吳海云，孫雪梅，曾雅楠，于亞萍，楊仁杰，衛(wèi)勇，通信作者

金納米顆粒碳電極固載布魯氏菌抗體免疫傳感器的研究

吳海云1，孫雪梅2，曾雅楠1，于亞萍1，楊仁杰1，衛(wèi)勇1，通信作者

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 工程技術(shù)學(xué)院，天津 300392；2. 天津市南開翔宇國(guó)際學(xué)校，天津 300110）

提出并建立一種金納米顆粒修飾碳電極固載布魯氏菌抗體免疫傳感器，用于布魯氏菌的快速檢測(cè)。采用絲網(wǎng)印刷金納米顆粒碳電極作為工作電極，利用金納米顆粒表面積大的特點(diǎn)，在工作電極表面修飾布魯氏菌抗體，構(gòu)建電化學(xué)三電極體系。通過循環(huán)伏安法（CV法）表征免疫電極的電化學(xué)反應(yīng)過程。以氧化峰電流的變化值（Δpa）作為電流響應(yīng)信號(hào)，PBS緩沖液為空白對(duì)照，結(jié)果表明布魯氏菌抗原與抗體免疫結(jié)合導(dǎo)致氧化峰電流減小，而無(wú)菌的PBS緩沖液電流值則幾乎沒有變化，用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌代替布魯氏菌進(jìn)行檢測(cè)，干擾菌的響應(yīng)信號(hào)與空白液相當(dāng)，因此免疫傳感器對(duì)布魯氏菌有較好的特異性。

布魯氏菌；金納米顆粒；免疫傳感器；循環(huán)伏安法；電化學(xué)

布魯氏菌病（簡(jiǎn)稱“布病”）是由布魯氏菌屬的細(xì)菌引起的傳染—變態(tài)反應(yīng)性人畜共患傳染病[1]。依據(jù)《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》，布病是37種傳染病中的乙類傳染病[2]。被列為《家畜家禽防疫條例實(shí)施細(xì)則》中二類動(dòng)物疾病之首，嚴(yán)重威脅人們身心健康。

目前，布病檢測(cè)方法主要包括細(xì)菌學(xué)和血清學(xué)兩種方法，常見的血清方法有試管凝集試驗(yàn)（SAT）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）、虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）等[3]。血清學(xué)方法主要基于對(duì)家畜布病抗體的檢測(cè)，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)必須逐頭采血，分離血清，勞動(dòng)量相當(dāng)大，而且血清特異性抗體出現(xiàn)在感染的2～4周，不利于疾病的早期診斷。與抗體檢測(cè)法相比，檢測(cè)布病病原法更直接，檢測(cè)結(jié)果也更可靠。但該方法操作時(shí)需非常謹(jǐn)慎，對(duì)操作者人身安全危險(xiǎn)較大，所需實(shí)驗(yàn)室條件較高，一般在BSL.2級(jí)實(shí)驗(yàn)室操作，很難在布病快速診斷及控制方面推廣[4-5]。因此，開發(fā)高靈敏免疫傳感器及建立快速的檢測(cè)方法，對(duì)布病細(xì)菌的檢測(cè)具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

電化學(xué)生物傳感器是一種快速檢測(cè)致病菌的方法。在病菌的快速檢測(cè)方面，一些學(xué)者展開了相關(guān)研究。文獻(xiàn)[6-9]報(bào)道了基于電化學(xué)免疫傳感器，成功用于禽流感（H5N1）抗體、大腸桿菌O157：H7等的檢測(cè)。基于抗原-抗體的免疫反應(yīng)導(dǎo)致電極表面電化學(xué)特性變化的原理，WU等[10]提出了一種阻抗型電化學(xué)免疫傳感器用于布魯氏菌的快速檢測(cè)；楊威等[11]采用絲網(wǎng)印刷金電極表面修飾巰基乙胺綁定抗原的方法，實(shí)現(xiàn)了布魯氏菌抗體的快速檢測(cè)。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)納米尺寸的功能顆粒能夠在單位面積上固定大量的生物分子，形成高效的生物傳感膜或生物質(zhì)劑，利用生物分子的直接吸附，可顯著提高分析體系的靈敏度[12-13]。

本研究構(gòu)建了基于金納米顆粒修飾碳電極固載布魯氏菌抗體免疫傳感器。利用金納米顆粒較強(qiáng)的吸附能力和良好的電子傳遞能力，不僅可以增加抗體的固定量，還可以增強(qiáng)電子在電極和抗原之間的傳遞。研究了電極的循環(huán)伏安特性，并將該傳感器用于布病病菌的分析。制作的電極無(wú)需對(duì)抗原或者抗體標(biāo)記，制備相對(duì)簡(jiǎn)單，可為布病的快速檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

