劉昊，王倩，徐惠敏，賀佳琪，李?lèi)?ài)，高英，通信作者

鹽脅迫對(duì)小果黑核桃幼苗外部形態(tài)和生理變化的影響

劉昊1，王倩2，徐惠敏3，賀佳琪2，李?lèi)?ài)2，高英2，通信作者

（1. 天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹(shù)研究所，天津 300384；2. 天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300392；3. 河南省洛寧縣林業(yè)局，河南 洛寧 471700）

為了解核桃砧木耐鹽性以便為耐鹽核桃砧木的篩選提供依據(jù)，以小果黑核桃幼苗為試材，采用NaCl溶液對(duì)其進(jìn)行鹽脅迫處理，觀察幼苗受脅迫后的生長(zhǎng)狀況，并測(cè)定核桃幼苗處理后不同天數(shù)的相關(guān)生理指標(biāo)。結(jié)果表明：核桃幼苗受鹽害后，葉片失水萎蔫，葉片變黃；植株在高濃度長(zhǎng)時(shí)間鹽脅迫下葉片變黑直至植株死亡。隨著鹽濃度的升高和脅迫時(shí)間的增加，POD和SOD活性先升高后降低、游離脯氨酸大量積累、可溶性蛋白含量變化趨勢(shì)為先增加后減少。研究認(rèn)為小果黑核桃在100 mmol/L NaCl脅迫時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性。

小果黑核桃；鹽脅迫；抗氧化酶；滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)

核桃是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種之一，在全國(guó)二十幾個(gè)省市均有栽培[1-2]。然而，土壤鹽堿化在一定程度上限制了核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。土壤鹽漬化一直以來(lái)都是困擾世界農(nóng)林經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大生態(tài)問(wèn)題。鹽漬土分布廣泛，在我國(guó)西部六省、東北三省以及沿海各省地勢(shì)較低的地區(qū)都是鹽漬土集中分布的區(qū)域[3-4]。當(dāng)土壤鹽濃度超過(guò)0.3%時(shí)，大部分植物受鹽害脅迫不能正常生長(zhǎng)。目前植物耐鹽資源可以通過(guò)測(cè)定鹽脅迫下植物外部形態(tài)特 征[5-7]、抗氧化酶活性[5，8-11]和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[6-9]的變化等方面進(jìn)行篩選。了解核桃的耐鹽性，篩選核桃耐鹽砧木，對(duì)核桃在鹽堿地區(qū)的發(fā)展具有重要意義。小果黑核桃（L.）是黑核桃中的一種，為小喬木，可做核桃的矮化砧木，原產(chǎn)于美國(guó)西南部土壤輕度鹽漬化地區(qū)。1984年奚聲珂先生等將其引入我國(guó)，在河南、內(nèi)蒙古等地區(qū)均有栽培[12-13]。目前關(guān)于小果黑核桃耐鹽性方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過(guò)研究鹽脅迫下小果黑核桃幼苗的形態(tài)變化、抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化，以探討小果黑核桃對(duì)鹽分的耐受能力，為解決高鹽濃度下核桃的生長(zhǎng)發(fā)育問(wèn)題、提高土地生產(chǎn)力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以長(zhǎng)勢(shì)一致的小果黑核桃（）當(dāng)年生實(shí)生苗為試驗(yàn)材料，采用盆栽的方式進(jìn)行栽培管理，栽培基質(zhì)為草炭∶蛭石∶珍珠巖＝2∶1∶1。

1.2 鹽脅迫處理

試驗(yàn)于2018年在避雨設(shè)施中進(jìn)行，將種子播種于相同規(guī)格的容器中。將小果黑核桃幼苗隨機(jī)分為4組（CK、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每組9株幼苗。當(dāng)植株生長(zhǎng)到60～70 cm時(shí)，以不同濃度的NaCl溶液做鹽脅迫處理，鹽溶液濃度設(shè)為0（CK）、100（Ⅰ）、300（Ⅱ）、500 mmol/L（Ⅲ）。當(dāng)盆土干燥后，每盆澆2 L相應(yīng)濃度鹽溶液，保持溶液不外滲。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 外部形態(tài)特征的觀察

