史琳琳，王 犇，吳劍榮，劉 和，詹曉北

(1. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院, 江蘇無錫214122;2. 江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院,江蘇無錫214122)

藍(lán)藻是對我國現(xiàn)有水體造成嚴(yán)重污染的一種水生原核生物。由于水體富營養(yǎng)化，藍(lán)藻水華頻頻爆發(fā)，嚴(yán)重影響我國水體生態(tài)文明和飲用水安全。藍(lán)藻治理一直是世界難題，目前我國藍(lán)藻治理主要以打撈為主。以無錫為例，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2007—2009年，無錫市共打撈藍(lán)藻140萬t[1]，2017年打撈近1 179萬t，藍(lán)藻暴發(fā)時，每天打撈量達(dá)數(shù)千噸，這些打撈的藍(lán)藻，如果不及時妥善處理，藍(lán)藻腐爛、滲透會造成二次污染[2]。實(shí)際上，藍(lán)藻含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[3-5]，其干物質(zhì)中主要含有40%～60%的蛋白質(zhì)和18%～25%的多糖類物質(zhì)，且藻藍(lán)蛋白是天然色素，在化妝品、食品[6-8]以及生物、醫(yī)藥行業(yè)應(yīng)用廣泛[9-12]，具有顯著的資源化利用潛力。

藍(lán)藻泥資源化利用領(lǐng)域主要有發(fā)酵產(chǎn)沼氣[13-16]、堆肥發(fā)酵[17-18]和生物塑料[19]等。由于藍(lán)藻含氮量高、有腥臭味以及潛在的藻毒素安全隱患等問題，導(dǎo)致藍(lán)藻泥資源化成本高、推廣困難。雖然可利用反復(fù)凍融法、超聲波法、有機(jī)溶劑萃取法等[20-22]方法從藍(lán)藻中提取藻藍(lán)蛋白，但這些方法能耗高，且提取后的藍(lán)藻藻渣在處理方面存在安全隱患，易造成二次污染，所以實(shí)際的應(yīng)用并不多。芽孢桿菌因能產(chǎn)高活性的蛋白酶、脂肪酶等產(chǎn)品，所以其具有保護(hù)土壤、促進(jìn)有機(jī)質(zhì)的分解、產(chǎn)生豐富的代謝物和抑制有害菌等作用，在水產(chǎn)、家禽等養(yǎng)殖業(yè)中以及環(huán)境治理領(lǐng)域有非常廣泛的應(yīng)用[23-24]，同時在生物降解藍(lán)藻及藻毒素方面也有顯著的效果[25-26]。因此，為了高效資源化利用藍(lán)藻，同時避免環(huán)境污染，亟須開發(fā)新型的藍(lán)藻資源化技術(shù)。

本文針對藍(lán)藻含有豐富有機(jī)質(zhì)的特點(diǎn)，將低成本的藍(lán)藻泥進(jìn)行高壓均質(zhì)處理，破碎藍(lán)藻細(xì)胞以釋放蛋白質(zhì)，再將廢棄物——藍(lán)藻藻渣與麥麩、秸稈等廉價(jià)物質(zhì)混合，用于培養(yǎng)枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌并制成生物菌劑，以期達(dá)到綜合利用藍(lán)藻的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用藍(lán)藻泥均是2018年5月份中下旬在無錫太湖黃泥田打撈站打撈的新鮮藍(lán)藻泥(含水率為90%～95%)，4 ℃冰箱保存。

枯草芽孢桿菌(ATCC14579)，筆者所在實(shí)驗(yàn)室保藏；地衣芽孢桿菌(CICIM B0109(T))，江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物平臺(原始菌源自ATCC 14580)。

麩皮，市售；藻毒素標(biāo)品，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)；甲醇色譜級、蛋白測定用BCA增強(qiáng)型試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、純凈水1.0 L，NaOH調(diào)pH至7.2左右。

LB固體培養(yǎng)基：在1.0 L LB液體培養(yǎng)基中加20 g瓊脂粉。

藍(lán)藻固體培養(yǎng)基：將藍(lán)藻破碎后收集的藻渣(含水率90%)與麩皮按質(zhì)量比55.5∶44.5混合均勻，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)藻泥的細(xì)胞破碎處理

