晁 棟, 齊 琦, 胡尕偉, 張 斌, 王占鵬, 田華山, 李慶新

(中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院 心胸外科, 甘肅 蘭州, 730050)

離體肺灌注(EVLP)已被證明是對(duì)可能存在排斥反應(yīng)的移植供體肺進(jìn)行再評(píng)估的重要工具，具有很高的應(yīng)用價(jià)值，徹底改變了肺移植面臨的難題[1]。EVLP可作為評(píng)估多種治療干預(yù)修復(fù)受損供體肺效果的重要技術(shù)[2]。雖然EVLP的價(jià)值已經(jīng)在全球得到了廣泛的關(guān)注，但EVLP相關(guān)的副作用卻很少被提及，如EVLP可導(dǎo)致體外循環(huán)與凝血功能障礙，并和炎癥反應(yīng)有關(guān)，均可導(dǎo)致移植器官損傷[3]。EVLP肺移植中支氣管動(dòng)脈循環(huán)中斷，目前研究[4]表明，支氣管動(dòng)脈循環(huán)喪失可能是造成氣道缺氧從而誘發(fā)支氣管閉塞綜合征的重要因素。盡管使用EVLP進(jìn)行器官修復(fù)有利于肺組織脫水、剩余供體血液的去除、肺不張的恢復(fù)，但在EVLP上進(jìn)行肺移植也可能引起一些與手術(shù)相關(guān)的副作用[5]。大量實(shí)驗(yàn)和臨床研究[6-7]表明，氫氣可用于治療急性肺損傷等多種疾病。氫氣表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗炎和抗凋亡特性，并可能作為一種氣體信號(hào)分子起到重要作用。本研究探討離體灌注模型氫氣預(yù)處理對(duì)心臟死亡器官捐獻(xiàn)(DCD)移植供體肺組織的保護(hù)作用，旨在為肺移植過(guò)程中減輕炎癥反應(yīng)、改善代謝水平和保留良好肺功能提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用新西蘭大耳白兔(CBWR/B)18只, 2～4月齡，體質(zhì)量2.0～3.0 kg, 單籠飼養(yǎng)，每個(gè)兔籠均配有飲水和飲食設(shè)施，室溫為20～24 ℃, 相對(duì)濕度為55%～70%, 標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)。雌雄隨機(jī)選用，于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境1 周。所有操作均按照機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理指南進(jìn)行，嚴(yán)格遵守倫理委員會(huì)人道關(guān)懷和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物理事會(huì)指南。

1.2 EVLP模型

麻醉受體動(dòng)物，氣管插管。左或右側(cè)股動(dòng)脈、靜脈套管針穿刺置管，分離左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈、右側(cè)頸靜脈，并分別置管，絲線固定。以新鮮肝素化動(dòng)物血液預(yù)充管道，轉(zhuǎn)機(jī)充分排氣，保存后的心肺組織取出并懸置于恒溫灌注箱內(nèi)。冷缺血時(shí)插氣管，在EVLP系統(tǒng)上應(yīng)用心肺阻滯4 h。EVLP期間，采用空氣(對(duì)照組,n=6)或在37 ℃下補(bǔ)充含2%氫氣的空氣進(jìn)行肺通氣(氫氣組,n=6), 并灌注Steen溶液(XVIVO Perfusion AB, G?teborg, 瑞典)。以目標(biāo)流量10%的平緩速度開(kāi)始灌注，并逐漸增加至整個(gè)目標(biāo)流量(以20%的心輸出量計(jì)算)1 h。連續(xù)監(jiān)測(cè)肺動(dòng)脈壓、氣道峰值壓、氣道流量，分析肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性和肺血管阻力(PVR)。假手術(shù)動(dòng)物(假手術(shù)組,n=6)接受麻醉、氣管切開(kāi)術(shù)和100%氧氣的機(jī)械通氣，并立即取出肺組織進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3 肺功能及生理參數(shù)檢測(cè)

研究氫氣預(yù)處理對(duì)移植肺的影響。EVLP 4 h后，夾住初肺，通過(guò)呼吸機(jī)吸入100%氧氣5 min, 然后從移植物肺靜脈采血，進(jìn)行血?dú)夥治?。比較EVLP灌注空氣通氣和EVLP灌注氫氣通氣的移植體移植后功能指標(biāo)，包括氧合指數(shù)[pa(O2)/FiO2]、PVR和動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性。EVLP期間，每小時(shí)采集灌注液，使用乳酸測(cè)定試劑盒Ⅱ (BioVision, Mountain View, CA)測(cè)量灌注液乳酸水平。

