勞凱雪 刁興華 黃 盈 劉春嬌 李清春 丁培輝 姜建喜 王雁林

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 山東 濱州 256603

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期女性常見的生殖內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，也是導(dǎo)致女性排卵障礙性不孕的重要原因[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)PCOS疾病是多因素共同作用的結(jié)果，包括內(nèi)分泌紊亂[2]、機(jī)體慢性炎癥[3]、遺傳因素[4]以及不良心理情緒等。PCOS患者常表現(xiàn)為卵巢早期卵泡發(fā)育過多，但卵泡因發(fā)育停滯而無優(yōu)勢(shì)卵泡形成[5]，是一種原發(fā)性的卵泡病。顆粒細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致卵泡閉鎖的直接重要原因[6]，也是PCOS卵泡發(fā)育異常的重要原因之一。顆粒細(xì)胞凋亡達(dá)10 %以上的發(fā)育卵泡提示該卵泡已經(jīng)或正在發(fā)生閉鎖，一旦卵泡發(fā)生閉鎖，便無法再回到正常發(fā)育軌道上[5]。

有研究證實(shí)，Wnt通路在調(diào)節(jié)卵巢發(fā)育、卵泡生長(zhǎng)等方面都起到重要的作用[7]，尤其是Wnt/β-catenin信號(hào)通路。Wnt信號(hào)通路對(duì)胚胎期小鼠卵巢發(fā)育具有重要作用[8]，Wnt4-/-雌性小鼠卵母細(xì)胞數(shù)量急劇下降至不到10%，卵巢發(fā)育不良且生殖能力降低[9]，敲除Wnt4相關(guān)分子RSPO1可導(dǎo)致大多數(shù)雌性小鼠不孕[10]。運(yùn)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，突變型小鼠卵巢中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)拮抗基因如Wif1、Nkd1以及Dkk4僅在卵泡樣病變部位的細(xì)胞中表達(dá)升高[11]，缺乏β-catenin的小鼠則卵巢發(fā)育不良[12]。前顆粒細(xì)胞的更新也依賴于支持細(xì)胞群體中的Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)[13]。Foxo3a作為叉頭框蛋白家族中的成員，可被Wnt通路激活[14]，并通過調(diào)控其下游P27、Cyclin D1、Puma、caspase3等信號(hào)分子影響顆粒細(xì)胞的增殖、凋亡功能[15-16]。本研究通過體外分離人卵巢顆粒細(xì)胞以探討Wnt/β-catenin/Foxo3a信號(hào)通路在多囊卵巢綜合征患者卵巢顆粒細(xì)胞異常中的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取在我院生殖醫(yī)學(xué)中心接受體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)或卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)助孕治療的35例患者為研究對(duì)象。將患者分為PCOS組(20例)和對(duì)照組(15例)。PCOS組采用鹿特丹診斷標(biāo)準(zhǔn)，符合以下3項(xiàng)中的2項(xiàng)即可診斷PCOS：①稀發(fā)排卵或者無排卵;②一側(cè)或者雙側(cè)卵巢表現(xiàn)為多囊樣改變;③雄激素增高或者有高雄激素的臨床表現(xiàn)。入組患者還需排除其他疾病患者，如庫欣綜合征、先天性腎上腺皮質(zhì)增生、服藥導(dǎo)致高雄激素血癥等。對(duì)照組為單純輸卵管性不孕且卵巢儲(chǔ)備功能正常的患者。

1.2 顆粒細(xì)胞的分離與純化 采用Percoll密度梯度離心法，將收集的卵泡液離心后胰酶消化5 min，PBS緩沖液洗滌，棄上清后用PBS緩沖液重懸顆粒細(xì)胞，緩慢平鋪于等體積50% Percoll液上，2 000 r/min離心20 min。吸凈白膜層，PBS緩沖液洗滌后，2 000 r/min離心5 min，棄去上清，所得沉淀即為顆粒細(xì)胞。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR 按照RNA-FAST試劑盒(Takara公司)說明書提取顆粒細(xì)胞總RNA，將獲得的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR Green PCR試劑盒(Takara公司)說明書將cDNA、SYBR Premix Ex Taq II(2×)、引物及dH2O混合至20 μL反應(yīng)體系。使用CFX 96實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)檢測(cè)，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，如此40個(gè)循環(huán)，于60℃～95℃生成溶解曲線，每個(gè)基因設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)所用引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 卵巢顆粒細(xì)胞中的β-catenin、Foxo3a表達(dá)水平 本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)了PCOS組與對(duì)照組卵巢顆粒細(xì)胞中β-catenin、Foxo3a的表達(dá)水平，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，PCOS組的β-catenin、Foxo3a的表達(dá)水平均升高，P<0.05,見圖1。

