張丞慧，李凱銘，趙琪，于潔，貢嘎益西，胡寶全

新疆野蘋果多倍體誘導(dǎo)及葉片特征分析

張丞慧，李凱銘，趙琪，于潔，貢嘎益西，胡寶全通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300392）

新疆野蘋果是蘋果重要的野生資源和砧木，挖掘其利用方法有利于蘋果育種工作的進一步開展。本研究采用新疆野蘋果實生幼苗為材料，通過不同濃度秋水仙素的浸漬處理誘導(dǎo)四倍體，并觀察其葉片特征結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明，0.2%的秋水仙素處理幼苗1 d能取得較好的誘導(dǎo)效果，新疆野蘋果四倍體相對于二倍體，其葉片加厚，氣孔密度降低，葉綠素含量增加，葉片解剖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化并導(dǎo)致葉片緊實度增加、疏松度下降，表現(xiàn)出高抗逆性的葉片特征。研究結(jié)果可為新疆野蘋果種質(zhì)資源的開發(fā)提供新途徑，并為蘋果新型優(yōu)質(zhì)砧木的培育和蘋果的倍性育種工作提供新的參考和理論支持。

新疆野蘋果；四倍體；秋水仙素；葉片；解剖結(jié)構(gòu)

新疆野蘋果是薔薇科蘋果屬植物，原產(chǎn)于中亞和我國的新疆地區(qū)，屬于第三紀孑遺物種，已經(jīng)被列為國家瀕危二級保護植物，是珍貴的蘋果野生種質(zhì)資源，且具有與栽培品種親和力強、種質(zhì)資源豐富、耐寒和耐鹽堿等特點[1]，因此在陜 西、山東、河北、新疆等地被廣泛用作栽培蘋果的砧木[2]。

多倍體植物廣泛存在于被子植物中，幾乎所有的被子植物在進化中都經(jīng)歷過古多倍體事件，多倍體化也是新物種形成的重要途徑。而果樹多倍體化后一般具有營養(yǎng)生長旺盛、果實大和抗逆性強等特點[3]，因此多倍體育種是蘋果種質(zhì)創(chuàng)新的重要手段之一。目前栽培蘋果中，大部分品種為二倍體，但部分品種出現(xiàn)三倍體或四倍體，如‘喬納金’‘北海道’‘金冠’和‘嘎拉’等[4]。蘋果多倍體可通過自然突變或人工誘導(dǎo)兩條途徑產(chǎn)生，其中自然突變包括體細胞突變和減數(shù)分裂不分離的生殖細胞突變。通過對大量蘋果實生苗的染色體鑒定發(fā)現(xiàn)，二倍體自然授粉可產(chǎn)生三倍體，占比0.3%，也可產(chǎn)生四倍體，約占0.1%[5]，但自然突變幾率低，獲得多倍體篩選工作量大。因此人工誘變是獲得蘋果多倍體的重要途徑，其中使用最廣泛的是秋水仙素誘導(dǎo)。如0.5%的秋水仙素浸漬‘金冠’的成熟胚2 d后，可誘導(dǎo)蘋果四倍體，誘導(dǎo)率可達10.6%，‘寒富’和‘煙嘎’蘋果的試管苗葉片在含有秋水仙素的液體再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)，也可誘導(dǎo)四倍體，誘變率在5.3%～22.2%[6]。含有25 mg/L秋水仙素的不定芽再生培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)‘皇家嘎拉’蘋果外植體，可獲得四倍體，誘導(dǎo)率最高為36.7%[7]。