CHI760C電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；金納米顆粒修飾絲網(wǎng)印刷碳電極（GNPs-SPE，DRP-110GNP型，西班牙DropSens公司）；恒溫培養(yǎng)箱（PYX-DHS-50X65-BS-Ⅱ型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

布魯氏菌病試管凝集試驗(yàn)抗原、布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清均購(gòu)買于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所（北京，中國(guó)）。牛血清白蛋白（BSA，Roche 公司）、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、氯化鉀及氯化鈉等試劑購(gòu)買于天津江天統(tǒng)一試劑公司。布魯氏菌抗原用磷酸鹽緩沖液（Phosphate-buffered saline，PBS，10 mM，pH 7.4）稀釋成濃度為4 × 105CFU/mL 的抗原液。布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清使用前用PBS進(jìn)行25倍稀釋。試驗(yàn)過程中所用水均為超純水（18.2 M?·cm）。

磷酸緩沖溶液（PBS，pH 7.4）的配制：KCl 7.43 g，Na2HPO43.58 g，KH2PO41.36 g，配成1 000 mL溶液。電解液的配制：2.5 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6（體積比為1：1），0.1mol/L KCl，10 mmol/L PBS（pH 7.4）。

1.2 免疫傳感器的制備

布魯氏菌抗體通過滴涂法修飾到GNPs-SPE的工作電極表面，在37 ℃下培養(yǎng)1 h，待抗體被金納米顆粒吸附到電極表面后，將電極浸入到PBS中，30 s后，用超純水輕輕沖洗2次。在被覆抗體的電極表面滴加1%的牛血清白蛋白封閉液15 μL，37 ℃下放置1 h，以封閉電極表面未結(jié)合抗體的活性位點(diǎn)。之后電極浸入到PBS中30 s，用超純水沖洗2次后備用。

1.3 試驗(yàn)方法

GNPs-SPE為一次性絲網(wǎng)印刷碳電極，具有強(qiáng)化的電子轉(zhuǎn)移特性，放于室溫干燥的封閉環(huán)境中。該電極將金納米顆粒與碳混合固化到陶瓷基底上（33 mm×10 mm×0.5 mm）作為工作電極（直徑4 mm），同時(shí)將碳固化到陶瓷上作為對(duì)電極，銀作為參比電極。電化學(xué)工作站的三電極分別與GNPs-SPE的對(duì)應(yīng)三組電極引線相連，構(gòu)成電化學(xué)三電極測(cè)試系統(tǒng)。

在制備好的免疫傳感器電極表面滴加一定濃度的布魯氏菌溶液15 μL，37 ℃下孵化1 h后，分別用PBS和超純水沖洗2次。在電極表面滴加50 μL電解液，以CV法考察電極表面不同修飾狀態(tài)的電化學(xué)特性。CV法的測(cè)試條件：電壓-0.4～0.6 V，掃描速度為100 mV/s，掃描間隔為1 mV。

2 結(jié)果與分析

2.1 電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)原理

在金納米顆粒絲網(wǎng)印刷工作電極表面，利用納米金比表面積大，吸附能力強(qiáng)、導(dǎo)電性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，通過滴涂法自組裝吸附上布魯氏菌抗體；再利用1%的牛血清白蛋白封閉液封閉電極表面未結(jié)合抗體的活性位點(diǎn)，防止未結(jié)合抗體的金納米顆粒與布病病菌結(jié)合，造成測(cè)量誤差。最后通過抗體-抗原的特異性結(jié)合，將布魯氏菌抗原捕獲到電極表面。檢測(cè)過程如圖1所示。

在檢測(cè)過程中，抗原-抗體復(fù)合物的形成將會(huì)增加其對(duì)電子傳遞的阻力，阻礙了[Fe（CN）6]3-/4-氧化還原對(duì)到電極表面的途徑，導(dǎo)致電子傳遞阻抗增大。因此通過電化學(xué)測(cè)試，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的定性或定量檢測(cè)。

2.2 電極修飾過程的表征

在CV測(cè)試中，伴隨電極的修飾過程，電子傳遞速率會(huì)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致不同狀態(tài)下電極表面峰電流、峰電位間距會(huì)發(fā)生變化。其中，氧化峰電流值（pa）、氧化峰與還原峰電流比值的絕對(duì)值（|pa/pc|）及氧化峰與還原峰電位差值（Δp）是考察電極的重要特征參數(shù)。為進(jìn)一步表征電極的修飾過程，以不同修飾狀態(tài)的電極為工作電極，于2.5 mmol/L [Fe（CN）6]3-/4-溶液中-0.4～0.6 V的電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)定。圖2是電極逐步修飾過程的循環(huán)伏安曲線。曲線a、b、c分別是裸電極、綁定抗體電極、BSA封閉后電極的循環(huán)伏安曲線。電極的特征參數(shù)如表1所示。