兩組比較，*P<0.05

2.2 卵巢顆粒細(xì)胞P27、Cyclin D1表達(dá)情況 為明確Foxo3a分子在PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞增殖中的作用，本研究檢測(cè)了Foxo3a下游分子P27、Cyclin D1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PCOS組患者卵巢顆粒細(xì)胞中P27的表達(dá)水平升高，P<0.01，見圖2A，而兩組顆粒細(xì)胞的Cyclin D1表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2B。

兩組比較，**P<0.01

2.3 卵巢顆粒細(xì)胞中Caspase3、Caspase8表達(dá)水平 為探索PCOS卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況，本研究檢測(cè)了PCOS組和對(duì)照組卵巢顆粒細(xì)胞Caspase3和Caspase8的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PCOS組的Caspase3、Caspase8表達(dá)水平均高于對(duì)照組，P<0.05，見圖3。

兩組比較，*P<0.05

3 討論

PCOS是育齡期婦女常見的內(nèi)分泌紊亂性疾病，在育齡期婦女中發(fā)病率為5.6%[17]，在無排卵不孕癥女性中占60%[18]。PCOS伴隨代謝和生殖軸激素分泌的異常，為一種原發(fā)性卵泡病，卵巢顆粒細(xì)胞的異常是PCOS疾病卵泡發(fā)育異常的重要原因[19]。有研究證實(shí)，PCOS患者卵泡發(fā)育過程中存在閉鎖以及顆粒細(xì)胞層退化、變薄的情況[20]。由于卵巢顆粒細(xì)胞與卵細(xì)胞關(guān)系密切，顆粒細(xì)胞的異?？蓪?dǎo)致對(duì)卵泡細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)支持、調(diào)節(jié)功能障礙，影響雌二醇、孕酮的分泌，從而對(duì)卵泡的整個(gè)發(fā)育過程造成影響[5]。

有研究證實(shí)，Wnt通路在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞代謝和干細(xì)胞維持等方面發(fā)揮著重要作用[21]， 并參與了卵巢顆粒細(xì)胞的增殖、凋亡及分泌功能的調(diào)控[15-16]。Wnt通路作為一種高度保守的信號(hào)通路，在細(xì)胞內(nèi)至少有三條[22]：β-catenin途徑、平面細(xì)胞極性通路和鈣離子通路[23-24]，其中與生殖密切相關(guān)的為Wnt/β-catenin信號(hào)通路[23]。Wnt通路激活后，Wnt與受體Frizzled和LRP5/6結(jié)合，激活Dsh磷酸化，從而傳遞信號(hào)至細(xì)胞內(nèi)，抑制APC、GSK-3D、Axin和β-catenin形成的復(fù)合物激酶活性，使胞質(zhì)內(nèi)β-catenin表達(dá)升高，向細(xì)胞核內(nèi)移位，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF家族形成復(fù)合物，啟動(dòng)Cyclin D1、c-myc等靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響細(xì)胞功能[14]。本研究發(fā)現(xiàn)PCOS組卵巢顆粒細(xì)胞β-catenin分子表達(dá)升高，提示W(wǎng)nt經(jīng)典途徑參與了PCOS卵巢顆粒細(xì)胞異常機(jī)制的調(diào)控。有研究表明，作為叉頭框蛋白家族中成員的Foxo 3a被Wnt通路激活后能明顯促進(jìn)人卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡、抑制細(xì)胞增殖，而Wnt通路抑制劑作用效果相反[14]。Foxo3a被活化后可改變細(xì)胞核內(nèi)P27和Cyclin D1的表達(dá)以調(diào)控細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖[14-15]。Foxo 3a還可通過調(diào)控前凋亡蛋白Bim、FasL、Puma等凋亡分子以激活凋亡蛋白酶Caspase3和Caspase8，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。目前研究表明，細(xì)胞凋亡有兩條信號(hào)傳導(dǎo)途徑，包括內(nèi)源性凋亡通路和外源性死亡受體通路[25-26]。本文研究發(fā)現(xiàn)PCOS組顆粒細(xì)胞Foxo 3a表達(dá)升高，其下游調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的P27及凋亡相關(guān)分子Caspase3、Caspase8表達(dá)均升高，提示PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞增殖能力下降、外源性凋亡通路引起的凋亡增加，說明Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)Foxo 3a分子的調(diào)控能引起PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞增殖、凋亡異常，進(jìn)而導(dǎo)致PCOS患者卵泡發(fā)育的異常。

綜上所述，PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞異常與Wnt信號(hào)通路有關(guān)，Wnt/β-catenin/Foxo 3a軸為治療PCOS疾病的潛在靶點(diǎn)，這將為PCOS疾病的治療提供新的理論思路。