張達(dá)娟，張樹林，戴偉，畢相東，許瑩芳，衛(wèi)玲玲

磷缺乏后補(bǔ)充對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

張達(dá)娟，張樹林通信作者，戴偉，畢相東，許瑩芳，衛(wèi)玲玲

（天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392）

磷是組成藻細(xì)胞的生命元素之一，對(duì)藻類生長(zhǎng)具有重要作用，亦是水華藍(lán)藻暴發(fā)的重要限制因子。本研究在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬磷缺乏后再補(bǔ)充對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響。結(jié)果表明，7 d后，磷缺乏處理組銅綠微囊藻細(xì)胞密度比對(duì)照組低0.58×107cell/mL，二者之間有顯著差異（＜0.05），處理組顯著低于對(duì)照組；磷補(bǔ)充后，銅綠微囊藻生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)處理組和對(duì)照組細(xì)胞密度基本相等，、和顯著高于對(duì)照組。該研究結(jié)果可為防控銅綠微囊藻水華暴發(fā)提供參考。

銅綠微囊藻；磷缺乏；磷補(bǔ)充；葉綠素?zé)晒鈪?shù)

磷是組成藻細(xì)胞核酸、磷脂、ATP等的基本元素，對(duì)微藻的生長(zhǎng)代謝具有重要作用。在自然水體中溶解性磷含量較高，占總磷的90%以上，藻細(xì)胞可直接吸收溶解性磷合成磷化合物，參與細(xì)胞的光合作用及蛋白、碳水化合物和脂類化合物的合成及交換，在藻細(xì)胞代謝過程中起著十分重要的作用[1-4]。有研究發(fā)現(xiàn)在低磷條件下，小分子有機(jī)磷與微量元素的共同作用激發(fā)銅綠微囊藻（）迅速生長(zhǎng)并產(chǎn)生毒素[5]。在磷缺乏的情況下銅綠微囊藻仍保持較高的生長(zhǎng)速率，主要是由于其儲(chǔ)磷的能力和對(duì)有機(jī)磷鹽較強(qiáng)的利用能力[6]，銅綠微囊藻細(xì)胞在有機(jī)磷條件下產(chǎn)生的堿性磷酸酶主要受磷濃度調(diào)控，與磷的形態(tài)無(wú)關(guān)[7]；也有研究表明，溶解態(tài)無(wú)機(jī)磷和溶解態(tài)小分子有機(jī)磷會(huì)影響堿性磷酸酶活性[8]，堿性磷酸酶活性加強(qiáng)會(huì)加快大分子有機(jī)磷降解成小分子有機(jī)磷，從而讓藻細(xì)胞更易吸收和存儲(chǔ)小分子有機(jī)磷[9]，相對(duì)其他藻類更有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。

磷在限制淡水生態(tài)系統(tǒng)初級(jí)生產(chǎn)力水平方面是主導(dǎo)因素[2]，引起水體富營(yíng)養(yǎng)化問題的關(guān)鍵因素之一是磷的過量輸入，因此，減少外源磷輸入和加強(qiáng)內(nèi)源磷消耗是治理水體富營(yíng)養(yǎng)化、改善水質(zhì)和降低藍(lán)藻暴發(fā)的常見手段[3-4]。磷濃度增加通常會(huì)導(dǎo)致水體中浮游植物群落組成向可形成水華的藍(lán)藻演替，且當(dāng)水體中總氮/總磷比小于29時(shí)，水華藍(lán)藻會(huì)占優(yōu)勢(shì)，為水華的暴發(fā)提供條件[10]。然而在自然水體中，因廢水排放、降雨及底泥營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)釋放等，氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽在水體中的含量時(shí)刻在發(fā)生變化。本研究以銅綠微囊藻905藻株為研究對(duì)象，在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬磷缺乏后再補(bǔ)充對(duì)其生長(zhǎng)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響，以期為預(yù)防微囊藻水華暴發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種培養(yǎng)

銅綠微囊藻（905）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所。使用BG-11培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，條件如下：光照強(qiáng)度40 μmol/（m2·s）、（27±1）℃，光暗比12 h∶12 h。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)設(shè)1個(gè)對(duì)照組和1個(gè)處理組，每組3個(gè)平行，對(duì)照組采用正常的BG11培養(yǎng)基，處理組采用無(wú)磷的BG11培養(yǎng)基，分別處理7 d，接種密度均為2×107cell/mL，培養(yǎng)條件與藻種培養(yǎng)條件相同。經(jīng)7 d 處理后，將對(duì)照組和試驗(yàn)組中藻液離心，取藻泥，均接種至正常BG-11培養(yǎng)基中，在磷補(bǔ)充后的第0、12、24、48、72、96、120、144小時(shí)取樣測(cè)定細(xì)胞密度和葉綠素?zé)晒鈪?shù)。