觀察各處理小果黑核桃幼苗在處理后0、2、4、8 d的形態(tài)變化，并進(jìn)行拍照記錄。

1.3.2 生理指標(biāo)的測(cè)定及方法

在處理后0、2、4、8 d分別進(jìn)行取樣。采取各處理植株的功能葉于超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚顯色法；超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定采用SOD抑制氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法；脯氨酸含量測(cè)定采用磺基水楊酸法；可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010和SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)小果黑核桃幼苗外部形態(tài)特征的影響

鹽脅迫處理后小果黑核桃幼苗外部形態(tài)變化如表1所示。從表1可以看出，500 mmol/L鹽脅迫處理下，第2天葉片失水萎蔫，并沿葉邊緣出現(xiàn)少量水漬狀黑邊；隨脅迫時(shí)間增加而加重，至第8天，植株干枯死亡。300 mmol/L鹽濃度處理下，第2天植株葉片出現(xiàn)萎蔫癥狀；并逐漸表現(xiàn)受害面積增加和程度加重，直至葉片變黑。而100 mmol/L鹽脅迫處理下，植株第6天才開(kāi)始出現(xiàn)輕微老葉黃化現(xiàn)象，直到第8天仍表現(xiàn)為部分老葉黃化程度加重，上部功能葉片正常，說(shuō)明其對(duì)100 mmol/L鹽脅迫具有較強(qiáng)的耐受性。

表1 鹽脅迫下核桃幼苗外部形態(tài)變化

2.2 鹽脅迫對(duì)小果黑核桃幼苗保護(hù)酶活性的影響

2.2.1 鹽脅迫對(duì)小果黑核桃幼苗POD活性的影響

圖1為不同濃度NaCl脅迫對(duì)POD活性的影響。由圖1可知，在同一脅迫時(shí)間下，不同鹽濃度的脅迫處理，POD活性存在差異性。處理后第2天，100、300 mmol/L鹽脅迫處理下POD活性明顯升高，各鹽脅迫處理間POD活性差異不顯著。隨處理時(shí)間的增加，高鹽脅迫下（300和500 mmol/L）POD活性明顯下降，而100 mmol/L鹽脅迫處理POD活性變化不明顯，并且與CK無(wú)顯著性差異。在相同的鹽脅迫水平下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，POD活性呈先升高后降低的趨勢(shì)。300 和500 mmol/L鹽處理下，POD活性變化明顯，尤其500 mmol/L鹽處理第4天時(shí)POD活性顯著下降。而100 mmol/L鹽濃度下，處理后2～8 d POD活性顯著高于0 d，并保持較高水平。

注：圖中字母表示＜0.05水平的差異顯著性。下同

2.2.2鹽脅迫對(duì)小果黑核桃幼苗SOD活性影響

圖2為不同濃度NaCl脅迫對(duì)SOD活性的影響。由圖2可知，在同一脅迫時(shí)間下，不同濃度鹽脅迫處理SOD活性變化存在差異。處理后第2天和第4天，隨鹽濃度增大，SOD活性先升高后降低，在100 mmol/L鹽濃度下最高，且第4天時(shí)顯著高于其他鹽處理。500 mmol/L鹽脅迫處理與CK的SOD活性無(wú)顯著差異。進(jìn)入第8天后，100、300 mmol/L鹽脅迫處理的SOD活性下降，與CK無(wú)顯著性差異。在同一鹽脅迫水平下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，100和300 mmol/L鹽脅迫下，SOD活性呈明顯的單峰曲線(xiàn)變化。在第2天和第4天時(shí)顯著增高，差異性顯著。隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)SOD活性明顯降低，說(shuō)明低濃度長(zhǎng)時(shí)間脅迫也會(huì)對(duì)植物造成傷害。

2.3 鹽脅迫對(duì)小果黑核桃幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.3.1 鹽脅迫對(duì)小果黑核桃幼苗脯氨酸含量影響

圖3為不同濃度NaCl脅迫對(duì)脯氨酸含量的影響。由圖3可知，在同一脅迫時(shí)間下，隨著鹽濃度的提高，脯氨酸含量呈顯著增加的趨勢(shì)。處理前各組脯氨酸含量差異不顯著。處理后第2天，脯氨酸含量增加，各個(gè)處理間呈現(xiàn)差異顯著性。處理后第4天和第8天，各組脯氨酸含量都呈極顯著升高。在同一鹽脅迫水平下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，脯氨酸含量均極顯著升高。其中，500 mmol/L鹽脅迫下升高程度最大，300 mmol/L鹽脅迫下升高程度次之，100 mmol/L鹽脅迫下升高程度最小，說(shuō)明100 mmol/L 鹽脅迫對(duì)小果黑核桃的影響最小。

