陳善斌，邢寒竹，王 然，任發(fā)政，王希璠*

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 北京 100083 2 齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）食品科學(xué)與工程學(xué)院 濟(jì)南 250353 3 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與健康系 北京 100083）

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，抑郁癥患者數(shù)量高達(dá)3.22 億，是全球最大的疾病負(fù)擔(dān)之一[1]。抑郁癥病人不僅遭受精神上的折磨，還伴隨著軀體癥狀，其中就包括胃腸道癥狀。據(jù)報(bào)道，高達(dá)93.5%抑郁病人有胃腸道癥狀，其中42.3%為腹瀉癥狀[2-3]。亞臨床抑郁癥患者腹瀉的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是正常人的2 倍[4]。改善胃腸道癥狀，對(duì)于抑郁癥的治療具有非常重要的意義。

抑郁與腹瀉共病具有其生理基礎(chǔ)。抑郁癥的一個(gè)重要風(fēng)險(xiǎn)因素是應(yīng)激，而應(yīng)激會(huì)影響胃腸道動(dòng)力，增加胃腸道疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。研究表明，應(yīng)激會(huì)刺激腸道細(xì)胞分泌5-羥色胺（5-HT），作用于5-HT3 和5-HT4 受體，導(dǎo)致結(jié)腸蠕動(dòng)加快[7]。5-HT 受體功能異?？赡苁且钟舨∫騕8]。5-HT 受體可能是治療抑郁病人胃腸道癥狀的重要靶點(diǎn)。

益生菌是公認(rèn)的腸道功能調(diào)節(jié)劑，能夠有效緩解腹瀉癥狀。如鼠李糖乳桿菌JB-1 對(duì)應(yīng)激誘導(dǎo)的腹瀉具有緩解作用，可使腸道蠕動(dòng)恢復(fù)到正常水平[9]。然而，益生菌對(duì)抑郁并發(fā)腹瀉的緩解作用仍有待研究。副干酪乳桿菌L9（Lactobacillus paracasei L9，L9） 是一株分離自長(zhǎng)壽老人腸道的益生菌，具有調(diào)節(jié)腸道菌群，調(diào)節(jié)免疫，緩解過(guò)敏反應(yīng)等功能[10-11]，并且L9 可以調(diào)節(jié)腸道蠕動(dòng)[12]。本研究的目的是探究L9 對(duì)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁大鼠腹瀉癥狀的緩解作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Wistar 大鼠，6 周齡，體重180～200 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室恒溫（22±2）℃，恒濕（50%～60%），每12 h 晝夜交替。所有大鼠自由飲水采食。

1.1.2 試驗(yàn)菌株 副干酪乳桿菌L9，保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號(hào)為CGMCC No.9800，菌粉由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)益生菌研究中心提供。

1.1.3 試劑 蔗糖，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胭脂紅、甲基纖維素，阿拉丁試劑（上海）有限公司；TRIzol 試劑，美國(guó)Life Technologies 公司；5×All-In-One RTMasterMix，加拿大Applied Biological Materials 公司；SYBR Premix Ex Taq，日本TaKaRa Biotechnology 公司。

1.1.4 儀器 曠場(chǎng)試驗(yàn)分析系統(tǒng) （含SuperMaze軟件），上海欣軟信息科技有限公司；全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀RT-7200，雷杜生命科學(xué)股份有限公司；LightCycler 96 定量PCR 儀，瑞士羅氏分子系統(tǒng)公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)1 周后，隨機(jī)分為2 組，CMS 組18 只，對(duì)照組9 只。CMS 組大鼠進(jìn)行慢性溫和應(yīng)激（Chronic Mild Stress，CMS）處理5 周，單籠飼養(yǎng)；對(duì)照組分籠飼養(yǎng)，每籠3 只，不做應(yīng)激處理；隨后進(jìn)行糖水偏好試驗(yàn)（Sucrose Preference Test，SPT）、強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)（Forced Swimming Test，F(xiàn)ST）、曠場(chǎng)試驗(yàn)（Open Filed Test，OFT）和排便試驗(yàn)，并采血用于檢測(cè)血常規(guī)。干預(yù)前將CMS 組大鼠隨機(jī)分成CMS-L9 組和CMSNS 組，每組9 只。第6 周開(kāi)始，CMS-L9 組每只大鼠每天灌胃1 mL 1×1010CFU/kg bw L9，CMS-NS組和對(duì)照組每天灌胃等體積生理鹽水，持續(xù)4 周；干預(yù)結(jié)束后進(jìn)行排便試驗(yàn)。每周稱量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重。試驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠用乙醚麻醉，眼內(nèi)眥采血用于檢測(cè)血常規(guī)，頸椎脫臼處死，解剖，取結(jié)腸用生理鹽水沖洗后保存于-80 ℃。

