鐘明偉, 尹 瑞

(浙江省杭州氫源素生物科技有限公司 研發(fā)部, 浙江 杭州, 310018)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)屬于β屬冠狀病毒，對(duì)紫外線和熱敏感，乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過(guò)氧乙酸和氯仿等均可有效滅活病毒。SARS-CoV-2主要傳播途徑為經(jīng)呼吸道飛沫和接觸傳播，人群普遍易感[1]。SARS-CoV-2和嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV-1)的穩(wěn)定性非常接近，在氣溶膠至少可以存活3 h, 銅表面至少4 h, 硬紙盒表面24 h, 不銹鋼和塑料表面2～3 d[2]。當(dāng)下尚未找到對(duì)SARS-CoV-2有確切療效的抗病毒藥物。SARS-CoV-2感染的預(yù)防仍然需依賴可靠的消毒方法與隔斷措施，其中呼吸道預(yù)防、手消毒和環(huán)境物體表面消毒都屬于特別有效的手段。SARS-CoV-2的消毒措施和方案尚有待于進(jìn)一步探索。本研究選取了復(fù)合季銨鹽消毒液及季銨鹽消毒濕巾作為研究對(duì)象，以期為SARS-CoV-2在環(huán)境物體表面的殺滅與防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究所用復(fù)合季銨鹽消毒液(商品名為寶泰芮?季銨鹽消毒液)由杭州氫源素生物科技有限公司提供，主要有效成分為17.28%烷基芐基氯化銨、12.96% 辛基癸基二甲基氯化銨、5.18%雙辛基二甲基氯化銨和7.78%雙癸基二甲基氯化銨的混合物。以該復(fù)合季銨鹽消毒液制備而成的寶泰芮?衛(wèi)生濕巾(以下簡(jiǎn)稱消毒巾)，其擠出液季銨鹽含量為820 mg/L。

試驗(yàn)病毒株為SARS-CoV-2病毒株; 細(xì)胞系為非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero-E6)。

1.2 方法

1.2.1 病毒懸液制備: 從液氮中取出凍存的Vero E6試驗(yàn)宿主細(xì)胞，在37 ℃溫水中迅速融化，并用細(xì)胞維持液DMEM洗滌2次后，轉(zhuǎn)種于加有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。將Vero-E6作為陰性對(duì)照組。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，在細(xì)胞長(zhǎng)滿單層時(shí)，用于消毒試驗(yàn)。取出低溫凍存的病毒株, 37 ℃解凍，接種于含已經(jīng)長(zhǎng)滿單層細(xì)胞的細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，置37 ℃溫箱中，使與細(xì)胞吸附、生長(zhǎng)。觀察病變，待3/4細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收獲病毒。離心后，將含病毒的上清液分裝于無(wú)菌離心管中，冷凍保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 中和鑒定試驗(yàn): 復(fù)合季銨鹽消毒液采用中和稀釋法，使用1∶500消毒液與中和劑進(jìn)行試驗(yàn)，中和劑為1 g/L硫代硫酸鈉和1 g/L卵磷脂，并參照2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》[3]中的病毒懸液定量法中和劑鑒定試驗(yàn)操作程序。試驗(yàn)重復(fù)3 次，且3 次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果一致。

消毒濕巾采用稀釋法，其擠出液參照EN 14476[4]中的方法進(jìn)行。將0.5 mL牛血清白蛋白(BSA)3 g/L、綿羊紅細(xì)胞(sRBC)3 mL/L 加入至5 ℃的4 mL消毒濕巾擠出液 (100%)中，混合均勻后，載入MicrospinTMS 400 HR柱中，每柱3×0.1 mL。735 g離心分離2 min后，收集洗脫后的樣品。180 μL洗脫樣品與20 μL病毒混懸液混合。然后在低溫稀釋培養(yǎng)基DM中進(jìn)行稀釋，即稀釋10-1～10-3, 冰上培養(yǎng)(30 min±10 s)。每一稀釋液進(jìn)行滴度測(cè)定。

1.2.3 病毒滅活試驗(yàn): 復(fù)合季銨鹽消毒液依照2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》[3]中的病毒滅活試驗(yàn)操作程序。在20 ℃條件下用復(fù)合季銨鹽消毒液按照1∶1 000、1∶500稀釋比例配制的使用濃度為432 mg/L和864 mg/L的消毒液進(jìn)行試驗(yàn)。各濃度對(duì)應(yīng)作用時(shí)間均為1、3、5 min。

消毒濕巾擠出液按照EN 14476[4]中的病毒滅活試驗(yàn)操作程序，將0.5 mL BSA 3 g/L+ sRBC 3 mL/L(有機(jī)干擾物) 和0.5 mL病毒混懸液、4 mL (20±1) ℃恒溫的測(cè)試樣品擠出液(100%)混合60 s后，載入MicrospinTMS 400 HR柱中，每柱12×0.1 mL。735×g離心2 min, 收集洗脫后的樣品進(jìn)行梯度稀釋，即取1 mL樣品加至9 mL低溫培養(yǎng)基中，對(duì)于每一步的稀釋液，在(30 min±10 s)內(nèi)進(jìn)行滴度測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 中和鑒定試驗(yàn)結(jié)果

