劉陽陽

新泰市人民醫(yī)院腫瘤科 山東 泰安 271200

食管癌是世界上第七大惡性腫瘤，在我國是第四大癌癥相關(guān)死亡原因[1]，由于缺乏典型癥狀，初診時往往為晚期。食管鱗狀細(xì)胞癌和食管腺癌對系統(tǒng)治療具有固有的耐受性，一線治療后反應(yīng)有限[2]。靶向藥物在食管癌中的應(yīng)用非常有限，而且僅在靶向人類表皮生長因子受體2(human epidermalgrowth factor receptor-2,HER2)或血管內(nèi)皮生長因子的食管腺癌中使用[3]，目前沒有證據(jù)表明靶向治療對食管鱗癌有明顯的益處。雖然傳統(tǒng)的治療方法已經(jīng)得到了改進(jìn)，但是5年的總生存率仍然很低，僅為30%～40%[4]。迫切需要新的治療方法來改善這種疾病的預(yù)后。免疫治療是食管癌治療中一個相對較新的領(lǐng)域。隨著免疫治療KEYNOTE-181、ATTRACTION-3 和 ESCORT 結(jié)果的發(fā)布，確立了免疫治療在晚期食管癌一線及二線治療的地位[5-8]。免疫治療改善了晚期食管癌患者的預(yù)后，但是只有約20% 的患者會對免疫檢查點抑制劑產(chǎn)生反應(yīng)[5]，尋找可以準(zhǔn)確預(yù)測免疫治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物具有重大的臨床意義。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)是從表達(dá)上皮組織特點的腫瘤細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)性變，突破基底膜侵入血管內(nèi)在血液中循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，已被用作監(jiān)測前列腺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌放化療治療效果和預(yù)后，是一種有前途的生物標(biāo)志物[9]。有研究報道，CTC用于預(yù)測肺癌免疫治療效果提示預(yù)后[10]，但對于食管癌免疫治療效果及預(yù)后有何種提示作用不得而知。本研究旨在探討CTC檢測在預(yù)測晚期食管癌免疫治療效果及預(yù)后的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料 以新泰市腫瘤治療中心2019年2月至2020年1月收治的48例接受免疫治療的晚期食管癌患者為研究對象，分別在治療前(CTC1)、治療2個周期(CTC2)采集血標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理科確診；患者年齡≥18周歲，美國東部腫瘤協(xié)作組(eastern cooperative oncology group, ECOG)評分≤2；預(yù)期生存時間≥4個月；無手術(shù)指征，一線治療方案為靶向或化學(xué)治療后病情進(jìn)展；根據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)有可測量的病灶；能合作觀察不良事件和療效；受試者無主要器官的功能障礙，無免疫相關(guān)疾病；血常規(guī)、肝、腎功能及心臟功能正常；簽署書面知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在免疫藥物過敏史；因患精神病或其它原因不能依從治療程序。本實驗經(jīng)新泰市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 CTC富集和計數(shù) 采用陰性富集聯(lián)合熒光原位雜交進(jìn)行檢測。收集上肢正中靜脈7.5 mL血液加入ACD抗凝管中， Cyttel?人外周血白細(xì)胞去除試劑盒(江蘇萊爾生物醫(yī)藥科技有限公司)陰性富集CTC，后CF1固定，在2×檸檬酸鈉鹽(SSC)中37℃作用10 min，75%、85%、100%乙醇梯度脫水，每梯度2 min，然后加入CEP8熒光原位雜交探針(上海群己生物科技有限公司)，置入雜交儀通過變性、雜交后洗去未結(jié)合探針，加入Alexa Fluor 594標(biāo)記抗人CD45抗體(南京拜恩特斯生物科技公司生產(chǎn))室溫孵育1 h，加入4、6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，上海九嶺化工有限公司生產(chǎn))染色觀察。目前尚無國際標(biāo)準(zhǔn)化判定標(biāo)準(zhǔn)，本研究以CTC數(shù)目≥3個結(jié)果判定陽性。同時滿足有細(xì)胞核，即DAPI陽性(藍(lán)色)視為CTC陽性細(xì)胞，如圖1。