圖1 試驗(yàn)流程Fig.1 Experimental flow graph

1.2.2 慢性溫和應(yīng)激 慢性溫和應(yīng)激操作參考黃春霞[13]的方法。應(yīng)激期間每天施加1～2 種應(yīng)激因子，應(yīng)激因子隨機(jī)選擇，每天施加應(yīng)激因子的時(shí)間不固定。應(yīng)激因子包括夾尾、冷水浴、禁水、晝夜顛倒、禁食、合籠、潮濕墊料、空瓶刺激、熱水浴、噪音、束縛。

1.2.3 糖水偏好試驗(yàn) 糖水偏好試驗(yàn)用于評(píng)價(jià)大鼠抑郁樣行為。首先將所有大鼠單籠單只飼養(yǎng)，每個(gè)籠子放置2 個(gè)外觀一致的飲水瓶，一個(gè)瓶子裝10 g/L 蔗糖水，另一個(gè)瓶子裝飲用水。大鼠預(yù)先適應(yīng)從兩個(gè)瓶子中飲水，適應(yīng)期為24 h，期間每12 h 交換糖水瓶和飲用水瓶的位置。適應(yīng)期結(jié)束后，記錄24 h 內(nèi)糖水和飲用水的飲用量。計(jì)算糖水偏好度，公式如下：

糖水偏好度（%）=糖水飲用量/（糖水飲用量+飲用水飲用量）×100 （1）

1.2.4 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn) FST 參考Slattery 等[14]的方法。FST 在透明的圓桶中進(jìn)行，桶高45 cm，直徑20 cm。桶中裝水至水深30 cm，水溫23～25 ℃。大鼠先練習(xí)在桶中游泳15 min，24 h 后進(jìn)行正式試驗(yàn)。將大鼠置于桶中游泳10 min 并錄像，計(jì)時(shí)不動(dòng)狀態(tài)持續(xù)時(shí)間。不動(dòng)狀態(tài)指漂浮在水中或者四肢輕微劃動(dòng)以保持頭部露出水面。游泳結(jié)束后，將大鼠撈出，擦干后放回原來(lái)的籠子。

1.2.5 曠場(chǎng)試驗(yàn) 曠場(chǎng)試驗(yàn)用于評(píng)價(jià)大鼠的焦慮水平。將大鼠放置在邊長(zhǎng)為1 m 的正方形曠場(chǎng)中央，通過(guò)曠場(chǎng)上方的攝像系統(tǒng)觀察5 min，采用SuperMaze 軟件分析。計(jì)算大鼠在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)域活動(dòng)時(shí)間比例和路程比例，公式如下：

1.2.6 排便試驗(yàn) 收集24 h 的糞便，記錄糞便粒數(shù)，真空冷凍干燥后稱量糞便干重[15]。收集新鮮糞便，進(jìn)行真空冷凍干燥，稱量干燥前后質(zhì)量，計(jì)算水分含量。計(jì)算公式：

用不可吸收的胭脂紅來(lái)測(cè)定全腸傳輸時(shí)間[16]。用5 g/L 甲基纖維素溶液制成質(zhì)量濃度為60 g/L 的胭脂紅懸液，每只大鼠灌胃1 mL，每隔15 min 觀察大鼠的糞便，直到排出紅色糞便。全腸傳輸時(shí)間為從灌胃到排出首粒紅色糞便的時(shí)長(zhǎng)。