注：a為裸GNPs-SPE；b為抗體修飾后；c為封閉后；d為布魯氏菌細(xì)胞（4×105CFU/ mL）吸附后

表1 修飾抗體后電極的特征參數(shù)

通過觀察曲線a可以發(fā)現(xiàn)，在GNPs-SPE裸電極上有一對(duì)[Fe（CN）6]3-/4-的可逆氧化還原電流峰，峰電位pa為0.214 V，pc為0.073 V，|pa/pc|為1.03，接近1.00，表面電極具有較好的可逆性。當(dāng)電極表面修飾有布魯氏菌抗體后，響應(yīng)電流降低（圖2曲線b），表明[Fe（CN）6]3-/4-可以通過單分子層到達(dá)電極表面進(jìn)行反應(yīng)，但是由于電極上有不同物質(zhì)，使得[Fe（CN）6]3-/4-向電極表面擴(kuò)散的有效截面積減小，因此氧化電流氧化電流pa（73.03 μA）比裸電極（92.26 μA）明顯減小，電位差Δp明顯增大（從0.141 V增加到0.169 V）。當(dāng)電極用BSA封閉后（曲線c），由于BSA封閉了未結(jié)合活性位點(diǎn)，峰電流稍有下降（從73.03 μA降到72.74 μA）和峰電位間距的稍有增加（從0.169 V增加到0.179 V）。當(dāng)修飾好的電極表面滴加一定濃度的布魯氏菌溶液15 μL（濃度為4×105CFU/mL），37 ℃下孵化1 h后，所得到的曲線如圖2中的曲線d，由于抗原抗體的專一性免疫反應(yīng)，生產(chǎn)的免疫復(fù)合物阻塞了修飾電極的更多孔徑通道，從而增大了[Fe（CN）6]3-/4-電子轉(zhuǎn)移阻力，同時(shí)有效截面積進(jìn)一步減小，因此導(dǎo)致響應(yīng)電流進(jìn)一步下降。

2.3 試驗(yàn)條件的選擇

研究發(fā)現(xiàn)，免疫傳感器在20～500 V/s范圍內(nèi)，氧化還原峰的電流與速率呈線性關(guān)系。說(shuō)明氧化還原探針[Fe（CN）6]3-/4-在免疫電極表面的電化學(xué)反應(yīng)是表面控制過程[14]。后續(xù)設(shè)置掃描速度為100 mV/s。分別選擇不同稀釋倍數(shù)（10、25、250倍）的抗體綁定到電極上。經(jīng)測(cè)定，25倍稀釋抗體電極的氧化峰電流變化最大。所以，試驗(yàn)中選擇抗體25倍稀釋。另外，溶液的pH值會(huì)影響免疫反應(yīng)，試驗(yàn)中病菌宜在生物體內(nèi)相似的生存環(huán)境，即選擇pH值7.4為工作的酸堿度[15]。

2.4 免疫傳感器對(duì)布魯氏菌抗原的電化學(xué)響應(yīng)特性

將布魯氏菌抗原（濃度為4 × 105CFU/mL）與抗體結(jié)合引起的氧化峰電流的變化值Δpa（pa（BSA）-pa（菌體結(jié)合））作為電流響應(yīng)信號(hào)，PBS緩沖液為空白對(duì)照，電流響應(yīng)結(jié)果如圖3所示。抗原抗體免疫結(jié)合導(dǎo)致氧化峰電流減小，而無(wú)菌的PBS緩沖液電流值則幾乎沒有變化，說(shuō)明免疫反應(yīng)生成的免疫復(fù)合物進(jìn)一步阻礙了電子傳遞。

同時(shí)，試驗(yàn)考察了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌對(duì)布魯氏菌測(cè)定的干擾。分析過程中分別用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌代替布魯氏菌進(jìn)行檢測(cè)，PBS緩沖液為對(duì)照。結(jié)果表明，該檢測(cè)方法對(duì)布魯氏菌的響應(yīng)最大，干擾菌的響應(yīng)信號(hào)與空白液相當(dāng)，說(shuō)明傳感器對(duì)布魯氏菌有較好的特異性。

3 結(jié)論

利用金納米顆粒的比表面積大的特點(diǎn)，構(gòu)建了一種金納米顆粒修飾碳電極固載布魯氏菌抗體免疫傳感器。以氧化峰電流的變化值（Δpa）作為電流響應(yīng)信號(hào)，免疫傳感器對(duì)布魯氏菌有較好的特異性。試驗(yàn)制備的免疫傳感使用簡(jiǎn)單，而且樣品測(cè)試量少（15 μL），檢測(cè)周期短，有利于布病的早期診斷，具有很好的應(yīng)用前景。

[1] 張偉，任超，王軼敏，等. 人獸共患病的發(fā)生及流行原因分析[J]. 天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，32（2）：60-62.