1.2.1 細(xì)胞密度測(cè)定

在光學(xué)顯微鏡下使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)銅綠微囊藻細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算藻細(xì)胞密度。

1.2.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

利用浮游植物分類熒光儀（PHYTO－PAMWALZ）對(duì)葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定方法參見張媛媛等[11]。檢測(cè)所得葉綠素?zé)晒饣A(chǔ)參數(shù)（、、、）和最大電子傳遞速率（ETR）、通過計(jì)算得到最大光能轉(zhuǎn)化效率（）、實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率（）和有效光能轉(zhuǎn)化效率（）。

計(jì)算公式：

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，在統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0中利用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，當(dāng)＜0.05即為差異顯著，＜0.01為差異極顯著；＞0.05差異不顯著。采用Excel 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷缺乏后補(bǔ)充對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞密度的影響

磷缺乏后補(bǔ)充對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞密度的影響見圖1，經(jīng)7 d處理后，對(duì)照組和處理組細(xì)胞密度分別為3.12×107cell/mL和2.54×107cell/mL，二者之間有顯著差異（＜0.01），由此可見磷缺乏對(duì)微囊藻生長(zhǎng)具有顯著抑制作用。磷恢復(fù)后，處理組細(xì)胞迅速恢復(fù)生長(zhǎng)，至72 h時(shí)，處理組和對(duì)照組基本持平，分別為3.66×107cell/mL和3.64×107cell/mL，至培養(yǎng)結(jié)束，二者之間沒有顯著差異（＞0.05）。

2.2 磷缺乏后補(bǔ)充銅綠微囊藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

磷缺乏7 d 后，對(duì)照組銅綠微囊藻（0.36）比處理組（0.22）高0.14，二者之間有顯著差異（＜0.05）。從磷恢復(fù)后的第12小時(shí)開始處理組開始顯著升高，直至試驗(yàn)結(jié)束，一直顯著高于對(duì)照組（＜0.05）（圖2）。

銅綠微囊藻變化如圖3所示，在磷缺乏7 d后，對(duì)照組微囊藻細(xì)胞顯著高于處理組（＜0.05），隨后處理組明顯升高，至培養(yǎng)結(jié)束，顯著高于對(duì)照組（＜0.01）。

經(jīng)7天磷缺乏處理后，對(duì)照組比處理組高0.02（圖4），但二者之間沒有顯著性差異 （＞0.05），隨后處理組中微囊藻逐漸上升，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)比對(duì)照組高0.02，仍不具有顯著差異（＞0.05）。

經(jīng)7d磷缺乏處理并未對(duì)銅綠微囊藻的ETR產(chǎn)生顯著影響（＞0.05），至磷恢復(fù)后第72小時(shí)，對(duì)照組與處理組銅綠微囊藻ETR分別為27.67和29.33，開始出現(xiàn)顯著性差異（＜0.05）；至培養(yǎng)結(jié)束，對(duì)照組與處理組的ETR分別為28.00和29.67，處理組比對(duì)照組高1.67，二者之間仍有顯著性差異（＜0.05）（圖5）。

3 討論

葉綠素?zé)晒馀c光合作用的各反應(yīng)過程緊密相關(guān)，可以反映出植物的光合生理狀態(tài)，以此反應(yīng)環(huán)境因子與植物光合作用的內(nèi)在聯(lián)系[12]。當(dāng)微藻受到環(huán)境脅迫時(shí)，光合作用過程受到影響，光合效率降低，藻細(xì)胞吸收的過剩光能通過熱量及熒光的形式散發(fā)出去[13]。葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)在光合作用基礎(chǔ)上，以植物葉綠素為探針，反映植物體內(nèi)光合生理狀態(tài)，為測(cè)定和觀察脅迫環(huán)境中藻類光合生理狀態(tài)提供可能[14]。研究表明，在生物脅迫檢測(cè)中、等指標(biāo)具有較好的靈敏反 應(yīng)[15]，可以深入了解環(huán)境脅迫對(duì)微藻光合效率，主要是PSII的影響。