將新鮮藍(lán)藻泥與去離子水混合均勻，過0.15 mm的分子篩，并用去離子水洗滌分子篩，加水將稀釋后的藍(lán)藻泥配制成總固體含量(TS)分別為1.6%、2.9%和3.6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))懸液后，分別在80 MPa下用高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎，循環(huán)管路5次，收集破碎后的藍(lán)藻細(xì)胞溶液，用顯微鏡觀察藍(lán)藻細(xì)胞在均質(zhì)前后變化。

為探究不同方法對蛋白質(zhì)釋放的影響，取部分藍(lán)藻溶液按照以下方式處理并進(jìn)行蛋白分析：

①未經(jīng)過破碎處理的藍(lán)藻溶液以8 000 r/min低溫離心10 min，上清液作為對照溶液；②均質(zhì)后的藍(lán)藻溶液以8 000 r/min低溫離心10 min，上清液記為CV；③均質(zhì)后的藍(lán)藻溶液在功率為400 W的超聲波清洗機(jī)內(nèi)超聲30 min后，8 000 r/min低溫離心10 min，上清液記為CVU；④均質(zhì)后的藍(lán)藻溶液-40 ℃冷凍12 h，8 000 r/min低溫離心10 min，上清液記為CVF；⑤均質(zhì)后的藍(lán)藻溶液先在超聲波清洗機(jī)內(nèi)超聲30 min，再-40 ℃冷凍12 h，8 000 r/min低溫離心10 min，上清液記為CVUF；⑥將其他大量破碎后的藍(lán)藻溶液在4 500 r/min低溫離心15 min，收集固體藻渣，混合均勻后，-4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 藍(lán)藻破碎液蛋白分析

采用凱氏定氮法分析不同TS的藍(lán)藻溶液中的總蛋白；藍(lán)藻破碎前后的上清液中可溶性蛋白質(zhì)的檢測則采用BCA試劑盒法。可溶性蛋白濃度及蛋白質(zhì)釋放率按式(1)～(2)計(jì)算。

(1)

(2)

式中：n為稀釋倍數(shù)。

藻膽體濃度的測定則通過紫外可見分光光度計(jì)測其破碎液在620、652和562 nm這3處的吸光度A，并以蒸餾水為空白對照，式(3)～(6)分別計(jì)算藍(lán)藻上清液中藻藍(lán)蛋白(PC)和別藻藍(lán)蛋白(APC)、藻紅蛋白(PE)和藻膽體濃度[27-28]。

(3)

(4)

(5)

ρ(藻膽體)=n(ρ(PC)+ρ(APC)+ρ(PE))

(6)

1.2.3 藍(lán)藻破碎液的電泳分析

使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析藍(lán)藻破碎前后蛋白質(zhì)[29]，配制12%的聚丙烯酰胺凝膠，取經(jīng)高速離心后TS為3.6%的藍(lán)藻細(xì)胞破碎上清液30 μL與10 μL 4×Protein SDS PAGE Loading混合均勻，沸水浴10 min，10 800 r/min離心2 min后，取上清液20 μL進(jìn)行電泳，先用80 V恒壓進(jìn)行電泳，當(dāng)?shù)鞍着艿椒蛛x膠與濃縮膠邊界時，將電壓調(diào)高到150 V，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，并用脫色液進(jìn)行脫色處理。

1.2.4 固態(tài)發(fā)酵

挑取已活化的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌單菌落接入LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃、200 r/min搖床生長至對數(shù)期，將得到的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌種子液按20 g/L的接種量接入TS為47%的藍(lán)藻固體培養(yǎng)基上，37 ℃靜置培養(yǎng)，每隔12 h翻動一次。

1.2.5 藍(lán)藻固態(tài)發(fā)酵過程中微生物的生長曲線

在發(fā)酵期間，分別在0～96 h取5 g樣品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，微生物菌落計(jì)數(shù)參照文獻(xiàn)[30]進(jìn)行；將樣品在105 ℃烘干至恒質(zhì)量，測定發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的含水率。

1.2.6 pH測定

準(zhǔn)確稱取10 g發(fā)酵干樣品加入100 mL純凈水中，混合均勻，并用超聲波清洗劑超聲20 min，靜置30 min后6 000 r/min離心3 min，用pH計(jì)測其上清液的pH[31]。

