徐蘊(yùn)桃，孫顏君，劉振民*，萬(wàn)嗣寶，王吉棟

1(光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院, 乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心, 上海, 200436) 2(上海大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 上海, 200444)

酪乳(buttermilk，BM)是黃油生產(chǎn)加工中奶油經(jīng)過(guò)攪打后釋放出的水相成分，其蛋白、灰分、乳糖的含量與脫脂乳(skim milk，SM)相似[1]，但酪乳中含有大量乳脂肪球膜(milk fat globule membrane，MFGM)，其極性脂質(zhì)(polar lipid，PL)含量約為脫脂乳的6倍[2-3]。由于被攪打奶油的品種不同，酪乳有很多種類(lèi)，不同國(guó)家和地區(qū)對(duì)酪乳的定義不同[4]，但對(duì)酪乳最基本的定義是“攪打甜奶油得到的水相”。酪乳每年的產(chǎn)量很高，資源豐富，據(jù)統(tǒng)計(jì)2012年加拿大生產(chǎn)了約1.172×107L的酪乳，2015年歐盟的酪乳產(chǎn)量達(dá)200萬(wàn)t[4]，2019年中國(guó)黃油產(chǎn)量達(dá)9.7萬(wàn)t，而酪乳在攪打過(guò)程中的產(chǎn)率能達(dá)35%左右，可見(jiàn)在中國(guó)酪乳的產(chǎn)量也能達(dá)到較高水平。工業(yè)生產(chǎn)中，富含 MFGM 組分的酪乳未得到有效利用，常作為廢料丟棄或用于動(dòng)物飼料加工[5]。隨著對(duì)MFGM 的結(jié)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)和功能特性的深入了解，研究者和乳制品公司探索了MFGM 的提取方法，并開(kāi)發(fā)富含 MFGM 的乳制品[6]。奶油洗滌是常用的MFGM分離方法之一，但該法成本較高，利用乳脂加工副產(chǎn)物作為MFGM的分離原料能大大降低成本[7]，所以從酪乳中分離MFGM的研究具有重要意義。此外關(guān)于酪乳成分的研究也在不斷深入，酪乳也可作為一種配料用于乳制品加工和研發(fā)中[4]。

MFGM是指包裹于牛乳中脂肪球表面的3層膜結(jié)構(gòu)，MFGM有助于牛乳形成穩(wěn)定的水包油乳狀液。MFGM中富含極性脂質(zhì)，如鞘磷脂(sphingomyelin，SM)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)、磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)和磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)等[8]。研究表明這些極性脂質(zhì)具有生物活性，包括調(diào)控膽固醇代謝、抗炎和抗神經(jīng)退化，以及增強(qiáng)記憶力等[2]。而在MFGM的3層膜表面或其他部位鑲嵌各種蛋白質(zhì)，如嗜乳脂蛋白(butyrophilin，BTN)、黃嘌呤氧化還原酶(xanthine oxidoreductase，XO/XDH)、黏液素1(mucin 1，MUC1)、乳凝集素(lactadherin，MFG-E8或PAS6/7)、脂肪分化相關(guān)蛋白(adipophilin，ADPH)、分化簇36(cluster of differentiation 36，CD36)、脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP)等，研究表明這些成分可以防止細(xì)胞衰亡、提高機(jī)體免疫力[9]。在食品加工中，MFGM作為配料加入嬰幼兒配方奶粉(infant formula，IF)中，可以提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，未來(lái)可開(kāi)發(fā)成為功能性乳品的優(yōu)質(zhì)原料[10]。

酪乳的成分中除了MFGM片段之外，還存在不完整的乳脂肪球(milk fat globule，MFG)、酪蛋白、乳清蛋白、礦物質(zhì)和乳糖等成分，其中乳蛋白會(huì)增加MFGM的分離純化難度。在酪乳加工和MFGM分離的過(guò)程中，工藝條件會(huì)影響分離效果，乳清蛋白在加熱條件下以巰基-二硫鍵形式結(jié)合到MFGM蛋白上，酪蛋白也會(huì)在一定條件下與膜上的蛋白發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)[11]，并且MFGM易受熱處理、過(guò)濾和均質(zhì)等工藝影響，這些工藝會(huì)影響MFGM中脂質(zhì)、蛋白含量和功能，從而影響其生物活性和功效[12]。所以從酪乳中分離MFGM不僅要關(guān)注乳蛋白等非膜成分去除率也要關(guān)注MFGM成分損失率。HOLZMüLLER等[13-14]關(guān)于MFGM方面做了很多研究，其以酪乳為原料分離MFGM，去除其中乳蛋白以提高M(jìn)FGM成分純度，關(guān)注了乳蛋白去除率和膜蛋白的損失率。