圖1 典型CTC陽性細(xì)胞圖像

1.2.2 免疫治療方法 免疫方案二線采用卡瑞利珠單抗200 mg Q 21d方案。免疫治療前、用藥2周期后進(jìn)行2次CTC檢測；同時每2周期完善影像學(xué)檢查，計算患者免疫治療前后CTC陽性率，并分析CTC數(shù)目變化與免疫治療效果的關(guān)系。參照實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)(response evaluation criteria in solid tumor，RECIST)1.1 療效評價[11]：完全緩解(complete response，CR)，所有靶病灶消失，無新病灶出現(xiàn)，且腫瘤標(biāo)志物正常，至少維持4周；部分緩解(partial response，PR)，靶病灶最大徑之和減少≥30%，至少維持4周；疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)，靶病灶最大徑之和縮小未達(dá)PR或增大未達(dá)疾病進(jìn)展(progressive disease，PD)；PD，靶病灶最大徑之和至少增加≥20%或出現(xiàn)新病灶。疾病控制率(disease control rate，DCR)是指腫瘤縮小到一定程度或病變穩(wěn)定保持4周的病人的比例，包含CR、PR和SD病例。

2 結(jié)果

2.1 晚期食管患者臨床特征基線CTC計數(shù) 本研究食管癌患者典型CTC圖像見圖1。CTC計數(shù)結(jié)果顯示，晚期食管鱗癌Ⅳ期患者CTC陽性。

2.3 基線CTC與近期療效、無進(jìn)展生存及總生存的關(guān)系 近期療效參照RECIST 1.1評價標(biāo)準(zhǔn)，療效CR者0例，PR者7例，SD者20例，PD者21例，DCR(CR+PR+SD)共27例，占56.2%。在DCR組中CTC陽性表達(dá)率為70.4%，在PD患者中陽性表達(dá)率為66.7%。免疫治療前CTC與治療后近期療效差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 CTC數(shù)目與食管癌患者免疫療效的關(guān)系/例

48例患者免疫治療前進(jìn)行了CTC檢測，CTC陽性組的中位無進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)為6.3個月，CTC陰性組的中位PFS為5.6個月，見圖2。治療前CTC陽性組的中位總生存期(overall survival，OS)為10.7個月(9.6～14.7月)，CTC陰性組的中位OS為12.6個月(11.7～17.5月)，見圖3。

圖2 基線CTC陽性組與陰性組PFS比較

圖3 基線CTC陽性組與陰性組OS比較

Log-rank檢驗結(jié)果提示，CTC分組的PFS及OS分布的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；Cox回歸結(jié)果提示，CTC分組的PFS及OS分布的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 治療后CTC與近期療效、PFS和OS的相關(guān)性 免疫治療后患者CTC數(shù)目比治療前CTC上升22例、下降26例。治療后CTC上升組DCR率為13.6%，治療后CTC下降組DCR率為92.3%，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.01)，見表3。CTC升高組的中位PFS為6.3個月；CTC降低組的中位PFS為8.6個月(圖4)。CTC升高組的中位OS生存時間為10個月；CTC降低組的中位生存時間為15個月(圖5)。Log-rank檢驗結(jié)果提示，CTC分組的生存時間分布的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Cox回歸結(jié)果提示，CTC分組的生存時間分布的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CTC降低組預(yù)后更好。

表3 免疫治療后CTC數(shù)目變化與療效的關(guān)系

圖4 治療后CTC升高組與降低組PFS比較

圖5 治療后CTC升高組與降低組OS比較

3 討論

食管癌的臨床治療主要包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療及其綜合治療。新輔助放化療和靶向治療的使用提高了總生存率。然而，由于臨床診斷為食管癌時，約有一半的患者有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，手術(shù)不再適用[12]。轉(zhuǎn)移性食管癌預(yù)后較差，以往治療以化療為主，標(biāo)準(zhǔn)5-氟尿嘧啶和順鉑為基礎(chǔ)的一線姑息治療后的中位OS為7～10個月[4]。免疫檢查點蛋白程序性死亡(PD)-1抑制劑已被證明可增強包括食管癌在內(nèi)的幾種癌癥中T細(xì)胞的抗腫瘤活性[13]。ATTRACTION-3[7]試驗及Keynote-181[8]分別證實nivolumab可能代表了一種新的標(biāo)準(zhǔn)二線治療選擇與pembrolizumab作為PD-L1和聯(lián)合陽性分?jǐn)?shù)(combined positive score，CPS)≥10的食管癌新的二線治療標(biāo)準(zhǔn)。除此之外我國自主研發(fā)的卡瑞利珠單抗和特瑞普利單抗在食管癌治療中也顯示初良好的效果[14]。同時這些抗PD-1抗體顯示出比化療藥物更有利的安全性。但是，接受免疫治療的患者中有一部分可能會出現(xiàn)嚴(yán)重免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致預(yù)后不良。另外目前CPS、腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutation burden，TMB)表達(dá)這些晚期食管鱗癌患者的治療反應(yīng)的預(yù)測性生物標(biāo)志物尚不能滿足臨床需要，并且無法及時發(fā)現(xiàn)耐藥，指導(dǎo)優(yōu)化治療策略。迄今為止，一些生物標(biāo)志物已被廣泛用于食管癌診斷和預(yù)后，包括癌胚抗原(CEA)、癌抗原19-9(CA19-9)和癌抗原72-4(CA72-4)[16]。然而，這些生物標(biāo)志物的陽性率不到40%，其敏感性和特異性適中[17]。在這方面，CTC成為監(jiān)測治療反應(yīng)和實時提供進(jìn)展信息的有希望的標(biāo)志物[18]。本研究探討了CTC在預(yù)測晚期食管癌患者免疫治療反應(yīng)和預(yù)后中的應(yīng)用價值。