[2] 黃正曄. 《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》實(shí)施細(xì)則解讀[J]. 健身科學(xué)，2003（6）：46-47.

[3] 張士軍. 布魯氏菌快速核酸檢測(cè)方法的建立[D]. 長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2020.

[4] 趙鎖花，楊建德. 人感染布氏桿菌病的風(fēng)險(xiǎn)因素分析[J]. 天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2017，24（3）：97-98，101.

[5] 尕藏吉. 牛布氏桿菌病診斷與防治[J]. 畜牧獸醫(yī)科學(xué)（電子版），2020（14）：68-69.

[6] 莫曉燕. 基于聚苯胺及其納米復(fù)合材料對(duì)O157：H7可再生免疫傳感器的研究[D]. 杭州：浙江工商大學(xué)，2019.

[7] YE L，ZHAO G，DOU W. An electrochemical immunoassay forO157：H7 using double functionalized Au@Pt/SiO2nanocomposites and immune magnetic nanoparticles[J]. Talanta，2018，182：S0039914018301073.

[8] 王延新. 基于碳納米復(fù)合材料新型電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建及應(yīng)用[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

[9] RAZMI N, HASANZADEH M, WILLANDER M, et al. Recent progress on the electrochemical biosensing ofO157：H7：material and methods overview[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2020, 10（5）：54-60.

[10] WU H，ZUO Y，CUI C，et al. Rapid quantitative detection ofby a label-free impedance immunosensor based on a gold nanoparticle-modi?ed screen-printed carbon electrode[J]. Sensors，2013，13（7）：8551-8563.

[11] 楊威，左月明，吳海云，等. 布魯氏菌抗體的無(wú)標(biāo)記電流型免疫傳感器檢測(cè)[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，2014，45（3）：243-249.

[12] CHOWDHURY A D，NASRIN F，GANGOPADHYAY R，et al. Controlling distance，size and concentration of nanoconjugates for optimized LSPR based biosensors[J]. Biosensors and Bioelectronics，2020，170：1-9.

[13] TA-AITHUAK S，LOEDSAPCHINDA N，HOUNGKAMHANG N. Conjugation of antibody on gold nanoparticles for biosensors application[J]. Key Engineering Materials，2020，853：92-96.

[14] 王燕，陳蓁蓁. 巰基乙胺修飾電極法測(cè)定植物體內(nèi)超氧陰離子自由基[J]. 分析化學(xué)，2008（11）：1505-1509.

[15] 楊威，韓小平，張志勇，等. 戊二醛交聯(lián)的傳感器檢測(cè)布魯氏菌抗體的研究[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2018，38（6）：71-76.

Study on antibody immobilization biosensor ofwith gold nanoparticles-modi?ed carbon electrode

Wu Haiyun1, Sun Xuemei2, Zeng Yanan1, Yu Yaping1, Yang Renjie1, Wei Yong1,Corresponding Author

（1. College of Engineering and Technology, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China; 2. Tianjin Nankai Xiangyu International School, Tianjin 300110, China）

An immunosensor fabricated by immobilizingantibody onto the surface of gold nanoparticles-modified screen-printed carbon electrodes（GNPs-SPCEs）was proposed for the rapid detection of. The gold nanoparticle carbon electrode was used as the working electrode, and theantibody was modified on the surface of the working electrode to construct the electrochemical three electrode system. The reaction process was characterized by cyclic voltammetry（CV）. The change value of oxidation peak current（Δ IPA）was used as the current response signal, and PBS buffer was used as blank control. It was found that when the antigen ofcombined with antibody, the oxidation peak current decreased, while the current value of sterile PBS buffer almost did not change. Whenandwere used to replace, the response signal of interfering bacteria was similar to that of blank solution. Therefore, the immunosensor has good specificity for.

; gold nanoparticles; immunosensor; cyclic voltammetry; electrochemistry

1008-5394（2021）04-0059-04

10.19640/j.cnki.jtau.2021.04.013

TP212.3；TP212.9

A

2020-11-15

天津市教委科研計(jì)劃項(xiàng)目（2017KJ180）

吳海云（1985－），女，助理研究員，博士，主要從事生物傳感器方面的研究。E-mail：haiyunwu2019@163.com。

衛(wèi)勇（1973－），男，副教授，博士，主要從事智能農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備方面的研究。E-mail：weiytj@qq.com。

責(zé)任編輯：楊霞