1.2.7 發(fā)酵過程中營養(yǎng)物質(zhì)分析

采用凱氏定氮法測定發(fā)酵樣品中的粗蛋白。準(zhǔn)確稱取發(fā)酵干樣品0.500 g (精確至0.001 g)，加入10 mL蒸餾水混勻，用T18DS25型分散機(jī)(無錫旭野科技有限公司)在12 000 r/min高速攪拌2 min，8 000 r/min離心10 min，上清液用BCA法測定其可溶性蛋白質(zhì)含量。

精確稱取1.000 g(精確至0.001 g)的未發(fā)酵樣品和發(fā)酵60 h的樣品，用5%三氯乙酸溶解并定容至25 mL，混合物常溫超聲處理20 min后靜置2 h，用雙層濾紙過濾，濾液以15 000 r/min離心30 min，上清液采用高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)法分析其游離氨基酸組成[29]。

將上清液適當(dāng)稀釋，采用蒽酮硫酸法測其總糖含量，取1 mL上清液與4 mL蒽酮硫酸溶液混合均勻，沸水浴10 min，冷卻至室溫，在620 nm處測其吸光度A620。以蒸餾水為空白，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度計(jì)算發(fā)酵樣品中的總糖含量。

灰分根據(jù)文獻(xiàn)[32]測定。

1.2.8 藻毒素檢測

采用HPLC-MS法測定樣品中的藻毒素[33-34]。準(zhǔn)確稱取研磨粉碎后的發(fā)酵干樣品5.000 g，溶解于10 mL甲醇溶液(80%)，超聲處理30 min后，8 000 r/min離心10 min，收集上清液。殘?jiān)貜?fù)提取2次，合并上清液并過濾。經(jīng)C18固相萃取小柱(1 g，Waters公司)凈化后，收集洗脫液并濃縮至接近干燥，加入1 mL甲醇溶解殘留物，用有機(jī)相微孔濾膜過濾，進(jìn)行HPLC-MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 藍(lán)藻均質(zhì)前后顯微鏡照片

藍(lán)藻含有藻膽素(藻紅素、藻藍(lán)素和別藻藍(lán)素的總稱)及葉綠素a、無葉綠素b。通過顯微鏡觀察藍(lán)藻細(xì)胞在破碎前后形態(tài)結(jié)構(gòu)變化來確定藍(lán)藻細(xì)胞的破碎情況，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：未經(jīng)過高壓均質(zhì)處理過的新鮮藍(lán)藻細(xì)胞形態(tài)完整，呈藍(lán)綠色；經(jīng)過高壓均質(zhì)后的藍(lán)藻細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)被破壞，成為細(xì)胞碎片，同時也說明高壓均質(zhì)機(jī)反復(fù)破碎可以較好地將藍(lán)藻細(xì)胞破碎。

圖1 均質(zhì)處理前后藍(lán)藻泥顯微鏡Fig.1 Microscopic observation of cyanobacteria before and after treatment with homogenization

2.2 藍(lán)藻細(xì)胞破碎前后蛋白質(zhì)的變化

藍(lán)藻細(xì)胞破碎前后可溶性蛋白變化如圖2所示。由圖2可知：當(dāng)TS為1.6%、2.9%和3.6%的藍(lán)藻溶液經(jīng)高壓均質(zhì)處理后，可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分別從1 176.8、1 752.0和2 276.8 mg/L增加到1 750.5、3 219.2和4 121.7 mg/L，對照溶液中含有較高的可溶性蛋白，主要是因?yàn)樗{(lán)藻胞外蛋白質(zhì)以及藍(lán)藻泥在藻水分離時，部分藍(lán)藻受到渦旋離心機(jī)的損傷而釋放的蛋白質(zhì)；而CVU、CVF、CVUF中可溶性蛋白質(zhì)濃度與CV相比，差別不大，說明超聲、冷凍處理對均質(zhì)處理后的藍(lán)藻細(xì)胞破碎影響不大，并不能增加可溶性蛋白的釋放量。

圖2 藍(lán)藻泥釋放的可溶性蛋白的影響Fig.2 Effects of different treatment on soluble protein concentration from cyanobacteria sludge