本文綜述了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于酪乳成分組成、酪乳應(yīng)用進(jìn)展和從酪乳中分離MFGM的分離技術(shù)等內(nèi)容，總結(jié)了目前酪乳成分分析和酪乳來(lái)源的MFGM分離過(guò)程存在的問(wèn)題，展望未來(lái)酪乳的應(yīng)用前景。

1 酪乳的成分分析

在攪打稀奶油過(guò)程中，奶油體系中MFG受剪切力作用發(fā)生破裂，表面部分MFGM發(fā)生脫落，MFG表面疏水性增強(qiáng)，彼此之間發(fā)生碰撞并聚集，當(dāng)MFG聚集成奶油粒，奶油中的水相被全部排除，酪乳和奶油粒得到分離，圖1是工業(yè)生產(chǎn)黃油工藝中酪乳的制備過(guò)程[15]。攪打后奶油中酪蛋白、乳清蛋白、部分脂肪小球、MFGM片段等進(jìn)入酪乳中。MFGM片段具有3層膜結(jié)構(gòu)，由單層內(nèi)膜和雙層外膜組成，膜主要由磷脂等極性脂質(zhì)構(gòu)成，在膜上及膜表面鑲嵌結(jié)合著多種膜蛋白，圖2是MFGM具體結(jié)構(gòu)[5,16]。由此可見(jiàn)酪乳成分復(fù)雜，想要充分利用酪乳資源并發(fā)揮其應(yīng)用價(jià)值，對(duì)酪乳進(jìn)行成分分析必不可少。

圖1 酪乳的制備Fig.1 Production of buttermilk

圖2 MFGM的組成和結(jié)構(gòu)Fig.2 Composition and structure of MFGM

1.1 脂質(zhì)成分分析

酪乳中脂質(zhì)含量占酪乳干重的5%～13%，脂質(zhì)主要是甘油三酯和極性脂質(zhì)。甘油三酯包含飽和三酰甘油酯和單不飽和三酰甘油酯，極性脂質(zhì)主要是磷脂類(lèi)，包括PC、PE、PI、PS等甘油磷脂以及鞘酯類(lèi)如鞘磷脂，它們主要存在于MFGM上。對(duì)酪乳中脂質(zhì)的脂肪酸進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，酪乳中含量最豐富的是飽和脂肪酸，占總脂肪酸一半以上，其次是單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸，占脂肪酸40%左右，不飽和脂肪酸中富含亞油酸、α-亞麻酸和二十二碳六烯酸，不飽和脂肪酸的含量受奶牛的飼料、營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境影響[17]。酪乳中富含的磷脂類(lèi)成分具有多種生物活性功能，能有效減少心血管疾病，抗炎癥和胃腸道感染，抗癌癥，促進(jìn)膽固醇吸收、神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成和神經(jīng)發(fā)育[18]。分析酪乳脂質(zhì)成分，能為評(píng)價(jià)酪乳應(yīng)用價(jià)值提供理論和數(shù)據(jù)支撐。

酪乳中脂質(zhì)成分檢測(cè)常用的儀器如高效液相色譜結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-evaporative light scattering detector，HPLC-ELSD)或HPLC-MS，用于極性脂質(zhì)的定性、定量分析；氣相色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器(gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID)或GC-MS，用于甘油三酯和膽固醇類(lèi)定性定量分析。對(duì)脂質(zhì)甲酯化后采用GC-FID可檢測(cè)酪乳中脂肪酸的含量。脂質(zhì)分析前使用有機(jī)溶劑萃取法提取脂質(zhì)。目前，脂質(zhì)提取主要關(guān)注提取效率和溶劑的低毒環(huán)保性[19]。在液相、氣相色譜的檢測(cè)中，通常使用脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品作為參照進(jìn)行絕對(duì)定量，標(biāo)準(zhǔn)品的價(jià)格昂貴且種類(lèi)較多，多來(lái)自進(jìn)口廠家，實(shí)驗(yàn)實(shí)施成本較高。開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單且低成本的脂質(zhì)檢測(cè)方法能為相關(guān)研究提供便利。

由于不同實(shí)驗(yàn)選擇的酪乳乳源、酪乳加工工藝、脂質(zhì)檢測(cè)方法存在差異，導(dǎo)致在酪乳脂質(zhì)成分的定量結(jié)果有所區(qū)別，表1列出了來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)的酪乳脂質(zhì)和脂肪酸含量數(shù)據(jù)，可以更全面認(rèn)識(shí)酪乳的脂質(zhì)成分。