2.3.2 鹽脅迫對(duì)小果黑核桃幼苗可溶性蛋白含量的影響

圖4為不同濃度NaCl脅迫對(duì)可溶性蛋白含量的影響。由圖4可知，在相同脅迫時(shí)間下，處理前各組可溶性蛋白含量差異不顯著。處理后第2天，可溶性蛋白含量呈先升高后降低，各個(gè)處理間存在顯著性差異。100 mmol/L鹽脅迫下可溶性蛋白含量最高。處理后第4天，隨鹽濃度的提高，可溶性蛋白含量呈降低趨勢(shì)。100 mmol/L鹽脅迫下可溶性蛋白含量與CK差異不顯著，且含量最高。其余各處理可溶性蛋白含量顯著降低，500 mmol/L鹽脅迫處理可溶性蛋白含量最低。處理后第8天，各組核桃幼苗可溶性蛋白含量仍呈顯著降低的趨勢(shì)。100 mmol/L鹽脅迫處理下可溶性蛋白含量明顯高于其他鹽處理。當(dāng)鹽溶液濃度相同時(shí)，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，可溶性蛋白含量總體呈先升高后降低的趨勢(shì)。各個(gè)處理的可溶性蛋白含量峰值都出現(xiàn)在鹽脅迫后的第2天，隨后顯著下降。

3 討論與結(jié)論

植株的形態(tài)特征可以直觀地反映鹽脅迫對(duì)植物的影響，是植物耐鹽性的重要指標(biāo)[5，15]。本研究表明，300、500 mmol/L鹽濃度下小果黑核桃幼苗葉片在處理后第2天時(shí)就出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，可能是由于土壤的水勢(shì)低于細(xì)胞水勢(shì)，植物根系吸水困難，細(xì)胞滲透勢(shì)降低，故葉片表現(xiàn)出失水萎蔫癥狀，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，植株受害程度加重，高鹽濃度下小果黑核桃幼苗葉片出現(xiàn)變黑，直至干枯死亡。而100 mmol/L鹽濃度下小果黑核桃幼苗葉片第6天時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)少量發(fā)黃，隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)植株下部老葉黃化有所增加，而上部功能葉片仍表現(xiàn)正常，說(shuō)明小果黑核桃幼苗能耐受100 mmol/L NaCl脅迫，超過(guò)則植物結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，無(wú)法恢復(fù)。

POD、SOD同為植物體自由基清除劑，對(duì)維持植物體內(nèi)代謝平衡起著調(diào)節(jié)和保護(hù)作用[16-18]。植物在鹽脅迫下大量產(chǎn)生過(guò)氧化物和負(fù)氧離子，破壞植物細(xì)胞膜透性，POD、SOD能有效緩解高鹽環(huán)境對(duì)細(xì)胞膜的傷害，維持細(xì)胞正常的生理代謝功能[19-20]。本試驗(yàn)表明：脅迫初期，隨鹽濃度的增加，POD活性先升高后降低；脅迫后期，隨鹽濃度的增加，POD活性降低，且鹽濃度越高，降低程度越多。在相同濃度鹽脅迫下，POD活性呈先升高后降低趨勢(shì)，并在0～4 d內(nèi)出現(xiàn)峰值。脅迫后期100 mmol/L NaCl 處理POD活性降低，但與CK不存在顯著性差異。SOD活性隨脅迫時(shí)間增加和鹽濃度的升高，SOD活性先升高后降低，分別在第4天、100 mmol/L NaCl出現(xiàn)峰值。且后期隨SOD活性的降低，100 mmol/L NaCl處理SOD活性仍高于其他鹽濃度處理。說(shuō)明在一定范圍內(nèi)，植物可通過(guò)較高的POD、SOD酶活性來(lái)清除有害自由基來(lái)緩解鹽脅迫對(duì)細(xì)胞膜透性的傷害。但在長(zhǎng)時(shí)間或者高濃度鹽脅迫下，超過(guò)了小果黑核桃幼苗的耐受范圍，導(dǎo)致細(xì)胞膜透性遭到損傷，細(xì)胞自身代謝失衡，POD、SOD活性降低，不能有效清除自由基，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)進(jìn)一步被破壞，這與朱金方[21]、于金平等[22]的研究結(jié)果一致。小果黑核桃幼苗在100 mmol/L NaCl濃度下短期耐鹽，而高鹽濃度或長(zhǎng)期脅迫下POD、SOD活性下降迅速。

