游興文,王秀琴,王艷虹,楊敏,李鴻超,楊林青

(1 濮陽市油田總醫(yī)院婦產(chǎn)科,河南 濮陽 457001；2 濮陽市油田總醫(yī)院病理科；3 許昌學(xué)院)

宮頸癌是發(fā)病率位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤首位的一類婦科腫瘤，其病死率逐年升高且呈年輕化趨勢[1]。我國也是宮頸癌的高發(fā)國家[2]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細(xì)胞獲得具備侵襲鄰近組織的生物學(xué)特性，從而在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[3]。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)等是EMT的重要標(biāo)志性因子，在多種腫瘤中異常表達(dá)[4-6]?；虺聊夹g(shù)通過調(diào)控基因表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平上阻斷特定基因的異常表達(dá)，可達(dá)到對特定基因的外源性表達(dá)調(diào)控，進而發(fā)揮治療疾病的作用[7]。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/PKB蛋白激酶(又稱AKT)信號通路是一類在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮促進細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡作用的細(xì)胞存活相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[8]。臨床對于通過基因沉默干預(yù)相關(guān)基因表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在宮頸癌EMT的研究已有部分報道[9-11]，但對于磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸肌醇-3-激酶(PIK3CA)基因沉默介導(dǎo)PI3K/AKT信號通路對宮頸癌EMT的影響卻鮮有報道。本研究通過探究人宮頸癌組織和細(xì)胞中PIK3CA的表達(dá)，并通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染和基因沉默，確認(rèn)PIK3CA基因沉默介導(dǎo)PI3K/AKT信號通路對宮頸癌EMT的影響，以期為宮頸癌病人的分子治療方案提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1主要試劑與儀器 人宮頸癌細(xì)胞系HeLa(中國科學(xué)院上海生物研究所)，正常人宮頸鱗狀上皮細(xì)胞CRL-2614(美國典型菌種保藏中心，ATCC)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)；Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美國)；免疫組化抗體(Abcam，劍橋，英國)；Trizol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程有限公司，大連)；PCR引物(深圳華大基因有限公司合成)；蛋白質(zhì)印跡(Western blot)抗體(abcam公司，英國)；化學(xué)發(fā)光后凝膠成像系統(tǒng)(北京六一凝膠成像儀)；Quantity One軟件(BIO-RAD公司，美國)；噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)溶液(Sigma公司，美國)；酶標(biāo)儀(BioTek公司，美國)；Annexin-V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和碘化丙啶(PI)染料(Sigma公司，美國)；流式細(xì)胞儀(Coulter Corporation公司，美國)。