蘋果多倍體的誘導(dǎo)雖然取得一些進展，但蘋果砧木的多倍體化研究進展較慢。而目前對新疆野蘋果的研究集中于對新疆野蘋果的繁育特性、抗逆性生理機制和野蘋果林的保護等方面，對于新疆野蘋果種質(zhì)資源的創(chuàng)新工作進展較為緩慢，目前尚未發(fā)現(xiàn)有學(xué)者對新疆野蘋果進行多倍體化的種質(zhì)資源創(chuàng)新。本研究利用不同濃度的秋水仙素對二倍體新疆野蘋果誘導(dǎo)加倍，獲得四倍體新疆野蘋果植株，篩選最適的誘導(dǎo)條件，并對四倍體新疆野蘋果的葉片結(jié)構(gòu)特征進行探究，為新疆野蘋果的種質(zhì)創(chuàng)新提供新的途徑和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗以展開子葉的新疆野蘋果幼苗為材料，種子來源于經(jīng)鑒定為二倍體的5年生新疆野蘋果樹。將新疆野蘋果種子室溫浸泡過夜，然后將剝?nèi)シN皮的種子置于培養(yǎng)皿中，覆蓋潤濕的紙巾，于22 ℃溫箱中催芽，待種子展開子葉未抽真葉時，種植于基質(zhì)（草碳∶蛭石∶珍珠巖＝1∶1∶1）中培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 四倍體新疆野蘋果誘導(dǎo)

以水為對照，室溫條件下將含有不同濃度秋水仙素溶液（0.20%、0.10%、0.05%、0.01%）的棉花，浸漬新疆野蘋果幼苗莖尖生長點24 h，蒸餾水清洗后正常培養(yǎng)，每個處理梯度25株，3次重復(fù)。

1.2.2 染色體鑒定

飽和對二氯苯溶液中，室溫浸泡莖尖3 h，蒸餾水清洗后，卡諾固定液固定12 h，取出于1 mol/L鹽酸中60 ℃解離10 min，蒸餾水清洗3次后，卡寶品紅染色1 h。于載玻片上經(jīng)蓋玻片壓片后，顯微鏡下鏡檢，選取5個視野對染色體計數(shù)，并判定多倍體。

1.2.3 氣孔及保衛(wèi)細胞測量

撕取新疆野蘋果葉片表皮于載玻片上，Leica DM4000B 顯微鏡觀察，LAS4.2軟件測量氣孔及保衛(wèi)細胞長寬，每個植株選取5片葉片，選取5個視野，統(tǒng)計每個視野下氣孔數(shù)，并測量其中5個氣孔及保衛(wèi)細胞的長寬，計算氣孔密度，水處理植株作為對照，數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0，采用方差分析進行顯著性檢驗。計算處理后的存活率和誘導(dǎo)率，并使用SPSS 19.0進行單因素方差分析和多重比較。

氣孔密度（個/mm2）＝氣孔個數(shù)/視野面積 （1）

1.2.4 葉片解剖結(jié)構(gòu)觀察

每株新疆野蘋果取健康葉片，以主脈為對稱軸，切成寬度為5 mm的小段，于FAA固定液中處理24 h后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，于Leica RM 2235切片機上切片，番紅固綠染色，中性樹膠封片，Leica DM4000B顯微鏡觀察，LAS 4.2軟件測量葉片上下表皮、柵欄組織、海綿組織、葉片和葉肉厚度，計算緊實度、疏松度、上下表皮相對厚度，每株葉片樣本測量10次，數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0，采用方差分析進行顯著性檢驗。

緊密度/%＝柵欄組織厚度/葉片厚度×100 （2）

疏松度/%＝海綿組織厚度/葉片厚度×100 （3）

上表皮相對厚度/%＝上表皮厚度/葉片厚度×100 （4）

下表皮相對厚度/%＝下表皮厚度/葉片厚度×100 （5）

1.2.5 葉片葉綠素含量測定

各取植株葉片1 g，于研缽中加入少許石英砂和5 mL 95%乙醇，充分研磨，直到殘渣變白，液體和殘渣轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，少量95%乙醇沖洗，定容至10 mL，置于4 ℃冰箱中，靜置12 h后，以2 000 r/min離心10 min，95%乙醇為空白對照，在波長665、649 nm下，測定吸光度，并按照ARNON的修正公式計算葉綠素含量[8]，數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0，采用方差分析進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆野蘋果誘導(dǎo)結(jié)果