1.4 實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

EVLP 4 h后，通過(guò)SYBR Green 2步法實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)評(píng)估移植肺組織中白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α、血紅素氧合酶(HO)-1、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子(PGC)-1和核呼吸因子-1(NRF-1)和甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的mRNA水平[9]。同樣，測(cè)定再灌注2 h后，移植肺組織中IL-6、IL-1β、TNF-α和GAPDH mRNA水平。

1.5 線粒體酶活性及ATP含量測(cè)定

EVLP 4 h后，使用線粒體分離試劑盒(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)從肺組織中分離線粒體。切碎肺組織，然后加入冷的線粒體分離緩沖液勻漿。線粒體收集后，采用雙喹啉酸法(Pierce Chemical Co.,Rockford, IL)測(cè)定蛋白濃度。提取線粒體蛋白，采用微孔板測(cè)定線粒體復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ (Abcam, Cambridge, MA)的酶活性。使用ENLITEN ATP檢測(cè)系統(tǒng)生物發(fā)光試劑盒(Promega, Madison, WI)測(cè)定 EVLP 4 h后肺組織中的腺苷三磷酸(ATP)含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究結(jié)果采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有數(shù)據(jù)均使用SPSS Version 22統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS Inc., Chicago, IL)進(jìn)行分析。當(dāng)方差分析表明整體效應(yīng)顯著時(shí)，使用Bonferroni事后檢驗(yàn)評(píng)估個(gè)體均值之間的差異，以進(jìn)行多重比較。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EVLP肺移植對(duì)肺功能及生理參數(shù)的影響

EVLP常溫放置肺移植物，氫氣組pa(O2)/FiO2、PVR和動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性在EVLP的4 h內(nèi)基本保持穩(wěn)定, EVLP灌注4 h時(shí), 2組pa(O2)/FiO2、PVR和動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)表1。

表1 2組離體肺灌注后肺功能及生理參數(shù)變化情況比較

2.2 EVLP期間氫氣預(yù)處理對(duì)肺移植炎癥因子的mRNA表達(dá)水平的影響

EVLP期間，氫氣組肺移植物IL-6、IL-1β、TNF-α和HIF-1α的mRNA表達(dá)水平高于假手術(shù)組，但低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)表2。

表2 EVLP期間氫氣預(yù)處理對(duì)肺移植炎癥因子的mRNA表達(dá)水平比較

2.3 EVLP期間氫氣預(yù)處理對(duì)肺移植代謝水平的影響

2組EVLP灌注4 h時(shí)葡萄糖消耗量較1、2、3 h時(shí)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 氫氣組1、2、3、4 h時(shí)葡萄糖消耗量均低于對(duì)照組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); EVLP灌注4 h時(shí)，對(duì)照組乳酸水平較1、2、3 h時(shí)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 氫氣組組1、2、3、4 h時(shí)乳酸水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 氫氣組1、2、3、4 h時(shí)乳酸水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 EVLP期間氫氣預(yù)處理對(duì)肺移植代謝水平的影響

2.4 EVLP期間氫氣預(yù)處理對(duì)肺移植線粒體酶活性及ATP含量的影響

EVLP 4 h后，對(duì)照組、氫氣組肺組織中線粒體復(fù)合物Ⅰ酶活性較假手術(shù)組降低，氫氣組線粒體復(fù)合物Ⅱ、Ⅳ活性和ATP水平較對(duì)照組、假手術(shù)組均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)表4。

表4 EVLP期間氫氣預(yù)處理對(duì)肺移植線粒體酶活性及ATP含量的影響

2.5 EVLP期間氫氣預(yù)處理對(duì)肺移植HO-1、PGC-1α和NRF-1 的mRNA表達(dá)水平的影響

EVLP期間，氫氣組HO-1、PGC-1α和NRF-1的mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組、假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)表5。

