伍德洋，張?jiān)賱?，彭文勇，?凡，鄭福端，廖 萍，陳 強(qiáng)，趙 珂

(1.四川省煙草公司涼山州公司鹽源分公司，四川 西昌 615200；2.四川省煙草公司涼山州公司會(huì)東分公司，四川 西昌 615200；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，成都 611130)

四川省是我國3大煙葉生產(chǎn)基地之一，四川烤煙生產(chǎn)主要分布在涼山、攀枝花、瀘州、宜賓和廣元五大煙區(qū)。其中，涼山州煙區(qū)地處川西南橫斷山系東北緣，具備得天獨(dú)厚的自然條件，生產(chǎn)的煙葉氣味清香獨(dú)特，2017年涼山州種植煙葉6.25萬hm2，是中式卷煙的重要原料供應(yīng)地，因此穩(wěn)定和提高烤煙質(zhì)量是涼山煙區(qū)的主要任務(wù)[1]。施肥是提高煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量的重要措施，而一味追求高經(jīng)濟(jì)效益和產(chǎn)量，不合理使用化肥，且過量施肥會(huì)導(dǎo)致煙葉貪青晚熟，較難把握烘烤環(huán)節(jié)，容易生產(chǎn)出失去經(jīng)濟(jì)價(jià)值的劣等煙，有效產(chǎn)量不高以及對(duì)壤質(zhì)量和環(huán)境造成難以恢復(fù)的破壞[2]。

以微生物菌劑為代表的微生物肥料是實(shí)現(xiàn)“減肥減藥”“化肥零增長(zhǎng)”“農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展”和“生態(tài)農(nóng)業(yè)”不可或缺的一類低能耗、環(huán)境友好型肥料，而優(yōu)良的菌種資源是研發(fā)微生物菌劑的重要來源[3-4]。放線菌是一類數(shù)量大、種類多、具有重要實(shí)用價(jià)值和開發(fā)潛力的微生物資源。放線菌通過產(chǎn)生抗生素、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素等機(jī)制促進(jìn)植物生長(zhǎng)，通過產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、蛋白酶、磷酸酶等活性酶提高植物的抗逆性，是篩選功能微生物菌劑的一個(gè)重要來源[5-6]。近年來，已報(bào)道與煙草有關(guān)的促生菌主要是芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單孢菌屬(Pseudomonas)、腸桿菌屬(Enterobacter)等[7-9]；但關(guān)于放線菌促進(jìn)煙草生長(zhǎng)方面的研究鮮有報(bào)道。因此，基于本實(shí)驗(yàn)室前期從篩選獲得的具有產(chǎn)IAA、溶磷、產(chǎn)鐵載體以及抑菌功能的放線菌帚狀鏈霉菌(Streptomycesscopiformis)CL21和加利福尼亞鏈霉菌(Streptomycescalifornicus)CL52為研究對(duì)象，并充分考慮兩株菌的互作作用，通過盆栽實(shí)驗(yàn)研究這兩株促生菌對(duì)煙草生長(zhǎng)的作用及其對(duì)煙草根際土壤營養(yǎng)和微生物數(shù)量的影響，為植煙區(qū)煙草生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展提供優(yōu)良的促生菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)和材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地 試驗(yàn)于2019年3～5月在涼山州煙草公司會(huì)東縣分公司的育苗基地進(jìn)行，采用盆栽的方式種植。

1.1.2 供試土壤 盆栽土壤采自會(huì)東縣參魚河鎮(zhèn)植煙大田0～20cm土壤，陰干滅菌后過2mm篩網(wǎng)，按7.5kg/盆裝入口徑為30cm的花盆中。

1.1.3 供試菌株 帚狀鏈霉菌(Streptomycesscopiformis)CL21，加利福尼亞鏈霉菌(Streptomycescalifornicus)CL52。

1.1.4 供試煙草材料 云煙85。

1.1.5 儀器設(shè)備 采用CIRAS-1型光合作用測(cè)定系統(tǒng)(英國PP-System公司)測(cè)定葉片的光合作用參數(shù)；采用EPSON1680根系掃描儀(Epson，LongBeach，USA)掃描根系進(jìn)行掃描和分析。