1.1.2臨床標(biāo)本 收集我院2016年1月—2019年1月經(jīng)病理檢查證實的188例宮頸癌病人(年齡27～69歲，平均(52.32±6.50)歲)癌組織及癌旁組織標(biāo)本。所有病人臨床資料完整，均排除其他系統(tǒng)腫瘤，術(shù)前均未接受抗腫瘤治療。本研究已通過本院倫理委員會批準(zhǔn)，均取得病人及其家屬同意，采取自愿原則并簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1免疫組化檢測 將宮頸癌及癌旁組織經(jīng)甲醛固定，進行石蠟包埋，厚度3 μm連續(xù)切片，70 ℃烤片15 min，梯度乙醇脫水，PBS漂洗3次。用正常山羊血清室溫孵育15 min。滴加20～30 μL以PBS稀釋的PIK3CA一抗，4 ℃孵育過夜，用PBS替代第一抗體作陰性對照。加入二抗，于37 ℃下孵育45 min，DAB顯色5～10 min。蘇木精復(fù)染后，進行脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。免疫組化檢查結(jié)果判定：由高年資病理醫(yī)師閱片，采用雙盲法分別判斷。按癌細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色強弱計分：陰性為0分；淡黃色染色為1分；中度黃色染色為2分；棕黃色染色為3分。按照陽性細(xì)胞率計分：陽性細(xì)胞≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；>50%為3分。各基因蛋白表達(dá)強度基于染色深淺和陽性細(xì)胞率綜合判定，以兩者的乘積≥3分為陽性表達(dá)，<3分為陰性表達(dá)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與篩選 人宮頸癌細(xì)胞系HeLa培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，進行傳代培養(yǎng)，置含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。采用實時定量PCR(qRT-PCR)檢測PIK3CA相對表達(dá)量。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 選擇培養(yǎng)生長至對數(shù)生長期的細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液接種于6孔板，給予新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為50%～80%時進行轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染依據(jù)Lipofectamine 2000使用說明進行，配制轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒或載體的復(fù)合物(200 μL)，混勻后轉(zhuǎn)染，置含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)6 h，換含有血清的正常培養(yǎng)基。將細(xì)胞分為如下6組：Blank組(a組：人宮頸癌細(xì)胞)、NC組(b組：人宮頸癌細(xì)胞+轉(zhuǎn)染空白載體質(zhì)粒)、HA-PIK3CA組(c組：人宮頸癌細(xì)胞+PIK3CA過表達(dá)載體)、PIK3CA-siRNA組(d組：人宮頸癌細(xì)胞+轉(zhuǎn)染PIK3CA抑制表達(dá)質(zhì)粒)、LY294002組(e組：人宮頸癌細(xì)胞+PI3K/AKT信號通路拮抗劑)以及LY294002+PIK3CA-siRNA組(f組：人宮頸癌細(xì)胞+PI3K/AKT信號通路拮抗劑+轉(zhuǎn)染PIK3CA-siRNA質(zhì)粒)，進行后續(xù)實驗。

1.2.4qRT-PCR檢測 取臨床標(biāo)本并收集轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞、組織中總RNA，測定RNA的濃度和純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將樣品RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。在cDNA中加入65 μL的DEPC水稀釋，并充分混勻，配制Real-time PCR反應(yīng)體系。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火5 s，共循環(huán)30次；72 ℃延伸5 s。以GAPDH為內(nèi)參照，每個樣品的每個基因設(shè)3個復(fù)孔。按 2-△△Ct方法計算目的基因相對表達(dá)量。

1.2.5Western blot檢測 收集轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，加入裂解液。冰浴中勻漿粉碎，離心提取上清，為總蛋白提取液。取細(xì)胞總蛋白進行 SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至 PVDF膜，TBST 洗膜 1 次。采用50 g/L脫脂奶粉封閉，搖床孵育2 h后，TBST洗膜，加入以封閉液稀釋的一抗(PIK3CA、PI3K、AKT、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和GAPDH)，4 ℃搖床孵育過夜。室溫下TBST洗膜后，加入稀釋的經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育?；瘜W(xué)發(fā)光后凝膠成像系統(tǒng)成像，保存圖片。采用Quantity One軟件測定灰度值。

1.2.6MTT檢測 收集轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，按一定密度稀釋細(xì)胞并制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度后接種于96孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24、48、72 h。隨后每孔避光加入10 μL的 MTT溶液孵育4 h。小心吸出培養(yǎng)液，每孔避光加入100 μL的DMSO溶液。振蕩避光溶解后，用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處各孔吸光度(A)值，并繪制細(xì)胞活力曲線圖。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞于流式管后離心，棄上清。用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次，離心棄上清。按照Annexin-V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的說明，向每管細(xì)胞中加入5 μL的 Annexin-V-FITC，振蕩混勻；避光，室溫孵育后再加入5 μL的PI染料，振蕩混勻。1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 人宮頸癌組織PIK3CA蛋白表達(dá)及其與臨床病理特征關(guān)系

PIK3CA蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞為淺黃色至棕黃色樣顆粒物質(zhì)，見圖1。PIK3CA蛋白在188例人宮頸癌組織陽性表達(dá)119例(63.30%)，癌旁組織為41例(21.80%)，癌組織的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織(χ2=23.581，P<0.05)。此外，PIK3CA蛋白表達(dá)與宮頸癌病人TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級均有關(guān)(χ2=6.766～31.171，P均<0.05)，而與年齡、原發(fā)灶大小及病理組織類型無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 人宮頸癌組織PIK3CA蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(n=188，例)

