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curves of BY4741/TPS2Δ/TPS2Δ-tps2 at different stress conditions
由圖5可知:在30 ℃條件下,BY4741生長(zhǎng)趨勢(shì)高于回補(bǔ)菌TPS2Δ-tps2,而TPS2Δ-tps2生長(zhǎng)情況略好于敲除菌TPS2Δ;在42 ℃高溫脅迫條件下,BY4741、TPS2Δ、TPS2Δ-tps2均受到抑制,BY4741生長(zhǎng)情況仍然是遠(yuǎn)好于TPS2Δ和TPS2Δ-tps2,而TPS2Δ-tps2生長(zhǎng)情況略好于TPS2Δ;在1 mol/L NaCl鹽脅迫條件下,BY4741、TPS2Δ、TPS2Δ-tps2的生長(zhǎng)均受到嚴(yán)重抑制,但BY4741的生長(zhǎng)情況略好于TPS2Δ-tps2,而TPS2Δ-tps2的略好于TPS2Δ;在4 mmol/L H2O2氧化脅迫條件下,BY4741、TPS2Δ、TPS2Δ-tps2的生長(zhǎng)也受到嚴(yán)重抑制,BY4741的生長(zhǎng)情況略好于TPS2Δ-tps2,而TPS2Δ-tps2的略好于TPS2Δ。由于TPS2基因的缺失導(dǎo)致TPS2Δ胞內(nèi)海藻糖無法正常合成,而BY4741能夠正常合成海藻糖,TPS2Δ-tps2只能合成少量的海藻糖,因此出現(xiàn)BY4741的生長(zhǎng)情況好于TPS2Δ-tps2,TPS2Δ-tps2的生長(zhǎng)情況好于TPS2Δ的現(xiàn)象。由圖5還可知,在高溫脅迫條件下,BY4741與TPS2Δ、TPS2Δ-tps2的生長(zhǎng)情況差異最為明顯,因而后續(xù)實(shí)驗(yàn)將在高溫脅迫條件下進(jìn)行。由此可推斷TPS2基因的嚴(yán)重缺失會(huì)影響海藻糖的合成,導(dǎo)致細(xì)胞抗逆性減弱,進(jìn)而影響到細(xì)胞生長(zhǎng)。
將BY4741、TPS2Δ和TPS2Δ-tps2菌株接種于10 mL YPD培養(yǎng)基中,30 ℃過夜培養(yǎng),離心收集菌體,加入PBS洗滌2次并用PBS懸浮菌液至OD600為0.1,加入1 μL DCFH-DA熒光探針,混勻后置于30 ℃搖床共孵育1 h,再次用PBS洗滌2~3次,吸取5~10 μL于載玻片上,在熒光顯微鏡下觀察,結(jié)果如圖6所示。
圖6 胞內(nèi)ROS水平Fig.6 Intracelular ROS level
由圖6可知:與對(duì)照菌BY4741相比,TPS2Δ有較多的細(xì)胞被染成綠色熒光,由此可推斷TPS2的缺失增強(qiáng)了細(xì)胞的氧敏感性,導(dǎo)致胞內(nèi)ROS增多,這可能是因?yàn)闊o法正常合成海藻糖而導(dǎo)致細(xì)胞面對(duì)氧化脅迫無法做出應(yīng)激反應(yīng);而TPS2Δ-tps2被染色的細(xì)胞比TPS2Δ的明顯減少,由此可見TPS2基因的確會(huì)影響細(xì)胞抗氧化能力。
通過不同質(zhì)量濃度的海藻糖溶液(0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 g/L)與蒽酮試劑進(jìn)行反應(yīng),在620 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值,以吸光值為縱坐標(biāo),海藻糖濃度為橫坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=7.206 2x-0.011 7。
將過夜培養(yǎng)的BY4741、TPS2Δ-tps2和TPS2Δ菌液(濕質(zhì)量約0.02 g)進(jìn)行30 ℃和42 ℃處理后,10 000 r/min離心10 min后棄上清液并用預(yù)冷的雙蒸水洗滌菌體3次。向每個(gè)試管中加入4 mL 0.50 mol/L的TCA溶液,將菌體懸浮后置于冰水浴中,30 min后提取海藻糖,重復(fù)3次后合并上清液。取1 mL上清液,加入4 mL的蒽酮試劑,搖勻后置于冰水中冷卻,然后沸水浴中準(zhǔn)確煮沸10 min,迅速取出放入冰水中冷卻,室溫靜置10 min,在620 nm處比色。根據(jù)海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得到的結(jié)果如圖7所示。
圖7 BY4741/ TPS2Δ-tps2/ TPS2Δ在不同溫度條件下的海藻糖含量Fig.7 Trehalose content in BY4741/TPS2Δ-tps2/ TPS2Δ at different temperatures
由圖7可知:在30 ℃時(shí),BY4741和TPS2Δ菌株中的海藻糖含量基本一致,然而生長(zhǎng)表型卻有差異,這可能由于30 ℃屬于酵母細(xì)胞正常生長(zhǎng)溫度,并沒有受到外界應(yīng)激(高溫),所以胞內(nèi)海藻糖含量并不高,差異也不明顯;在經(jīng)過42 ℃處理后,BY4741的海藻糖含量明顯高于TPS2Δ-tps2和TPS2Δ的,由此可見,TPS2基因的缺失確實(shí)影響了細(xì)胞海藻糖的合成,而TPS2Δ-tps2的海藻糖含量略高于TPS2Δ的,由此可見,在正常條件下,釀酒酵母胞內(nèi)海藻糖含量較少,海藻糖合成的相關(guān)基因也處于低表達(dá)水平;而在高溫、氧化等刺激條件下,胞內(nèi)海藻糖迅速積累,回補(bǔ)菌中TPS2基因確實(shí)已表達(dá)并在一定程度上彌補(bǔ)了海藻糖的缺失。
以釀酒酵母模式菌株 BY4741 為出發(fā)菌株,通過同源重組對(duì)酵母TPS2基因敲除,命名為TPS2Δ;在敲除菌的基礎(chǔ)上重新構(gòu)建TPS2基因回補(bǔ)菌,命名為TPS2Δ-tps2。在此基礎(chǔ)上研究TPS2基因?qū)湍讣?xì)胞抗逆性的影響,并得到以下結(jié)論:1)通過生長(zhǎng)曲線表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,與對(duì)照菌BY4741相比,敲除菌TPS2Δ對(duì)高溫比氧化脅迫和高鹽條件更為敏感性,在高溫條件下,BY4741與TPS2Δ、TPS2Δ-tps2的生長(zhǎng)情況差異表現(xiàn)最為明顯;2)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè)結(jié)果說明,TPS2基因敲除增加了細(xì)胞胞內(nèi)ROS水平,而BY4741-TPS2中TPS2基因少量表達(dá)降低了胞內(nèi)ROS水平;3)不同溫度下胞內(nèi)海藻糖含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同溫度下胞內(nèi)海藻糖含量出現(xiàn)明顯差異,這可能是由于TPS2基因敲除不能夠正常合成海藻糖,而BY4741能夠正常合成,TPS2Δ-tps2只能少量合成海藻糖;TPS2Δ-tps2因TPS2基因少量表達(dá)而在一定程度上彌補(bǔ)胞內(nèi)海藻糖的不足,在多種脅迫條件下,TPS2Δ-tps2可以改善細(xì)胞抗逆性能。總之,TPS2基因的缺失降低了海藻糖的合成,導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)于抗逆環(huán)境的適應(yīng)調(diào)節(jié)能力減弱。