不同濃度秋水仙素處理新疆野蘋果幼苗結(jié)果見表1。0.05%秋水仙素處理存活率與対照組差異不顯著，0.01%、0.10%和0.20%處理存活率顯著低于對照組。存活率的變化與秋水仙素濃度的提高沒有線性對應(yīng)關(guān)系，但高于0.05%秋水仙素處理對新疆野蘋果幼苗的存活有一定的抑制作用。

表1 秋水仙素處理結(jié)果 %

注：大寫字母表示＜0.01水平上不同處理間差異顯著，小寫字母表示＜0.05水平上不同處理間差異顯著

取變異植株和二倍體的莖尖制備染色體，統(tǒng)計細胞分裂中期細胞（圖1），發(fā)現(xiàn)對照株染色體數(shù)為2＝34，變異株的染色體數(shù)為4＝68。依據(jù)染色體計數(shù)結(jié)果判定多倍體誘導(dǎo)結(jié)果，結(jié)合表1可知，0.20%秋水仙素誘導(dǎo)效果最好，而秋水仙素濃度0.01%到0.10%，多倍體誘導(dǎo)率變化不大。因此0.2.0%的處理濃度適合浸漬法誘導(dǎo)新疆野蘋果四倍體。

注：A為二倍體；B為變異植株

2.2 新疆野蘋果二倍體和四倍體葉片氣孔及保衛(wèi)細胞比較

撕取四倍體和對照的葉片表皮，測量氣孔和保衛(wèi)細胞的長寬如表2所示，四倍體的氣孔和保衛(wèi)細胞大小均極顯著高于二倍體（＜0.001），同時根據(jù)視野面積計算氣孔密度，四倍速體氣孔極顯著少于二倍體。這表明變異植株葉片氣孔及保衛(wèi)細胞顯著增大，同時氣孔數(shù)量大量減少。對葉片氣孔密度進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)四倍體氣孔密度顯著低于二倍體。

表2 變異植株與正常二倍體氣孔及保衛(wèi)細胞大小比較分析

注：***表示＜0.001

2.3 新疆野蘋果二倍體和四倍體葉片葉綠素含量比較

測定新疆野蘋果二倍體和四倍體的葉片葉綠素發(fā)現(xiàn)，四倍體葉綠素a的含量極顯著高于二倍體，計算葉綠素a/b比值和總?cè)~綠素含量，四倍體顯著高于二倍體，葉綠素b含量變化不顯著（表3），這說明四倍體光合作用可能強于二倍體，營養(yǎng)代謝加強。

表3 新疆野蘋果二倍體和四倍體葉綠素含量比較

注：*和**分別表示＜0.05和＜0.01

2.4 新疆野蘋果二倍體和四倍體葉片解剖結(jié)構(gòu)

分析新疆野蘋果二倍體和四倍體葉片解剖結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)（圖2，表4），四倍體葉片厚度、葉肉厚度、上表皮和柵欄組織極顯著厚于二倍體，海綿組織和下表皮顯著厚于二倍體，四倍體葉片緊實度顯著高于二倍體，二倍體葉片疏松度顯著高于四倍體，上下表皮相對厚度變化不顯著。結(jié)果說明新疆野蘋果染色體加倍后，葉片結(jié)構(gòu)中各部分組織不同程度的加厚，其中柵欄組織和上表皮加厚最顯著，加厚導(dǎo)致四倍體葉片緊實度增加，疏松度降低。