本研究中，磷缺乏脅迫銅綠微囊藻7 d后，藻細(xì)胞密度、和都顯著低于對(duì)照組，處理組比對(duì)照組低0.14，銅綠微囊藻光合作用速率受到磷缺乏顯著影響。研究表明，小球藻（sp.）、微小亞歷山大藻（）受磷限制時(shí)，藻密度、葉綠素a含量和迅速降低[16-17]，培養(yǎng)9 d后，微小亞歷山大藻的降低了37.31%，與本研究結(jié)果基本一致。營(yíng)養(yǎng)鹽缺乏對(duì)藻類脅迫與作用時(shí)間有著密切關(guān)系，筒柱藻（sp.）葉綠素?zé)晒鈪?shù)、細(xì)胞密度、干質(zhì)量、總質(zhì)量及脂肪酸組成均隨著氮、磷缺乏時(shí)間延長(zhǎng)而顯著降低[18]。藻細(xì)胞降低表明磷缺乏可能引起銅綠微囊藻PSII反應(yīng)中心受損，阻礙光合電子傳遞過程，抑制光合作用的原初反應(yīng)。降低說明磷缺乏阻止了藻細(xì)胞同化力形成，進(jìn)而影響對(duì)碳固定與同化。

磷缺乏后補(bǔ)充可以顯著提高銅綠微囊藻的光合作用速率，尤其以和響應(yīng)最為迅速，自磷補(bǔ)充第12小時(shí)開始，處理組顯著高于對(duì)照組，在磷補(bǔ)充后期開始顯著升高。張達(dá)娟等研究表明，當(dāng)?shù)厝狈笱a(bǔ)充，最先做出響應(yīng)的熒光參數(shù)指標(biāo)也是和[19]，由此可見，和是對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽缺乏和補(bǔ)充較敏感的指標(biāo)。磷饑餓后補(bǔ)充使海洋小球藻（sp.）迅速上升，對(duì)磷“過度”吸收造成其有效電子產(chǎn)量大幅度升高[20]；使銅綠微囊藻大量吸收磷并儲(chǔ)存，待接近飽和時(shí)，光合作用加強(qiáng)，迅速生長(zhǎng)[21]。研究表明，銅綠微囊藻可在聚合磷酸合成酶的作用下將ATP轉(zhuǎn)化為聚合磷PolyP，作為儲(chǔ)存磷[18]，當(dāng)外源磷濃度不足時(shí)，會(huì)上調(diào)磷吸收相關(guān)基因和堿性磷酸酶編碼基因的表達(dá)，通過提高磷吸收速率和水解利用有機(jī)磷兩種途徑適應(yīng)低磷環(huán)境[22]，這可能是銅綠微囊藻能在天然水體中迅速占優(yōu)勢(shì)的主要原因。

本研究表明磷缺乏可以顯著抑制銅綠微囊藻的細(xì)胞密度及光合作用速率；磷補(bǔ)充后，銅綠微囊藻細(xì)胞密度及光合作用速率均有所升高，和等葉綠素?zé)晒鈪?shù)對(duì)磷營(yíng)養(yǎng)鹽缺乏后再補(bǔ)充具有良好的響應(yīng)作用。

[1] 易文利. 不同營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)銅綠微囊 藻生長(zhǎng)的室內(nèi)模擬研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2005.

[2] 王舉. 磷與微量元素共同作用對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)與產(chǎn)毒的影響研究[D]. 西安：西安建筑科技大學(xué)，2018.

[3] 許海，陳丹，陳潔，等. 氮磷形態(tài)與濃度對(duì)銅綠微囊藻和斜生柵藻生長(zhǎng)的影響[J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)，2019，39（6）：2560-2567.

[4] HARKE M J，BERRY D L，AMMERMAN J W，et al. Molecular Response of the Bloom-Forming Cyanobacterium，，to Phosphorus Limitation[J]. Microbial Ecology，2012，63（1）：188-198.

[5] 黃邦欽，黃世玉，翁妍，等. 溶解態(tài)磷在海洋微藻堿性磷酸酶活力變化中的調(diào)控作用[J]. 海洋學(xué)報(bào)，1999，21（1）：55-60.

[6] LI J，WANG Z， CAO X，et al. Effect of orthophosphate and bioavailability of dissolved organic phosphorous compoundsto typically harmful cyanobacterium Microcystis aeruginosa[J]. Marine Pollution Bulletin，2015，92（1-2）：52-58.

[7] HECKY R E，KILHAM P. Nutrient limitation of phytoplankton in fresh water and marine environments：A review of recent evidence on the effects of Enrichment[J]. Limnology and Oceanography，1988，33（4）：796-822.

[8] SZYMA?SKI D，ZIELI?SKA M，DUNALSKA J A. Microfiltration and ultrafiltration for treatment of lake water during algal blooms[J]. Ecohydrology and Hydrobiology，2019，3（19）：351-358.

[9] 張?zhí)m婷. 富營(yíng)養(yǎng)化藍(lán)藻水華發(fā)生的主要成因與機(jī)制研究綜述[J]. 水利發(fā)展研究，2019，19（5）：28-33.