脯氨酸、可溶性蛋白作為植物重要的有機(jī)調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓。滲透調(diào)節(jié)是植物對(duì)鹽脅迫常見(jiàn)的應(yīng)激方式，為植物提高抗逆性、維持細(xì)胞環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定的基礎(chǔ)。脯氨酸在植物體內(nèi)處于游離狀態(tài)，在受到脅迫時(shí)大量積累，調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢(shì)，是植物受到鹽脅迫后植物體為調(diào)節(jié)自身生理代謝而采取的一種保護(hù)性措施[23-24]。本試驗(yàn)表明：小果黑核桃幼苗的耐鹽性在100 mmol/L NaCl濃度，隨著鹽濃度的升高和脅迫時(shí)間的增加，脯氨酸含量總體呈上升的變化趨勢(shì)。鹽脅迫對(duì)可溶性蛋白的影響為：隨著鹽濃度的升高和脅迫時(shí)間的增加，可溶性蛋白含量先增加，后減少，且減少的幅度遞增。在鹽脅迫前期和低鹽濃度下，小果黑核桃幼苗內(nèi)的可溶性蛋白含量增加可能是由于其作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，起到暫時(shí)緩解鹽害的作用。在脅迫后期或高鹽濃度下，可溶性蛋白含量大幅度減少，其原因可能是Na＋、Cl-大量進(jìn)入細(xì)胞，破壞細(xì)胞內(nèi)原有離子平衡，瓦解膜電勢(shì)，使細(xì)胞原生質(zhì)凝集，破壞蛋白質(zhì)合成的同時(shí)加快蛋白質(zhì)水解為各種游離氨基酸，脯氨酸含量增加，可溶性蛋白含量減少。

綜上，隨著鹽濃度的升高和脅迫時(shí)間的增加，POD和SOD活性先升高后降低，游離脯氨酸大量積累，可溶性蛋白含量變化趨勢(shì)為先增加后減少。在100 mmol/L NaCl處理時(shí)表現(xiàn)為POD和SOD活性較高，后期與對(duì)照沒(méi)有顯著性差異，脯氨酸積累較少，且可溶性蛋白變化幅度較小，說(shuō)明小果黑核桃幼苗可耐100 mmol/L NaCl脅迫。

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Effects of salt stress on osmotic regulator and antioxidase activities inseedlings

Liu Hao1, Wang Qian2, Xu Huimin3, He Jiaqi2, Li Ai2, Gao Ying2,Corresponding Author

（1. The Research Institate of Pomology, Tianjin Academy of Agricultural Sciences, Tianjin 300384, China; 2. College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China; 3. Luoning County Forestry Bureau, Luoning 471700, Henan Province, China）

In order to research the salt tolerance of walnut rootstocks, so as to provide scientific basis for screening salt-tolerant walnut rootstocks, the seedlings ofwere treated under salt stress with NaCl and the growth situation of seedlings were observed. The physiological indexes ofseedlings were also measured in different days after treatment. The results showed that the walnut leaves were wilted and the leaves became yellow. The leaves become dark until the plants die under high-concentration and long-term salt stress. With the increase of salt concentration and stress time, the activity of POD and SOD increased first and then decreased, the free proline accumulated, and the change trend of soluble protein content was increasing first and then decreasing. It was found that the seedlings ofshowed tolerance of salt stress with 100 mmol/L NaCl.

; salt tolerance; antioxidant enzymes; osmoregulation substance

1008-5394（2021）04-0001-05

10.19640/j.cnki.jtau.2021.04.001

S664.1

A

2020-09-23

天津農(nóng)學(xué)院科學(xué)研究發(fā)展基金計(jì)劃資助項(xiàng)目（2016NYB07）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31800572）；天津市林果現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（ITTHRS2021000）

劉昊（1983—），男，助理研究員，博士，主要從事林果栽培及育種方面的研究。E-mail：glkl@163.com。

高英（1982—），女，講師，博士，主要從事果樹(shù)栽培育種方面的研究。E-mail：gying@tjau.edu.cn。

責(zé)任編輯：楊霞