注：A為二倍體；B為四倍體

表4 新疆野蘋果二倍體和四倍體葉片解剖結(jié)構(gòu)比較

注：*和**分別表示＜0.05和＜0.01

3 討論

蘋果廣泛栽種于世界各地，其適應(yīng)性強，果實營養(yǎng)價值高。而多倍體器官巨大化的特點，使倍性育種成為果樹育種中一種重要的種質(zhì)創(chuàng)新手段。雖然蘋果多倍體在蘋果自然繁殖群體中可通過篩選獲得，但效率和成本較高，因此人工誘導(dǎo)是普遍采用的倍性育種手段。其中秋水仙素是誘導(dǎo)多倍體效果最好的化學(xué)誘變劑，被廣泛應(yīng)用于蘋果的多倍體誘導(dǎo)。但秋水仙素作為有絲分裂阻斷劑，本身對植物細胞具有毒害作用，會導(dǎo)致發(fā)育停滯和器官畸形等問題[9]。因此選取合適的秋水仙素濃度處理植物材料，是倍性育種工作中需要摸索的試驗條件。通常秋水仙素的濃度越高，對植物組織生長的抑制作用越明顯。本試驗在對新疆野蘋果的誘導(dǎo)過程中，觀測到了較高濃度的秋水仙素對幼苗生長有一定的抑制作用現(xiàn)象，但抑制作用與秋水仙素濃度的增加沒有成比例增加，這可能與幼苗的個體差異有關(guān)。

秋水仙素誘導(dǎo)多倍體，因處理材料的不同，而采用不同濃度的秋水仙素，以往使用不定芽等組培組織作為處理材料，由于處理時間長，因此采用的秋水仙素的濃度較低，為15～120 mg/L，誘導(dǎo)率在10%～30%[6-7]。但培養(yǎng)基誘導(dǎo)法，對不同的蘋果品種材料需要重新優(yōu)化組培條件，獲得組培苗還需誘導(dǎo)生根移植大田，步驟繁瑣耗時長。本試驗采用剝掉蘋果種子種皮的方法快速促進蘋果種子萌發(fā)，獲得幼苗后浸漬處理，篩選獲得多倍體，相對于培養(yǎng)基法較為簡便，也能取得較好的誘導(dǎo)效果，其誘導(dǎo)率可達24.0%。這表明浸漬法誘導(dǎo)多倍體可能優(yōu)于培養(yǎng)基法。李曉艷等對越橘采用培養(yǎng)基法和莖段浸漬法的試驗對比結(jié)果就表明，長時間采用含低濃度秋水仙素培養(yǎng)基誘導(dǎo)的方法，其誘導(dǎo)效果不如短時間的浸漬法[10]。這說明秋水仙素誘導(dǎo)多倍體不宜處理時間太長，否則秋水仙素會抑制材料的生長。

多倍體植物一般會表現(xiàn)出葉片增厚變大的趨勢[11]，通過對新疆野蘋果二倍體和四倍體的葉片解剖結(jié)構(gòu)分析，四倍體葉片厚度顯著高于二倍體。這與以往對多倍體蘋果的觀察結(jié)果一致，如馬躍等發(fā)現(xiàn)人工誘導(dǎo)的‘寒富’蘋果同源四倍體葉片明顯加厚[12]，李林光對‘喬納金’等蘋果多倍體的觀察也發(fā)現(xiàn)多倍體葉片明顯增厚[6]。這表明多倍體化影響新疆野蘋果的葉片厚度發(fā)生顯著變化。進一步比較分析葉片解剖結(jié)構(gòu)各組織的變化發(fā)現(xiàn)，其中柵欄組織變厚的趨勢更加顯著，這種改變導(dǎo)致新疆野蘋果四倍體的葉片緊實度顯著上升而疏松度顯著下降。同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在對‘寒富’多倍體的檢測分析中，同源四倍體‘寒富’蘋果的柵海比比二倍體增加了16.1%[12]。