1.2 方法

1.2.1 促生菌菌劑的制備 在三角瓶中裝入1/3量的麥粒于121℃滅菌30min冷卻至室溫。將供試菌株CL21、CL52在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上活化，待菌株長(zhǎng)滿斜面后，加入無菌水洗下孢子，再轉(zhuǎn)入裝有麥粒的三角瓶中與麥粒充分混勻，于28℃培養(yǎng)1周以上，待麥粒長(zhǎng)滿白色的孢子后備用。

1.2.2 接菌與培養(yǎng) 煙草采用漂浮盤方法進(jìn)行育苗，待長(zhǎng)出3～5片真葉后移栽到花盆中，每個(gè)花盆中栽1株。按照不同處理給煙草灌根，3個(gè)處理加1個(gè)對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)(表1)。

1.2.3 樣品采集 待煙草生長(zhǎng)至旺長(zhǎng)期(50～60d)，鏟去1cm表層土，小心將煙草植株拔出，收集根際土和非根際土，洗凈植物，備用。

1.2.4 煙草農(nóng)藝性狀測(cè)定 在煙草旺長(zhǎng)期測(cè)定包括煙株株高、莖圍、有效葉片數(shù)、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬、植株地上地下部的鮮重和干重等數(shù)據(jù)。

1.2.5 煙草光合作用 待煙草長(zhǎng)至旺長(zhǎng)期，參照肖雨等人[10]的方法采測(cè)定煙葉的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、細(xì)胞間隙CO2濃度(Ci)等指標(biāo)。

1.2.6 煙草根系形態(tài)研究 參加李靜等人的方法對(duì)各組樣品的根系總長(zhǎng)度、總根表面積、總根體積和總根毛數(shù)等形態(tài)指標(biāo)[11]。

1.2.7 煙草及其土壤養(yǎng)分含量測(cè)定 參考鮑士旦等人[12]方法測(cè)定測(cè)定煙草全氮、全磷、全鉀，土壤全氮、全磷、全鉀，速效氮、速效磷、速效鉀含量以及有機(jī)質(zhì)含量。

1.2.8 煙草及土壤微生物數(shù)量測(cè)定 參考沈萍等人[13]方法分離煙草根、莖、葉以及根際和非根際土壤中的細(xì)菌、放線菌和真菌，并測(cè)定各類菌的數(shù)量。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 Excel采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析和LSD法多重比較。

2 結(jié)果

2.1 接種菌株對(duì)煙草全氮、全磷、全鉀含量的影響

盆栽實(shí)驗(yàn)表明，接種菌劑后對(duì)煙草根、莖、葉中全氮、全磷和全鉀的具有較大影響?；旌暇鷦〤L21+CL52處理后的煙草根、莖、葉中的全氮的含量顯著高于單菌處理，且均遠(yuǎn)高于對(duì)照組，但單菌CL21和CL52處理之間，以及單菌處理與對(duì)照組全氮含量差異都不明顯。煙草全鉀、全磷的分析結(jié)果表明，經(jīng)過接種菌劑處理后，煙草的根、莖、葉中全鉀和全磷含量均高于對(duì)照組，混合菌劑CL21+CL52處理的效果明顯高于單菌處理，煙草經(jīng)CL21+CL52處理煙莖中的全磷含量經(jīng)提高了1.6%，煙葉的全鉀含量提高了1.5%。結(jié)果表明，促生菌CL21和CL52能提高煙草植株內(nèi)全氮、全磷、全鉀的含量，且混合菌劑CL21+CL52效果更佳。

2.2 促生菌對(duì)煙草根際土與非根際土養(yǎng)分含量影響

通過對(duì)接種單菌CL21、CL52、混合菌劑CL21+CL52以及不接種促生菌劑煙草根際土與非根際土壤理化成分的分析發(fā)現(xiàn)，接種促生菌劑后的煙草根際土壤與對(duì)照組之間存在顯著性差異(P<0.05)。接種菌劑后根際土壤分析結(jié)果表明，除單菌CL52處理根際土中有效鉀較CK組低外，煙草根際土壤壤中的堿解氮、速效鉀、有效磷和有機(jī)質(zhì)在接種促生菌劑后均有顯著增加，表現(xiàn)為混菌CL21+CL52>單菌CL52>單菌CL21>CK；接種菌劑后非根際土壤分析結(jié)果表明，混菌CL21+CL52處理后土壤中的堿解氮、速效鉀、有效磷和有機(jī)質(zhì)顯著高于單菌CL21、CL52處理以及對(duì)照組處理，單菌處理與對(duì)照組無明顯差異，其中單菌處理的有效鉀和有機(jī)質(zhì)還顯著低于對(duì)照組(表2)。