[10] 孔繁翔，曹煥生，譚嘯. 水華藍(lán)藻復(fù)蘇的研究進(jìn)展與水華預(yù)測(cè)[J]. 環(huán)境監(jiān)控與預(yù)警，2010，2（1）：1-4.

[11] 張媛媛，戴偉，張樹林，等. 光照歷史對(duì)小檗堿化感抑藻效應(yīng)的影響[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志，2015，36（1）：88-93.

[12] 岑海燕，姚潔妮，翁海勇，等. 葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)在植物表型分析的研究進(jìn)展[J]. 光譜學(xué)與光譜分析，2018，38（12）：3773-3779.

[13] 梁英，金月梅，田傳遠(yuǎn). 磷限制及恢復(fù)對(duì)小球藻葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊慬J]. 南方水產(chǎn)，2008，4（4）：1-7.

[14] 胡豐姣，黃鑫浩，朱凡，等. 葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)技術(shù)在脅迫環(huán)境下的研究進(jìn)展[J]. 廣西林業(yè)科學(xué)，2017，46（1）：102-106.

[15] 陳蓮花，劉雷. 葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)在藻類光合作用中的應(yīng)用[J]. 江西科學(xué)，2007，25（6）：788-790，806.

[16] 許可. 不同氮磷濃度對(duì)普通小球藻生長(zhǎng)及光合作用的影響研究[D]. 西安：西安建筑科技大學(xué)，2018.

[17] LIPPEMEIER S，F(xiàn)RAMPTON D M F，BLACKBURN S I，et al. Influence of phosphorus limition on toxicity and photosynthesisi of（Dinophyceae） monitored by in-line detection of variable chlorophyll fluoeesence[J]. Journal of Phycology，2003，39（2）：320-331.

[18] 梁英，孟祥榮，孫明輝，等. 氮磷饑餓時(shí)間對(duì)筒柱藻生長(zhǎng)及總脂含量的影響[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2017，36（3）：249-258.

[19] 張達(dá)娟，張樹林，王澤斌，等. 氮補(bǔ)充對(duì)氮饑餓銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，50（11）：2592-2598.

[20] 宋麗娜. 營(yíng)養(yǎng)鹽濃度對(duì)海洋小球藻（sp.）葉綠素?zé)晒饧吧L(zhǎng)的影響[D]. 上海：華東師范大學(xué)，2010.

[21] 龐瑛. 四種水華藍(lán)藻磷吸收存儲(chǔ)機(jī)制研究[D]. 昆明：云南大學(xué)，2016.

[22] 魯男. 環(huán)境因子對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)及產(chǎn)毒的影響研究[D]. 沈陽(yáng)：遼寧大學(xué)，2015.

Effects of phosphorus supplements on the growth and chlorophyll fluorescence parameters of phosphorus deficiency

Zhang Dajuan, Zhang ShulinCorresponding Author, Dai Wei, Bi Xiangdong, Xu Yingfang, Wei Lingling

（Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

Phosphorus, an important element in algal cells, plays a vital role in the growth of algal, and is also an important limiting factor of cyanobacteria bloom. Effects of Simulated phosphorus supplement after deficiency on the growth and chlorophyll fluorescence parameters under laboratory conditions were carried out in this study. The results showed that, the cell density ofin the treatment group was 0.58×107cell/mL lower than that of control group significantly（＜0.05）after phosphorus deficiency 7 days. Thein the treatment group was also significantly lower than that of control group. After phosphorus supplement,grew fast, and the cell densities of both control and treatment groups were basically same by the end of the cultur, but the,andofin the treatment group were significantly higher than that of the control group. The results of this study can be used as a reference for the prevention and control ofbloom.

; phosphorus deficiency; phosphorus supplement; chlorophyll fluorescence parameters

1008-5394（2021）04-0031-04

10.19640/j.cnki.jtau.2021.04.008

S949

A

2020-04-14

天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（19JCYBJC30000）；天津市淡水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（ITTFRS2021000009）；天津市教委科研計(jì)劃項(xiàng)目（2021KJ110）；天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金項(xiàng)目（TD13-5089）

張達(dá)娟（1981—），女，實(shí)驗(yàn)師，博士，研究方向：養(yǎng)殖水環(huán)境調(diào)控與修復(fù)。E-mail：dajuanzhang@163.com。

張樹林（1963—），男，教授，博士，研究方向：養(yǎng)殖水環(huán)境調(diào)控與修復(fù)。E-mail：shulin63@sina.com。

責(zé)任編輯：張愛婷