1.2.7 血常規(guī)檢測(cè) 采用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀分析血樣中紅細(xì)胞計(jì)數(shù) （RBC）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、血紅蛋白含量（HGB）、紅細(xì)胞比積（HCT）和平均紅細(xì)胞體積（MCV）。

1.2.8 定量PCR 用TRIzol 試劑提取結(jié)腸總RNA。取0.2 μg 總RNA 和2 μL 5×All-In-One RTMasterMix 混合，用ddH2O 水補(bǔ)至10 μL，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序如下：25 ℃孵育10 min，42 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min，85 ℃5 min 滅活反轉(zhuǎn)錄酶。用定量PCR 檢測(cè)mRNA 的表達(dá)量。定量PCR 反應(yīng)體系包括1 μL cDNA，10 μL SYBR Premix Ex Taq，各0.5 μL 上下游引物（10 μmol/L）和8 μL ddH2O，總體積20 μL。定量PCR 反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)行溶解曲線檢測(cè)。引物序列如下：β-actinF：5’-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3’，-actinR：5’-CGTCATCCATGGCGAACTGG-3’，5-HT3F：5’-TAGTGTGCATGGCTCTGCTG-3’，5-HT3R：5’-CAGTGGTTTCCCATGGCTGAG-3’，5-HT4F：5’-TCCACTCATGTGCTAAGGGAT-3’，5-HT4R：5’-GTCATTGTCCTGGGGCCTAC-3’。結(jié)腸mRNA表達(dá)量以β-actin 作為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。用SPSS21.0 的單因素方差分析和Dunnett's 多重檢驗(yàn)比較均值。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CMS 和L9 干預(yù)對(duì)大鼠體重和攝食量的影響

由圖2a 可知，從造模第21 天開(kāi)始，CMS 大鼠體重顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。停止造模后，CMS大鼠體重仍低于對(duì)照組，CMS-L9 組大鼠體重與CMS-NS 組無(wú)差異，且兩組體重仍低于對(duì)照組（圖2b）。造模階段，CMS-L9 組和CMS-NS 組日均攝食量低于對(duì)照組（圖2c）；干預(yù)階段，CMS-L9 組和CMS-NS 組大鼠采食量恢復(fù)到對(duì)照組大鼠水平（圖2d）。

圖2 各組大鼠的體重變化（a 和b）和平均每日攝食量（c 和d）Fig.2 The bodyweight changes （a and b） and mean daily food intakes （c and d） of rats

2.2 CMS 和L9 對(duì)大鼠血常規(guī)的影響

干預(yù)前和干預(yù)后大鼠的血常規(guī)如表1所示。干預(yù)前、后，CMS-L9、CMS-NS 組和對(duì)照組WBC、RBC、HGB、HCT、MCV 無(wú)顯著差異。說(shuō)明CMS 造模和L9 干預(yù)未造成大鼠感染或者貧血等疾病。

表1 CMS 和L9 對(duì)大鼠血常規(guī)的影響Table 1 Effects of CMS and L9 on the hematological parameters of rats

2.3 CMS 對(duì)大鼠抑郁行為的影響

本研究通過(guò)糖水偏好試驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)和曠場(chǎng)試驗(yàn)來(lái)研究大鼠的抑郁程度，結(jié)果如圖3所示。L9 干預(yù)前，CMS-L9 和CMS-NS 組大鼠糖水偏好度均顯著低于對(duì)照組（P＜0.01，圖3a），強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)的不動(dòng)時(shí)間也顯著高于對(duì)照組 （P＜0.05，圖3b）。CMS 組在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)域活動(dòng)路程有低于對(duì)照組的趨勢(shì)（圖3c），在中央?yún)^(qū)域活動(dòng)時(shí)間顯著小于對(duì)照組（P＜0.05，圖3d）。以上結(jié)果說(shuō)明CMS 誘導(dǎo)大鼠表現(xiàn)出抑郁樣行為。