表2 促生菌對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

2.3 促生菌對(duì)煙草生長(zhǎng)的影響

盆栽結(jié)果表明，接種菌劑后能較好的促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)。煙草生長(zhǎng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，混菌CL21+CL52處理在煙草株高、最大莖圍、最大葉長(zhǎng)和最大葉寬均優(yōu)于其它處理，較對(duì)照組分別增加35.5%，28.5%，25.5%，15.2%，較單菌CL21處理分別增加了25.8%，11.4%，12.5%，4.5%，較單菌CL52處理分別增加了29.1%10.3%7.1%3.2%，單菌CL21和CL52處理優(yōu)于對(duì)照組。

煙草地上和地下2個(gè)部分的鮮重和干重也均是混菌CL21+CL52處理效果最佳，較對(duì)照組煙草鮮重和干重分別增加了47.2%，27.6%，45.7%，21.8%。除單菌CL52地下部的鮮重和干重低于對(duì)照組外，單菌處理組均能促進(jìn)煙草地下部分的生長(zhǎng)。煙草有效葉片數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，各處理組煙草有效葉片數(shù)CL21+CL52(17片)>CL21(13片)>CL52(12片)>CK(10片)。

2.4 煙草光合作用分析

對(duì)煙草凈光合速率的測(cè)定結(jié)果表明，各處理的凈光合速率為CL21+CL52(10.58)>CL52(9.88)>CL21(9.67)>CK(8.99)，混菌CL21+CL52處理下煙草葉片凈光合速率最大，表明其光能利用率最高；單菌處理凈光合速率均大于對(duì)照組，表明接種促生菌劑能有效提高煙草葉片的光能利用率(表3)。

經(jīng)測(cè)定，煙草的氣孔導(dǎo)度為混合菌劑CL21+CL52(1.12)>CL21(0.85)>CL52(0.58)>CK(0.50)，混菌處理CL21+CL52組處理的氣孔導(dǎo)度最大，而對(duì)照組處理的氣孔導(dǎo)度最小，說明該組處理下的煙草葉片生理活性最強(qiáng)(表3)。

對(duì)各處理煙草胞間CO2濃度和蒸騰速率的分析結(jié)果表明，胞間CO2濃度為CL21+CL52(372.56)>CL21(353.45)>CL52(342.65)>CK(332.32)；單菌CL21和CL52的蒸騰速率無差異，混菌CL21+CL52蒸騰速率明顯高于其它處理，進(jìn)一步表明促生菌CL21和CL52能提高煙草的生理活性強(qiáng)度和光能利用率，促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)(表3)。

表3 煙草光合作用測(cè)定結(jié)果

2.5 煙草根系形態(tài)研究

各處理煙草旺長(zhǎng)期的根系形態(tài)經(jīng)過根系掃描結(jié)果表明，顯示樣品間存在顯著性差異(P<0.05)，接菌劑處理的各項(xiàng)指標(biāo)均大于對(duì)照組，且CL21+CL52處理下根的總根長(zhǎng)、總表面積、平均直徑、總體積和總根毛數(shù)均最大，分別為9678.12cm，1296.76cm2、1.99mm、14.98cm3、13867.67個(gè)(表4)。

表4 煙草根系形態(tài)特征

2.6 促生菌對(duì)煙草及土壤中微生物數(shù)量的影響

本研究對(duì)接種菌劑后煙草的根、莖及其根標(biāo)土壤、非根際土壤中的微生物數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。結(jié)果表明，接種菌劑影響了煙草和土壤中三大微生物的數(shù)量分布，接種混菌CL21+CL52對(duì)煙草根、莖、葉中細(xì)菌數(shù)量影響最大，對(duì)土壤中細(xì)菌的數(shù)量影響不明顯；接種混菌CL21+CL52后煙草根中放線菌的數(shù)量明顯高于單菌處理和對(duì)照組，而接種單菌CL52對(duì)煙草莖中放線菌的數(shù)量影響較大，但接種菌劑對(duì)煙草葉及其根際和非根際中放線菌數(shù)量無明顯影響，；煙草根中真菌數(shù)量受菌劑CL52的影響較大，莖和葉中真菌數(shù)量在接種菌劑后無明顯變化，但接種混菌CL52+CL21增加了根際和非際土壤真菌數(shù)量(表5)。