圖3為不同TS下藍(lán)藻泥的蛋白釋放率。由圖3可知：不同TS藍(lán)藻溶液(1.6%、2.9%、3.6%)經(jīng)高壓均質(zhì)處理后，蛋白質(zhì)釋放率分別從13.1%、12.8%、12.4%增長為19.5%、23.5%、22.4%；TS為1.6%的藍(lán)藻溶液在CV、CVU、CVF和CVUF中的蛋白質(zhì)釋放率緩慢增高，從18%增加到21%，而TS為2.9%和TS為3.6%的藍(lán)藻溶液在CVU、CVF和CVUF中的蛋白質(zhì)釋放率比在CV中的偏低，總體變化不大。盡管藍(lán)藻破碎處理后蛋白釋放率不高，由于此時總蛋白為藍(lán)藻泥溶液中所有含氮有機(jī)物的總和，并非都為可溶性蛋白，因此可以推斷，反復(fù)均質(zhì)能較好地破碎藍(lán)藻細(xì)胞。

圖3 藍(lán)藻泥釋放的蛋白釋放率Fig.3 Effects of different treatment on protein release rate from cyanobacteria sludge

圖4為不同TS的藍(lán)藻上清液在不同破碎處理下的藻膽體的濃度變化。由圖4可知：不同TS的藍(lán)藻溶液在均質(zhì)處理后，在CV中藻膽蛋白質(zhì)量濃度可達(dá)到198.7 mg/L(TS為1.6%)、338.3 mg/L(TS為2.9%)、458.1 mg/L(TS為3.6%)；在CVU、CVF、CVUF中的藻膽體濃度并未增加，反而有微量的減小，說明超聲、冷凍處理并不能增加藍(lán)藻的破碎度，這與上述關(guān)于反復(fù)均質(zhì)能較好地破碎藍(lán)藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)的假設(shè)相同。藍(lán)藻破碎前后，溶液的顏色從綠色變?yōu)樗{(lán)色，TS越高，破碎后藻膽體濃度越高，則顏色越深，在光照下有明顯的偏光性。

圖4 藍(lán)藻泥釋放的藻膽體濃度Fig.4 Effects of different treatment on phycobilisome concentration from cyanobacteria sludge

藻膽蛋白是一類多亞基蛋白質(zhì)，基本結(jié)構(gòu)單元是α和β亞基，亞基的分子量大約為(1.7～2.2)×104，藻紅蛋白分子量為5.0×104[35-36]，均質(zhì)處理前后藍(lán)藻溶液SDS-PAGE電泳分析如圖5所示。由圖5可知：藍(lán)藻細(xì)胞破碎液中的藻藍(lán)蛋白主要集中在2.0×104附近；CV、CVU中的藍(lán)藻蛋白液分子量條帶分布一樣，而CVF中5.0×104附近的顏色變淺，經(jīng)CVUF處理后，大分子蛋白明顯被降解，說明冷凍處理對藍(lán)藻蛋白有一定的降解作用，這與王水晶[37]研究結(jié)果一致。由此可見，超聲、冷凍處理對反復(fù)高壓均質(zhì)處理后的藍(lán)藻泥破碎液中的蛋白質(zhì)釋放并沒有增強(qiáng)作用。

圖5 均質(zhì)處理前后藍(lán)藻溶液SDS-PAGE電泳分析Fig.5 SDS-PAGE electrophoresis analysis of cyanobacterial solution with homogenization treatment

2.3 固態(tài)發(fā)酵過程中組分的變化

早期，蔡健等[38]和譚超等[39]直接利用藍(lán)藻為氮源培養(yǎng)芽孢桿菌，取得了一定的效果。因此，筆者嘗試將藍(lán)藻細(xì)胞破碎液進(jìn)行固液分離后的固體藍(lán)藻渣用于培養(yǎng)芽孢桿菌，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌在用藍(lán)藻渣固體培養(yǎng)基發(fā)酵過程的前12 h為生長延遲期，12～48 h為對數(shù)期，48 h達(dá)到穩(wěn)定期，同時活菌數(shù)達(dá)到最大((3.0～3.6)×1010CFU/g)，但是沒有衰亡期；藍(lán)藻渣固體培養(yǎng)基經(jīng)枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌發(fā)酵后，其含水率從53%分別增加到57.7%和59.9%。同時發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基含水率增加是從發(fā)酵24 h時開始，地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)基明顯要比枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基水分增加得快。