CTC是從原發(fā)性腫瘤中分離出來并通過血管系統(tǒng)傳播的細(xì)胞。先前的研究表明，在許多情況下，CTC的擴散和遷移是建立遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的主要原因[10]。CTC在轉(zhuǎn)移前就存在于體液中，它們可能被用作未來轉(zhuǎn)移形成的預(yù)測指標(biāo)[10]。本研究顯示Ⅳ期多臟器轉(zhuǎn)移晚期食管癌患者CTC陽性率高于單發(fā)轉(zhuǎn)移食管癌患者(P<0.05)。同時本研究發(fā)現(xiàn)治療前CTC并不能反映近期療效及無進(jìn)展生存和總生存，DCR組中基線CTC陽性表達(dá)率為70.4%，在PD患者中基線陽性表達(dá)率為66.7%。免疫治療前CTC與治療后近期療效差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05，Log-rank檢驗及Cox回歸結(jié)果提示，CTC分組的PFS及OS分布的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。但是否與診斷后治療相關(guān)還是其他因素還需進(jìn)一步實驗證實。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)晚期非小肺癌患者行CTC和cfDNA實時連續(xù)監(jiān)測，為治療后的反應(yīng)和總生存率提供了有用的補充預(yù)測和預(yù)后信息[19]。

食管癌治療過程中關(guān)于CTC監(jiān)測的多項研究報道，在化療或放化療前后通過進(jìn)行CTC計數(shù)是一種很有前途的預(yù)測性生物標(biāo)記物[9]。免疫治療的機制不同于其他治療，而且在免疫治療后的短期內(nèi)腫瘤負(fù)荷增加或出現(xiàn)新的病灶已經(jīng)得到證實。因此，傳統(tǒng)的評價原則是否仍然適用于免疫治療仍然需要進(jìn)一步的證實。有研究顯示免疫檢查點阻斷治療后CTC水平可有效預(yù)測晚期胃癌預(yù)后不良[9]。多變量COX分析表明，兩個周期免疫治療后獲得的CTC計數(shù)是第IV周期后中期評估結(jié)果與早期疾病進(jìn)展相關(guān)的唯一獨立因素。

本研究表明治療后CTC變化可反映近期療效、無進(jìn)展生存及總生存。免疫治療后CTC上升組DCR率13.6%，下降組DCR率為92.3%，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。CTC升高組的中位PFS為6.3個月，CTC降低組的中位PFS為8.6個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。CTC升高組的中位OS生存時間為10個月；CTC降低組的中位生存時間為15個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。因此，CTC在治療后效果監(jiān)測中的應(yīng)用是非常有前景的，另外CTC檢測是一種有效、無創(chuàng)的腫瘤檢測系統(tǒng)，方便患者治療后病情的密切監(jiān)測[10]。同時本研究發(fā)現(xiàn)治療前基線CTC狀態(tài)無法預(yù)測患者治療效果及提示預(yù)后。目前的研究建議治療后2～3周期CTC計數(shù)[15]，以提供重要的預(yù)測信息，為制定個體化診療決策提供依據(jù)，避免度過度診療。

本研究結(jié)果提示治療后CTC的變化對晚期食管癌免疫治療的近期療效、無進(jìn)展生存及總生存具有一定的預(yù)測價值。但本實驗納入的樣本數(shù)少，需要開展更大樣本的實驗證實。