圖3 CMS 對(duì)大鼠行為的影響Fig.3 Effects of CMS on the behaviors of rats

2.4 CMS 和L9 對(duì)大鼠糞便指標(biāo)和全腸傳輸時(shí)間的影響

如表2所示，干預(yù)前，CMS-L9 組和CMS-NS組糞便水分含量均高于對(duì)照組，但無(wú)顯著差異（P值分別為0.079 和0.051）；24 h 排便的粒數(shù)和糞便總干重均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。CMS-L9 組和CMS-NS 組大鼠全腸傳輸時(shí)間顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），腸道蠕動(dòng)加快。以上結(jié)果表明，抑郁大鼠出現(xiàn)腹瀉癥狀。

由表2可知，在對(duì)抑郁大鼠干預(yù)4 周后，CMS-NS 組大鼠糞便水分含量高于對(duì)照（P=0.083），24 h 排便的粒數(shù)和糞便總干重顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），腸傳輸時(shí)間也顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明停止造模后大鼠仍持續(xù)腹瀉癥狀。CMS-L9 組大鼠糞便水分含量低于CMS-NS 組（P=0.085），恢復(fù)至對(duì)照組的水平；排便粒數(shù)和糞便總干重均顯著低于CMS-NS 組（P＜0.05），接近對(duì)照組的正常水平；全腸傳輸時(shí)間顯著高于CMSNS 組（P＜0.05），且與對(duì)照組無(wú)顯著差異。以上結(jié)果表明，L9 干預(yù)可顯著緩解抑郁大鼠的腹瀉癥狀。

表2 CMS 對(duì)大鼠糞便指標(biāo)和全腸傳輸時(shí)間的影響Table 2 Effects of CMS on stool parameters and intestinal transmission function of rats

2.5 CMS 和L9 對(duì)結(jié)腸5-HT 受體mRNA 表達(dá)的影響

如圖4所示，CMS-NS 組和CMS-L9 組大鼠結(jié)腸5-HT3 受體mRNA 表達(dá)水平與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化。CMS-NS 組大鼠結(jié)腸5-HT4 受體mRNA 表達(dá)高于對(duì)照組（P=0.09），而L9 進(jìn)行干預(yù)后，5-HT4 受體mRNA 表達(dá)量顯著降低（P＜0.01），恢復(fù)到正常水平。

圖4 CMS 和L9 對(duì)結(jié)腸5-HT3 和5-HT4 受體mRNA 表達(dá)的影響Fig.4 Effects of CMS and L9 on the mRNA expression of 5-HT3 receptor and 5-HT4 receptor in colons of rats

3 討論與結(jié)論

本文應(yīng)用慢性溫和應(yīng)激（CMS）構(gòu)建抑郁大鼠腹瀉模型，研究了副干酪乳桿菌L9 對(duì)抑郁大鼠腹瀉癥狀的緩解作用。

本研究采用CMS 刺激5 周后，大鼠在強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)、糖水偏好試驗(yàn)和曠場(chǎng)試驗(yàn)中表現(xiàn)抑郁樣行為。CMS 誘導(dǎo)的抑郁大鼠體重增長(zhǎng)減緩，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似[17]，盡管也有文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)激并未導(dǎo)致體重的改變[18]，這可能與應(yīng)激的程度有關(guān)。此外，應(yīng)激過(guò)程中大鼠采食量也有減少，即可解釋體重的變化。應(yīng)激大鼠血常規(guī)與對(duì)照組無(wú)顯著差異，與周天航等[19]的研究結(jié)果一致，表明CMS 未造成大鼠感染和貧血等癥狀。停止應(yīng)激后，CMS 處理大鼠采食量恢復(fù)正常。L9 對(duì)大鼠采食量和血常規(guī)指標(biāo)均沒(méi)有顯著影響，表明L9 干預(yù)大鼠未出現(xiàn)感染或者炎癥等免疫反應(yīng)，這印證了L9 的安全性[20]。