2.2 宮頸癌細(xì)胞株中PIK3CA基因的表達(dá)水平

qRT-PCR法檢測HeLa細(xì)胞株中的PIK3CAmRNA表達(dá)的結(jié)果顯示，HeLa細(xì)胞株P(guān)IK3CAmRNA表達(dá)量明顯高于正常人宮頸鱗狀上皮細(xì)胞(t=14.59，P<0.05)。見圖2。

與正常人宮頸鱗狀上皮細(xì)胞表達(dá)水平相比，*P<0.05。

2.3 沉默PIK3CA對宮頸癌細(xì)胞PI3K/AKT通路激活的影響

實驗結(jié)果表明，在HeLa細(xì)胞系中，與NC組和Blank組相比，PIK3CA-siRNA組、LY294002組和LY294002+PIK3CA-siRNA組PIK3CA、PI3K、AKT的mRNA和蛋白相對表達(dá)量均明顯降低(FmRNA=105.7～176.1，F(xiàn)蛋白=125.8～130.5，P均<0.05)，HA-PIK3CA組mRNA和蛋白相對表達(dá)量均呈升高趨勢(FmRNA=43.7～347.2，F(xiàn)蛋白=87.2～302.6，P<0.05)；與PIK3CA-siRNA組和LY294002組相比，LY294002+PIK3CA-siRNA組中各基因的mRNA和蛋白相對表達(dá)量均顯著降低(FmRNA=64.8～206.3，F(xiàn)蛋白=50.9～96.5，P<0.05)。而NC組和Blank組、PIK3CA-siRNA組和LY294002組比較，差異均無顯著意義(P均>0.05)。見圖3。

A：qRT-PCR檢測mRNA表達(dá)。B：Western blot檢測蛋白表達(dá)。C：相關(guān)信號蛋白表達(dá)比較。a：Blank組，b：NC組，c：HA-PIK3CA組，d：PIK3CA-siRNA組，e：LY294002組，f：LY294002+PIK3CA-siRNA組。與NC組和Blank組相比，*P<0.05；與PIK3CA-siRNA組和LY294002組相比，#P<0.05。

2.4 沉默PIK3CA對宮頸癌細(xì)胞EMT相關(guān)因子的影響

實驗結(jié)果顯示，與Blank組和NC組相比，HA-PIK3CA組的E-cadherinmRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低，N-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯增加(FmRNA=131.7～209.3，F(xiàn)蛋白=69.7～286.3，P均<0.05)；而PIK3CA-siRNA組、LY294002組和LY294002+PIK3CA-siRNA組E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加，N-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低(FmRNA=158.5～185.1，F(xiàn)蛋白=107.7～148.1，P均<0.05)。與PIK3CA-siRNA組和LY294002組相比，LY294002+PIK3CA-siRNA組的E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加，N-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著降低(FmRNA=32.9～83.5，F(xiàn)蛋白=47.6～66.3，P均<0.05)。而NC組和Blank組比較、PIK3CA-siRNA組和LY294002組比較，差異均無顯著性(P均>0.05)。見表2和圖4。

表2 PIK3CA對各組細(xì)胞的EMT相關(guān)因子mRNA和蛋白表達(dá)的影響

a：Blank組，b：NC組，c：HA-PIK3CA組，d：PIK3CA-siRNA組，e：LY294002組，f：LY294002+PIK3CA-siRNA組。