表5 促生菌對(duì)煙草各部位及其土壤微生物數(shù)量的影響

3 討論

氮、磷、鉀是植物生長(zhǎng)所必需的營養(yǎng)元素，植物的光合作用和體內(nèi)的生化過程都必須有它們的參與，植物中全氮、磷、鉀的含量可以揭示植物的營養(yǎng)狀態(tài)，以及吸收利用氮、磷、鉀的能力[13-14]。煙草全氮、磷、鉀測(cè)定結(jié)果表明，接種菌劑CL21、CL52、CL21+CL52后顯著增加了的煙草中的全氮、磷、鉀的含量，其中接種混合菌劑CL21+CL52表現(xiàn)出的效果最佳。煙草根際土與非根際土中堿解氮、速效鉀、有效磷和有機(jī)質(zhì)含量測(cè)定值表明接種菌劑的各處理均優(yōu)于對(duì)照處理，這可能是促生菌株CL21、CL52分離自植物內(nèi)部，能很好的在植物體內(nèi)定殖并通過其生長(zhǎng)繁殖、產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物提升煙草活力，增加其對(duì)各營養(yǎng)元素的吸收，同時(shí)通過刺激根系分泌物的產(chǎn)生增加了根際土和非根際土中氮、磷、鉀及有機(jī)質(zhì)的含量。本研究結(jié)果表明接種促生菌CL21和CL52能夠提高植煙土壤氮、磷、鉀、有機(jī)質(zhì)含量以及提升煙草對(duì)氮、磷、鉀的吸收利用水平，有利改善土壤肥力狀況，為煙草的正常生長(zhǎng)發(fā)育營造良好的土壤環(huán)境[15-16]。

接種促生菌劑后煙草植株的株高、最大莖圍、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬、干重、鮮重、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速率均增加，根株的總根長(zhǎng)、總表面積、平均直徑、總根體積、總根毛數(shù)較其它處理有顯著性差異，說明接種促生菌后能夠調(diào)節(jié)煙草氣孔導(dǎo)度，提高胞間CO2濃度、蒸騰速率與凈光合速率，促進(jìn)根系生長(zhǎng)，從而提高煙草的生物量。值得注意的是，相較于單株處理繃帶，混菌CL21+CL52處理對(duì)煙草營養(yǎng)的吸收、煙草生物量以及根際土壤肥力水平的提升更為有效。已有的研究表明，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，相較于單一菌株，采用多種優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行混合后接種到植株上，具有更好的接種效益[17]，這是因?yàn)槎喾N混合菌之間通過協(xié)同作用，能完成一些單一菌株無法完成的較為復(fù)雜的生理生化反應(yīng)[18-19]。

此外，煙草及其根際土和非根際土中微生物數(shù)量測(cè)定的結(jié)果顯示，接種促生菌CL21、CL52后增加了煙草的根、莖、葉和根際土中細(xì)菌數(shù)量增加，非根際土的細(xì)菌數(shù)量減少；煙草的根、莖、葉、根際土和非根際土中放線菌的數(shù)量增加；煙草根、莖、根際土和非根際土的真菌增加，煙草葉中真菌數(shù)量減少，說明放線菌能夠豐富煙草及其根際土中微生物的群落結(jié)構(gòu)，非根際土中的細(xì)菌和煙草葉中真菌數(shù)量減少的原因可能是放線菌對(duì)其應(yīng)菌群有競(jìng)爭(zhēng)作用，而根灌的菌株在數(shù)量上占有優(yōu)勢(shì)從而導(dǎo)致相應(yīng)環(huán)境中細(xì)菌和真菌數(shù)量的減少，表明接種促生菌后對(duì)煙株根際土壤的微生物區(qū)系產(chǎn)生了影響，這種變化可對(duì)提高煙株根際土壤的生態(tài)功能有積極作用[20]。

4 結(jié)論

促生菌CL21、CL52通過活化土壤營養(yǎng)元素，提高煙草營養(yǎng)元素吸收水平，促進(jìn)根系生長(zhǎng)、提高煙草光合效率，改變煙草內(nèi)部及其土壤中微生物群落的方式促進(jìn)煙草生長(zhǎng)，為煙草專用微生物菌劑的研發(fā)提供了優(yōu)良菌株資源。