復(fù)合季銨鹽消毒液的3次中和劑鑒定試驗(yàn)結(jié)果顯示，中和劑1 g/L硫代硫酸鈉和1 g/L卵磷脂可有效中和該復(fù)合季銨鹽消毒液對(duì)試驗(yàn)病毒及其宿主細(xì)胞的殘留作用，且中和劑和中和產(chǎn)物對(duì)病毒和宿主細(xì)胞均無(wú)不良影響。3次中和劑鑒定試驗(yàn)2、3、4各組間誤差率分別為5.6%, 3.5%, 2.2%。見(jiàn)表1。消毒濕巾擠出液的中和鑒定試驗(yàn)結(jié)果顯示，在10-1中和稀釋度時(shí)，可有效停止滅活病毒。

表1 中和劑鑒定試驗(yàn)結(jié)果

2.2 病毒殺滅試驗(yàn)結(jié)果

該復(fù)合季銨鹽消毒液按照1∶1 000、1∶500稀釋，分別與SARS-CoV-2作用1、3、5 min后接種Vero-E6細(xì)胞，結(jié)果顯示該復(fù)合季銨鹽消毒液使用濃度為432 mg/L、864 mg/L時(shí)，上述時(shí)間內(nèi)，均能夠有效殺滅SARS-CoV-2。見(jiàn)表2。

表2 復(fù)合季銨鹽消毒液對(duì)SARS-CoV-2病毒滅活效果

消毒濕巾擠出液與SARS-CoV-2作用1 min后，滅活對(duì)數(shù)值>4.0, 符合《消毒技術(shù)規(guī)范》及EN 14476的要求。見(jiàn)表3。

表3 消毒濕巾對(duì)SARS-CoV-2病毒滅活效果

3 討 論

乙醚、氯仿、含氯消毒劑、過(guò)氧乙酸和75%乙醇雖然均可有效滅活SARS-CoV-2, 但都存在不同程度的安全隱患[5-6]。乙醚和氯仿不屬于消毒產(chǎn)品范疇; 含氯制劑和過(guò)氧乙酸均為強(qiáng)氧化性物質(zhì)，屬高水平消毒劑，對(duì)人體和金屬都具有腐蝕刺激性，不宜用于環(huán)境表面的日常消毒[7]; 75%乙醇屬于易燃易爆品，不適用于大范圍普通物體表面消毒；上述成分都易分解或揮發(fā)，不具備持久抗菌性能。而季銨鹽類消毒產(chǎn)品屬于陽(yáng)離子表面活性劑，常規(guī)采用浸泡、擦拭、沖洗或噴灑方式消毒物體表面，通過(guò)結(jié)合并破壞微生物的脂質(zhì)與蛋白質(zhì)，并改變細(xì)胞的滲透性而達(dá)到殺菌效果。相比于單一成分的季銨鹽, 3種雙長(zhǎng)鏈季銨鹽與1種單長(zhǎng)鏈季銨鹽復(fù)配的復(fù)合型季銨鹽殺菌效果更優(yōu)，抗干擾性更強(qiáng)，毒性較小，價(jià)格也較低，另外由于季銨鹽具有氣味適宜、腐蝕性低、穩(wěn)定性好、不揮發(fā)、使用便捷及持久抗菌等特點(diǎn)，而被推薦用于醫(yī)療機(jī)構(gòu)感染高風(fēng)險(xiǎn)部門的環(huán)境和物體表面的清潔與消毒[8]。研究[9-11]表明，季銨鹽類消毒產(chǎn)品還可有效殺滅耐碳青霉烯類腸桿菌、泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等多重耐藥菌，使用成本低于含氯消毒劑，是用于重污染消毒的最佳消毒劑。

對(duì)于醫(yī)療機(jī)構(gòu)專業(yè)儀器設(shè)備表面消毒而言，研究[12-14]表明，用復(fù)合季銨鹽類消毒濕巾不僅消毒效果可靠、持久抗菌效果佳，且不會(huì)對(duì)精密儀器設(shè)備造成損傷; 而75%乙醇這一傳統(tǒng)消毒劑，其揮發(fā)性較強(qiáng)，造成殺菌效果不穩(wěn)定，且成本較消毒濕巾增加80%以上；頻繁使用含氯消毒制劑進(jìn)行設(shè)備擦拭消毒，易腐蝕機(jī)器外殼，造成儀器設(shè)備磨損、老化，進(jìn)而縮短設(shè)備使用壽命，此外還會(huì)對(duì)操作人員皮膚、黏膜等造成不同程度損傷，導(dǎo)致依從性不高。因此，復(fù)合季銨鹽類消毒濕巾被大量應(yīng)用于不耐腐蝕物體表面長(zhǎng)期擦拭消毒[15]。此外，復(fù)合季銨鹽類消毒濕巾即用即抽，使用便捷，依從性高[16], 開(kāi)啟后30 d仍能保持良好的消毒效果，且成本相對(duì)較低。

綜上所述，復(fù)合季銨鹽消毒液、消毒濕巾在較低濃度下均能高效滅活SARS-CoV-2。在需頻繁進(jìn)行消毒工作的疫情期間，使用復(fù)合季銨鹽消毒液進(jìn)行環(huán)境表面的日常消毒，以及使用復(fù)合季銨鹽類消毒濕巾進(jìn)行局部物體表面的清潔和消毒，如儀器設(shè)備和高頻接觸物體表面的消毒更為合適。本研究為疫情時(shí)期制訂SARS-CoV-2的合理消毒措施和方案提供了一定理論依據(jù)。