CMS 誘導(dǎo)的抑郁大鼠排便量增加，糞便水分含量升高，全腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間縮短，腸蠕動(dòng)加快，表現(xiàn)出腹瀉癥狀。大量研究發(fā)現(xiàn)慢性或者急性應(yīng)激可導(dǎo)致腹瀉癥狀[21-22]。體外觀察研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激大鼠的結(jié)腸推進(jìn)性收縮速度和頻率加快[23]，這與本文中應(yīng)激誘導(dǎo)抑郁大鼠腹瀉的結(jié)果相符。Lu 等[24]發(fā)現(xiàn)在非應(yīng)激誘導(dǎo)抑郁模型中，大鼠腸道傳輸速度也是加快的。由此可見(jiàn)，應(yīng)激或者非應(yīng)激抑郁實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大都呈現(xiàn)腹瀉癥狀。但是，抑郁病人的腸道健康問(wèn)題更為復(fù)雜，抑郁病人不僅有腹瀉癥狀，也有很高比例病人伴隨便秘癥狀[3]。因此未來(lái)對(duì)抑郁病人腸道健康問(wèn)題的研究還需要進(jìn)一步借助更多樣的動(dòng)物模型來(lái)模擬其復(fù)雜的腸道癥狀。

本文用L9 對(duì)應(yīng)激誘導(dǎo)抑郁的腹瀉癥狀進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明L9 使抑郁腹瀉大鼠排便粒數(shù)、糞便質(zhì)量、糞便水分含量和全腸傳輸時(shí)間恢復(fù)正常，改善腹瀉癥狀。益生菌被報(bào)道能有效緩解一般腹瀉。如鼠李糖乳桿菌LGG 和布拉酵母在多項(xiàng)隨機(jī)雙盲對(duì)照臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)抗生素相關(guān)腹瀉良好的效果[25]；兩歧雙歧桿菌能夠降低嬰兒輪狀病毒相關(guān)腹瀉的發(fā)生率[26]。抑郁相關(guān)腹瀉具有不同于一般腹瀉的特點(diǎn)，它的發(fā)病不僅僅是腸道本身的病變，同時(shí)也涉及到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的改變，二者通過(guò)腸腦軸相關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)益生菌對(duì)于抑郁相關(guān)腹瀉也有良好的效果。這說(shuō)明益生菌可能通過(guò)腸腦軸對(duì)抑郁產(chǎn)生影響。事實(shí)上，已經(jīng)有研究報(bào)道益生菌能緩解病人抑郁癥狀[27]。

本研究中，抑郁大鼠結(jié)腸5-HT4 受體mRNA表達(dá)量顯著升高。腸道5-HT4 受體是調(diào)控腸道蠕動(dòng)的關(guān)鍵。研究表明，5-HT4 受體拮抗劑能夠抑制腸道推進(jìn)運(yùn)動(dòng)[28]，激活5-HT4 受體可以加速腸道的推進(jìn)運(yùn)動(dòng)[29]。這說(shuō)明應(yīng)激激活了大鼠5-HT4 受體，使得5-HT 信號(hào)更易通過(guò)5-HT4 受體傳遞，從而導(dǎo)致了抑郁大鼠腸道蠕動(dòng)過(guò)快，出現(xiàn)腹瀉癥狀。腸道5-HT 受體的表達(dá)受到腸腔內(nèi)微生物的影響。無(wú)菌小鼠的腸道5-HT4 受體表達(dá)量顯著降低，而移植特定菌群可以恢復(fù)5-HT4 受體的表達(dá)[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，L9 可以使抑郁且腹瀉大鼠的腸道5-HT4 受體mRNA 表達(dá)量恢復(fù)到正常水平，使全腸傳輸時(shí)間恢復(fù)到接近正常水平，表明L9 通過(guò)調(diào)節(jié)5-HT4 受體表達(dá)緩解腹瀉癥狀。腸道微生物對(duì)宿主5-HT 受體表達(dá)的影響可能與腸道菌群代謝物有關(guān)[30]。有研究指出，短鏈脂肪酸具有緩解應(yīng)激誘導(dǎo)的腸道蠕動(dòng)異常的作用[9]。L9 被報(bào)道會(huì)增加糞便中乙酸和丙酸的含量[31]，推測(cè)L9 可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群代謝物影響宿主5-HT4 受體的表達(dá)，這還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，副干酪乳桿菌L9 能通過(guò)調(diào)節(jié)宿主5-HT4 受體的表達(dá)有效緩解應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁大鼠的腹瀉癥狀。