潘朝旺，戢丹菊

（鄂州職業(yè)大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北鄂州 436099）

膝骨關(guān)節(jié)炎（Knee osteoarthritis，KOA）是關(guān)節(jié)軟骨緩慢地退行性病變，是中老年人常見(jiàn)、多發(fā)的關(guān)節(jié)病，且隨著年齡增大其發(fā)病率也升高[1]。目前KOA 的治療藥物以非甾體抗炎藥及激素為主，因其確切病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚，缺乏針對(duì)性治療藥物。金蕎麥別名苦蕎麥、野南蕎等，有清熱解毒、活血化瘀、健脾利濕的作用，我們?cè)谇捌谘芯恐?，提示金蕎麥能減輕膝骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨損傷[2]。本研究擬通過(guò)觀察金蕎麥提取物對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠血清、軟骨組織、關(guān)節(jié)液白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)的影響，探討其治療膝骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物

金蕎麥提取物（每g 相當(dāng)于原藥材20g），購(gòu)自西安草翠芯生物科技有限公司；壯骨關(guān)節(jié)丸（批號(hào)：20200617），購(gòu)自華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司。

1.2 動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠60 只，雌雄各半，體重200±20g，均購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（湘）2015-0003。

1.3 試劑

IL-1β（批 號(hào)：20201218）、TNF-α（批 號(hào)：20201124）、IL-6（批號(hào)：20201226），ELISA 試劑盒，上海聯(lián)邁生物工程有限公司。

1.4 儀器

9602A 酶標(biāo)儀，南京普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司；Z160M 微量高速離心機(jī)，德國(guó)HERMLE；渡揚(yáng)DOR YANG UV759 掃描型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，渡揚(yáng)精密儀器（上海）有限公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模及分組給藥

隨機(jī)挑選上述大鼠10 只作為正常組，其余50只參照文獻(xiàn)[3]制備骨關(guān)節(jié)炎模型：將實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉后，右后膝關(guān)節(jié)周邊去毛，消毒,分別在第1、4、7 天，屈曲關(guān)節(jié)45°以髕骨下級(jí)髕腱外緣為進(jìn)針點(diǎn)，膝關(guān)節(jié)腔注入4%木瓜蛋白酶溶液0.2mL。造模完成后，將模型動(dòng)物隨機(jī)分為5 組，每組10 只，即模型組、壯骨關(guān)節(jié)丸組、金蕎麥低、中、高劑量組，加上前面的正常組共6 組。最后一次注射木瓜蛋白酶后，給藥，金蕎麥低、中、高劑量組每天灌胃金蕎麥提取物0.14、0.28、0.56g/kg，壯骨關(guān)節(jié)丸組每天灌胃壯骨關(guān)節(jié)丸混懸液1.08g/kg，模型組和正常組每天灌胃生理鹽水5ml，連續(xù)給藥28 天，末次給藥24 小時(shí)后。觀察以下指標(biāo)。

2.2 血清IL-1β、IL-6、TNF-α 檢測(cè)

大鼠經(jīng)水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，取血約8ml，3500 rpm 離心10min，取上清液按試劑盒說(shuō)明采用ELISA 法測(cè)定IL-1β、IL-6 和TNFα 含量。

2.3 關(guān)節(jié)液IL-1β、IL-6、TNF-α 檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[4]，抽取關(guān)節(jié)腔沖洗液，按試劑盒說(shuō)明采用ELISA 法測(cè)定IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量。

2.4 軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α 檢測(cè)

取關(guān)節(jié)軟骨，剪碎，用生理鹽水1:20 勻漿，3500 rpm 離心10min，取上清液，按試劑盒說(shuō)明采用ELISA 法測(cè)定IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用spss21.0 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，用T 檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 各組血清IL-1β、IL-6、TNF-α 比較

表1 可以看出，模型組血清IL-1β、IL-6、TNFα 明顯高于正常組（P<0.01）；金蕎麥各劑量組和壯骨關(guān)節(jié)丸組血清IL-1β、IL-6、TNF-α 明顯低于模型組（P<0.05 或P<0.01）。

表1 各組血清IL-1β、IL-6、TNF-α 比較（，n=10）

表1 各組血清IL-1β、IL-6、TNF-α 比較（，n=10）

注：與模型組比較：* P<0.05，** P<0.01（下同）

3.2 各組關(guān)節(jié)液IL-1β、IL-6 和TNF-α 比較

見(jiàn)表2。與正常組比較，模型組關(guān)節(jié)液IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量明顯升高（P<0.01）；各給藥組關(guān)節(jié)液IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量明顯低于模型組（P<0.05 或P<0.01）。

表2 各組關(guān)節(jié)液IL-1β、IL-6、TNF-α 比較（，n=10）

表2 各組關(guān)節(jié)液IL-1β、IL-6、TNF-α 比較（，n=10）

3.3 各組軟骨組織IL-1β、IL-6 和TNF-α 比較

見(jiàn)表3，同血清和關(guān)節(jié)液一樣，模型組軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α 明顯高于正常組（P<0.01）；各給藥組軟骨組織IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量明顯低于模型組（P<0.05 或P<0.01）。

表3 各組軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α 比較（，n=10）

表3 各組軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α 比較（，n=10）

4 討論

研究表明，KOA 的病理發(fā)展與炎性細(xì)胞因子密切相關(guān)，其中IL-1β、TNF-α 作為炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因素[5]，是KOA 發(fā)病進(jìn)程中的重要介質(zhì)。IL-1β、TNF-α 作為主要蛋白質(zhì)因子參與機(jī)體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)骨代謝，它們互相協(xié)調(diào)，介導(dǎo)關(guān)節(jié)組織的破壞，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)降解,它們?cè)谲浌墙M織含量與破壞嚴(yán)重程度密切相關(guān)[6]。IL-1β 可抑制軟骨細(xì)胞增殖和軟骨組織蛋白多糖合成，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶合成與釋放，刺激軟骨組織一氧化氮和前列腺素E2 合成，從而加快軟骨基質(zhì)降解，加重關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)。研究顯示，誘發(fā)大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎后，大鼠產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，血清、關(guān)節(jié)液和軟骨組織IL-1β、TNF-α 含量明顯高于正常組，金蕎麥各劑量組均能明顯降低大鼠以上炎性因子（表1、2、3）。

IL-6 是活化的T 細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子，是一種功能廣泛的多效性細(xì)胞因子。急性炎癥反應(yīng)過(guò)程中IL-6 會(huì)快速生成，在KOA 病理發(fā)展過(guò)程中，IL-6 可增加滑膜組織的炎性反應(yīng)，促進(jìn)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，加重局部組織炎性水腫，破骨樣細(xì)胞的形成加快，軟骨的降解破壞加速。此外，IL-6 還通過(guò)自分泌形式作用于軟骨細(xì)胞，進(jìn)而影響軟骨細(xì)胞正常增殖。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6 含量在KOA 患者血清中均高于健康人[7]。IL-6 表達(dá)水平在早期KOA 患者血清中明顯升高，并且與病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[8]。本研究結(jié)果顯示，IL-6 表達(dá)在模型大鼠體內(nèi)明顯高于模型組，與前述研究基本一致。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明，金蕎麥各劑量組均能明顯降低大鼠血清、軟骨組織、關(guān)節(jié)液IL-6（表1、2、3）。

綜上，金蕎麥提取物可降低血清、關(guān)節(jié)液和軟骨組織IL-1β、TNF-α 和IL-6 含量，為其用于治療膝骨關(guān)節(jié)炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。