表5 EVLP期間氫氣預(yù)處理對(duì)肺移植HO-1、PGC-1α和NRF-1的mRNA表達(dá)水平的影響

3 討 論

研究[8-9]表明, EVLP技術(shù)可改善肺移植預(yù)后，但EVLP可激活肺移植物的炎性反應(yīng)，影響代謝水平[10], 對(duì)肺移植物可能會(huì)產(chǎn)生影響，從而對(duì)移植器官造成重大損傷。研究[11]報(bào)道，IL-10的腺病毒載體應(yīng)用于EVLP能夠改善炎癥反應(yīng)，具有較好的移植效果。然而，載體所引起的相關(guān)炎癥反應(yīng)仍然存在，特別是在移植后免疫缺陷肺的患者中表現(xiàn)得尤為突出。氫氣作為一種醫(yī)療氣體，可以通過(guò)呼吸機(jī)循環(huán)吸入，副作用小，不僅應(yīng)用于肺相關(guān)疾病，也在腎、肝、腦和心臟等疾病中應(yīng)用廣泛[12]。因此，在EVLP中進(jìn)行氫氣預(yù)處理肺移植具有重要價(jià)值。本研究探討EVLP對(duì)肺移植物的不良影響，提出在EVLP過(guò)程中采用氫氣預(yù)處理肺移植物尚存在的問(wèn)題，同時(shí)證明氫氣預(yù)處理有利于保護(hù)肺移植組織。

本研究將濃度為2%的氫氣應(yīng)用于白兔肺移植中，較4%濃度的氫氣安全性更高。研究[13]結(jié)果顯示，吸入氫氣可以降低EVLP中肺移植物的炎癥反應(yīng)，并且這種作用在移植后也持續(xù)存在。HO-1是一種眾所周知的抗氧化關(guān)鍵酶，氫氣增高了肺移植物中HO-1的表達(dá)[14]。 氫誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)和抗炎作用可能是暴露于氫氣中的EVLP肺移植物移植后功能改善的潛在機(jī)制，原因?yàn)閯?dòng)物和人類腎、肝、心和肺移植模型中，缺血再灌注損傷可導(dǎo)致釋放IL-1β、IL-6和TNF-α等物質(zhì)，同時(shí)還會(huì)釋放IL-8、IL-11和干擾素-γ等促炎細(xì)胞因子和趨化因子[15]。更重要的是，肺移植中移植物組織或血液中這些促炎因子水平的升高似乎與嚴(yán)重的原發(fā)性移植物功能障礙等有關(guān)[16]。EVLP患者的肺組織中發(fā)現(xiàn)促炎因子水平升高。研究[17]表明, IL-10基因轉(zhuǎn)染可抑制促炎細(xì)胞因子分泌，成功阻斷EVLP上肺移植物的炎癥過(guò)程，促進(jìn)肺泡-血液屏障恢復(fù)，更好地保留了移植物的功能。HAAM S等[18]研究同樣表明, EVLP過(guò)程中吸入氫氣可保護(hù)肺組織，但研究主要探討氫氣通過(guò)減輕炎癥和細(xì)胞凋亡改善肺功能。本研究發(fā)現(xiàn), EVLP肺移植表現(xiàn)出顯著的促炎變化和代謝譜受損，氫氣預(yù)處理可明顯減輕促炎反應(yīng)，促進(jìn)肺內(nèi)線粒體的生物發(fā)生，進(jìn)而對(duì)肺功能起到較好的保護(hù)作用，為進(jìn)一步了解氫氣處理保護(hù)肺功能的具體機(jī)制提供了另外的證據(jù)。氫氣吸入后能夠激活PGC-1α、NRF-1和HO-1等關(guān)鍵酶的表達(dá)，促進(jìn)線粒體的合成，有助于EVLP中在肺移植物中建立一個(gè)高能系統(tǒng)，加速ATP的產(chǎn)生。氫氣吸入最終導(dǎo)致肺移植組織中HIF-1α表達(dá)降低，從代謝的角度說(shuō)明肺移植質(zhì)量提高，因?yàn)镠IF-1α是O2穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子和組織缺氧的重要標(biāo)記。線粒體功能控制部分由HO-1系統(tǒng)通過(guò)氧化還原調(diào)控的NF-e2相關(guān)因子-2 (Nrf2)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。氫氣可以通過(guò)誘導(dǎo)Nrf2介導(dǎo)的HO-1系統(tǒng)改善高氧肺損傷, Nrf2介導(dǎo)的HO-1系統(tǒng)為氫誘導(dǎo)的線粒體生物合成提供了解釋。

綜上所述, EVLP肺移植表現(xiàn)出顯著的促炎反應(yīng)，并降低了細(xì)胞代謝活性，使用吸入氫氣預(yù)處理肺移植物，可通過(guò)抑制促炎反應(yīng)和增強(qiáng)線粒體生物發(fā)生，降低EVLP相關(guān)的不良反應(yīng)，對(duì)移植肺功能的保護(hù)起到重要的作用。