2.5 沉默PIK3CA對宮頸癌細(xì)胞增殖的影響

檢測結(jié)果顯示，與NC組和Blank組相比，HA-PIK3CA組過表達(dá)PIK3CA可明顯促進細(xì)胞增殖(F=24.6～32.1，P均<0.05)；PIK3CA-siRNA組、LY294002組和LY294002+PIK3CA-siRNA組細(xì)胞增殖均受到明顯地抑制(F=28.0～98.8；P均<0.05)。與PIK3CA-siRNA組和LY294002組相比較，LY294002+PIK3CA-siRNA組細(xì)胞增殖均受到顯著抑制(F=28.5～104.6，P均<0.05)。而NC組和Blank組相比較、PIK3CA-siRNA組和LY294002組比較，差異均無顯著性(P均>0.05)。見圖5。

表示與NC組和Blank組相比，*P<0.05；與PIK3CA-siRNA組和LY294002組相比，#P<0.05。

2.6 沉默PIK3CA對宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果顯示，與NC組和Blank組比較，HA-PIK3CA組細(xì)胞凋亡率明顯下降(F=45.1，P<0.05)，PIK3CA-siRNA組、LY294002組和LY294002+PIK3CA-siRNA組凋亡率均明顯上升(F=213.9，P<0.05)。與PIK3CA-siRNA組和LY294002組細(xì)胞相比，LY294002+PIK3CA-siRNA組的上升趨勢更明顯(F=54.9，P<0.05)。NC組和Blank組、PIK3CA-siRNA組和LY294002組的細(xì)胞凋亡率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>均0.05)。見圖6。

與NC組和Blank組相比，*P<0.05；與PIK3CA-siRNA組和LY294002組相比，#P<0.05。

圖6 轉(zhuǎn)染后各組宮頸癌細(xì)胞株細(xì)胞凋亡能力變化

3 討 論

宮頸癌發(fā)病率位居婦科腫瘤首位，其轉(zhuǎn)移成為影響病人預(yù)后的重要因素[12]。宮頸癌來源于上皮組織，EMT在其轉(zhuǎn)移過程中扮演重要角色[13]。多數(shù)上皮性腫瘤周圍細(xì)胞多呈間質(zhì)細(xì)胞表型[14]，表現(xiàn)出較強的增殖、侵襲能力[15]，可侵襲腫瘤組織周圍正常組織，刺激腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致病人病情惡化、預(yù)后不良[16-17]。抑制腫瘤EMT對于改善病人治療效果和提升預(yù)后尤為重要[18]。近期研究顯示，靶向PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子拮抗劑可結(jié)合順鉑聯(lián)合化療改善PIK3CA突變的宮頸癌的治療效果[19]，為基于該病精準(zhǔn)藥物的新型治療策略提供重要參考和啟示。PI3K是重要的胞內(nèi)激酶[20]，Akt又稱蛋白激酶B，是PI3K的下游關(guān)鍵因子[21]，二者構(gòu)成的信號通路在腫瘤細(xì)胞生長、侵襲、凋亡等過程中作用顯著。既往研究結(jié)果表明，PI3K/AKT信號通路在腫瘤細(xì)胞中被激活，可通過多重機制參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[22-23]。作為PI3K催化亞基的編碼基因，PIK3CA基因已被證實是上消化道癌、膠質(zhì)細(xì)胞瘤、卵巢癌、乳癌等多種腫瘤的癌基因[24-27]。同時，PIK3CA基因在宮頸癌中的表達(dá)日益?zhèn)涫荜P(guān)注[28]。目前已有報道PI3K/AKT信號通路可誘導(dǎo)多類上皮細(xì)胞惡性腫瘤發(fā)生EMT，如胃癌、肺癌、宮頸癌等，而阻斷該通路可抑制上述現(xiàn)象[29]。然而，目前有關(guān)PIK3CA基因介導(dǎo)PI3K/AKT信號通路對宮頸癌EMT影響的研究較少。