植物葉片對環(huán)境的變化最為敏感，而植物葉片結(jié)構(gòu)的變化則會改變植物對環(huán)境的適應(yīng)性[13]。新疆野蘋果四倍體葉片各部分增厚的同時，柵欄組織特異性的增厚導(dǎo)致四倍體葉片變得更加緊實。這種緊實的葉片結(jié)構(gòu)被認為能賦予葉片更強的抗逆性[14]。以往研究表明，蘋果屬植物多倍體化后柵欄組織變厚其抗逆性提高。如‘寒富’蘋果四倍體的柵海比增加，其抗鹽脅迫能力提高[12，15]。蘋果屬其他植物多倍體的研究也表明多倍體化確實能提高其抗逆性。如珠美海棠同源四倍體對干旱、鹽和缺鐵脅迫有較高的抗性[16]，湖北海棠四倍體具有較強的抗落葉病能力，抵御寒冷、鹽和干旱脅迫的能力增強[17]。新疆野蘋果四倍體柵欄組織增厚表明其抗逆性也很可能得到增強，對此有待于進一步試驗驗證。

在對新疆野蘋果四倍體的氣孔觀測和葉綠素含量分析中發(fā)現(xiàn)，相對于二倍體，新疆野蘋果四倍體葉片增厚的同時，氣孔密度顯著降低，同時葉綠素含量增加，這與馬躍等的研究一致[12]。氣孔密度降低，表明蒸騰作用可能減弱，其抗旱性可能提高，而葉綠素含量的增加則表明四倍體的光合作用可能增強，表明其積累生物量的速度加快。但試驗中，獲得的多倍體僅為地上部分加倍成功，獲得完整四倍體植株還需經(jīng)過扦插繁殖，同時由于檢測深度的原因，獲得的部分四倍體可能存在嵌合體的問題，還需要進一步培養(yǎng)后進行深入檢測確定。

4 結(jié)論

本試驗采用不同濃度秋水仙素浸漬新疆野蘋果幼苗誘導(dǎo)獲得四倍體，并分析四倍體的葉片解剖結(jié)構(gòu)、氣孔特征和葉綠素含量的變化，發(fā)現(xiàn)0.2%的秋水仙素處理幼苗1 d，誘導(dǎo)效果最佳，四倍體葉片氣孔密度顯著降低，葉片加厚，緊實度顯著上升，疏松度下降，且葉綠素含量顯著提高。該結(jié)果可為新疆野蘋果的倍性育種工作提供參考和理論支持。

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Induction of polyploid（Ledeb.）Roem. and characteristic analysis of its leaves

Zhang Chenghui, Li Kaiming, Zhao Qi, Yu Jie, Gongga Yixi, Hu BaoquanCorresponding Author

（College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

is a rich natural resource and rootstock of apple tree. Mining its utilization method is beneficial to the further development of apple breeding. In this study, tetraploidwas induced by soaking stem apex of seedlings with different concentrations of colchicine, and changes in the characteristic structure of the leaves in tetraploidwas analyzed. The results showed that 0.2% colchicine treatment for 1 day achieved better induction effect. The leaves thickness and chlorophyll content of tetraploid increased, but stomatal density decreased, compared with diploid. Changes in anatomical structure of tetraploid leaves significantly resulted the increase of the cell tense ratio and the decrease of spongy ratio, which were was the leaf characteristics with high resistance. The results can provide a new way for the development ofgermplasm resource, new reference and theoretical support for the cultivation of new high-quality apple rootstock and polyploid breeding work of apple.

（Ledeb.）Roem.; tetraploid; colchicine; leaves; anatomical structure

1008-5394（2021）04-0006-05

10.19640/j.cnki.jtau.2021.04.002

Q944.52；S722.3

A

2020-07-08

天津市大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201810061251）

張丞慧（1998—），男，本科在讀，主要從事林木倍性育種方面的研究。E-mail：18149296066@126.com。

胡寶全（1982—），男，助理研究員，博士，主要從事林木遺傳育種方面的研究。E-mail：baoquan-hu@126.com。

責(zé)任編輯：楊霞