圖6 芽孢桿菌菌落數(shù)和含水率Fig.6 Total numbers of Bacillus colonies and water content

固態(tài)培養(yǎng)基中的粗蛋白及可溶性蛋白的變化如圖7所示。由圖7可知：培養(yǎng)物中的粗蛋白含量明顯增加，直到發(fā)酵結(jié)束，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中的粗蛋白含量分別緩慢增加到222.2和225.3 g/kg，該結(jié)果與Shiu等[40]研究結(jié)果相同，其可溶性蛋白含量變化趨勢則是先減少后增加，尤其在24～36 h時，可溶性蛋白下降最快，36 h后可溶性蛋白明顯增加，且含量趨于穩(wěn)定。這可能是菌種在發(fā)酵前期利用培養(yǎng)基中的可溶性蛋白生長，發(fā)酵后期菌體代謝分泌蛋白。綜合考慮發(fā)酵過程中活菌數(shù)、營養(yǎng)成分變化以及能耗問題，選取72 h為發(fā)酵終止時間。

圖7 芽孢桿菌培養(yǎng)過程的粗蛋白和可溶性蛋白變化Fig.7 Changes of crude protein and soluble protein in culture with Bacillus

2.4 藍(lán)藻渣固態(tài)發(fā)酵前后組成分析

利用芽孢桿菌發(fā)酵處理可改善藍(lán)藻培養(yǎng)基成分及風(fēng)味[41]，考察芽孢桿菌發(fā)酵前后培養(yǎng)基組成，結(jié)果如表1～2所示。

由表1～2可知：利用枯草和地衣芽孢桿菌發(fā)酵藍(lán)藻培養(yǎng)基后，培養(yǎng)基氣味改善，無腥臭味；粗蛋白含量分別增加11.9%和13.5%；發(fā)酵后培養(yǎng)基中游離氨基酸總含量(以100 g蛋白計(jì))達(dá)到804.9、3 127.8 mg，比發(fā)酵前分別增加了154.0%、887.0%；灰分含量也有顯著增加，這與Wu等[42]研究結(jié)果一致。發(fā)酵后培養(yǎng)基中的可溶性蛋白及總糖含量與發(fā)酵前相比，則有明顯的下降，這與芽孢桿菌利用培養(yǎng)基中的碳源、氮源有關(guān)。發(fā)酵后pH同樣發(fā)生了明顯的變化，從6.0升高到7.2左右，這可能與發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)或氨基酸產(chǎn)生有關(guān)，因?yàn)檠挎邨U菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量堿性蛋白酶，蛋白酶水解蛋白質(zhì)會產(chǎn)生氨，導(dǎo)致培養(yǎng)基pH升高[43-44]。另外，芽孢桿菌可以降解藻毒素，在未發(fā)酵培養(yǎng)基中并未檢測到藻毒素，這可能與取藻的時間有關(guān)：一般藍(lán)藻適宜的生長溫度為25～35 ℃，5—9月為其生長期，本次藍(lán)藻樣品則在5月中下旬連續(xù)陰雨天后取的，主要處于生長期，而細(xì)胞在死亡腐爛時才釋放藻毒素。

表1 芽孢桿菌發(fā)酵前后培養(yǎng)基組成

表2 游離氨基酸組成

3 結(jié)論

采用高壓均質(zhì)處理藍(lán)藻泥能釋放出22%左右的可溶性蛋白。藻渣(含水率90%)與麩皮按質(zhì)量比55.5∶44.5混合后可以用于培養(yǎng)芽孢桿菌作為生物菌制劑，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的活菌數(shù)可分別達(dá)到3.12×1010、3.69×1010CFU/g，培養(yǎng)物中藍(lán)藻腥臭味被去除，粗蛋白含量提高約12%。以藍(lán)藻為原料制備生物菌制劑，在未來有望應(yīng)用于土壤改良、環(huán)境治理、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域，為藍(lán)藻泥處置提供新的資源化利用途徑。