本實驗基于前期研究結(jié)果和基因沉默技術(shù)，選取與宮頸癌相關(guān)PIK3CA基因，假設(shè)沉默該基因可抑制PI3K/AKT信號通路激活，進而抑制EMT，從而抑制宮頸癌進展。本研究首先通過組織檢測顯示，與癌旁組織相比，癌組織中PIK3CA表達(dá)顯著升高，且PIK3CA蛋白表達(dá)與宮頸癌病人TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級均有關(guān)，提示PIK3CA陽性表達(dá)與宮頸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)。同時，宮頸癌細(xì)胞檢測結(jié)果亦表明PIK3CA高表達(dá)，證實宮頸癌中PIK3CA發(fā)揮癌基因作用，其高表達(dá)可誘導(dǎo)宮頸癌發(fā)生。本研究推測PIK3CA基因沉默和PI3K/AKT信號通路拮抗劑可逆轉(zhuǎn)這一不良結(jié)局，而細(xì)胞實驗結(jié)果則進一步驗證了這一假設(shè)。

本文細(xì)胞實驗結(jié)果表明，沉默PIK3CA表達(dá)、PI3K/AKT信號通路拮抗劑LY294002以及二者聯(lián)合處理可抑制PIK3CA、PI3K和AKT表達(dá)；且與沉默PIK3CA基因表達(dá)或者通路拮抗劑結(jié)果相比，二者聯(lián)合處理各指標(biāo)變化趨勢更為顯著；而上調(diào)PIK3CA表達(dá)可逆轉(zhuǎn)上述指標(biāo)表達(dá)趨勢。提示可通過特異性siRNA干擾序列處理，實現(xiàn)對宮頸癌生長轉(zhuǎn)移的抑制，且其作用機制可能與抑制PI3K/AKT信號通路激活相關(guān)。為進一步證實PIK3CA基因沉默對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，本文觀察了不同處理后宮頸癌細(xì)胞EMT、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的變化。研究結(jié)果顯示，沉默PIK3CA表達(dá)、PI3K/AKT信號通路拮抗劑LY294002以及二者聯(lián)合處理可下調(diào)N-cadherin和Vimentin表達(dá)，上調(diào)E-cadherin表達(dá)，降低細(xì)胞增殖活性，增加細(xì)胞凋亡；而且二者聯(lián)合處理的趨勢更為顯著；而上調(diào)PIK3CA表達(dá)后各指標(biāo)變化趨勢逆轉(zhuǎn)。提示在mRNA和蛋白水平上，沉默PIK3CA基因表達(dá)能夠抑制宮頸癌細(xì)胞EMT，抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，并促進細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果最終佐證，PIK3CA基因沉默對宮頸癌細(xì)胞上述生物學(xué)特性的作用可能與抑制PI3K/AKT信號通路的激活相關(guān)。我們推測PIK3CA基因沉默后，抑制PI3K/AKT信號通路激活，通過上調(diào)E-cadherin表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生金屬蛋白酶，抑制蛋白降解，從而阻止腫瘤細(xì)胞穿透基質(zhì)、基底膜[30]；通過下調(diào)N-cadherin和Vimentin表達(dá)，從而抑制細(xì)胞分化[31]；進而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的轉(zhuǎn)變，最終抑制腫瘤生長。本研究與秦海霞等[32]報道PIK3CA抑制宮頸癌細(xì)胞增殖及遷移的機制，可能與miRNA-375靶向調(diào)控其表達(dá)有關(guān)類似，提示PIK3CA在宮頸癌發(fā)病中的作用。

總之，本研究顯示沉默PIK3CA基因表達(dá)可能通過抑制PI3K/AKT信號通路的激活，抑制宮頸癌EMT和細(xì)胞增殖，并促進細(xì)胞凋亡。本研究從分子生物學(xué)角度為尋求改良宮頸癌病人預(yù)后和治療新思路提供了新的實驗證據(jù)。然而，本研究有關(guān)沉默PIK3CA基因表達(dá)抑制PI3K/AKT信號通路的分子機制探究僅在細(xì)胞實驗中證實，有待未來動物實驗的驗證并可建立與當(dāng)前研究熱點microRNA的聯(lián)系，以期為宮頸癌分子靶向治療提供潛在參考。