表1 酪乳中各類(lèi)脂質(zhì)含量Table 1 Contents of various lipids in buttermilk

基于對(duì)酪乳脂質(zhì)組成和含量的初步認(rèn)識(shí)，許多研究深入探究工藝條件對(duì)酪乳脂質(zhì)含量影響，并對(duì)比酪乳和其他乳制品副產(chǎn)物的脂質(zhì)差別。酪乳中脂質(zhì)成分隨黃油加工工藝條件變化而變化，如黃油攪打工藝中，低溫和低pH可提高酪乳中極性脂質(zhì)含量。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了酪乳和以酪乳為原料制備的MFGM富集物的脂質(zhì)成分。結(jié)果表明，酪乳和MFGM富集物中都存在一定數(shù)量的極性脂質(zhì)和膽固醇等脂類(lèi)，但含量不同，其中極性脂質(zhì)在酪乳和MFGM富集物中占比分別為12%～16%和40%。MFGM富集物中甘油三酯、飽和脂肪酸和膽固醇的含量低于酪乳，MFGM富集物中脂質(zhì)含量是酪乳的2倍，極性脂質(zhì)含量是酪乳的4倍[2]，這說(shuō)明可通過(guò)從酪乳中分離富集MFGM，提高極性脂質(zhì)的占比。HADDADIAN等[20]對(duì)比分析了實(shí)驗(yàn)室制成酪乳、市售的酪乳粉(buttermilk powder，BMP)、α-serum、β-serum等脂質(zhì)成分(各類(lèi)副產(chǎn)物生產(chǎn)途徑見(jiàn)圖3)，發(fā)現(xiàn)極性脂質(zhì)在β-serum含量最高， BMP中含量最少，BMP、α-serum、β-serum中極性脂質(zhì)PE(31%～36%)、PC(31%～39%)、鞘磷脂(13%～24%)為主要成分，PI(2%～4%)和PS(2%～7%)為次要成分。這說(shuō)明不同副產(chǎn)物脂質(zhì)含量存在差距，未來(lái)對(duì)每種副產(chǎn)物進(jìn)行精確脂質(zhì)分析，可做到精準(zhǔn)利用，來(lái)實(shí)現(xiàn)資源最大化利用。目前，有大量研究對(duì)比分析酪乳與黃油乳清(butterserum，BS)(生產(chǎn)途徑見(jiàn)圖3)的脂質(zhì)成分差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BS和酪乳中脂質(zhì)含量和種類(lèi)存在較大差異，其中BS中極性脂質(zhì)和膽固醇含量高于酪乳，酪乳和BS中都含有較豐富的鞘酯類(lèi)和飽和脂肪酸，可作為食品加工中磷脂的優(yōu)質(zhì)來(lái)源，甚至可替代人乳中鞘磷脂和神經(jīng)酰胺[21]。若對(duì)酪乳和BS簡(jiǎn)單分離純化后，極性脂質(zhì)占比會(huì)有明顯上升[18]。

圖3 乳制品副產(chǎn)物生產(chǎn)流程圖[22]Fig.3 Production process chart of dairy by-products

酪乳中的脂質(zhì)含量會(huì)隨加工工藝、檢測(cè)方法不同而變化，脂肪酸組成易受乳源、飼料等多種因素影響，未來(lái)深入探究影響酪乳脂質(zhì)的因素，并將其可控化，對(duì)開(kāi)發(fā)利用酪乳等副產(chǎn)物具有重要意義。

1.2 蛋白成分分析

酪乳中的蛋白含量占酪乳干重90%左右，主要類(lèi)別有酪蛋白、乳清蛋白及MFGM上鑲嵌的膜蛋白。MFGM上包含100余種蛋白質(zhì)，最主要的8種蛋白質(zhì)為MUC1、XO/XDH、黏液素15(mucin 15，MUC15/PASⅢ)、CD36、BTN、PAS6/7、ADPH和FABP[9]。酪乳主要蛋白含量見(jiàn)表2，酪蛋白含量最高，占總蛋白的67%左右。目前由于缺乏膜蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)酪乳中膜蛋白做絕對(duì)定量比較困難，相對(duì)定量結(jié)果受計(jì)算模型影響，普遍數(shù)據(jù)顯示BTN、PAS6/7、XO/XDH是含量較多的3種膜蛋白，特別是BTN和PAS6/7是膜外層蛋白，在奶油攪打中容易脫落，酪乳中富集較多。酪乳中膜蛋白具有生物功能特性，已經(jīng)證實(shí)，XO/XDH在乳腺的發(fā)育、腸道抗炎癥和組織損傷中具有一定作用[23]；BTN在促進(jìn)先天免疫中發(fā)揮重要作用[24]；PAS6/7有助于抗炎、抗凋亡和促進(jìn)腸黏膜修復(fù)[25]；黏液素在腸道的黏膜物理防御和上皮細(xì)胞抗感染中起著重要作用[26]。對(duì)酪乳中的MFGM蛋白進(jìn)行深入研究，可為其在營(yíng)養(yǎng)品和免疫制劑中應(yīng)用提供技術(shù)指導(dǎo)[16]。

表2 酪乳中主要蛋白含量Table 2 Contents of main protein in buttermilk

酪蛋白和乳清蛋白檢測(cè)可采用HPLC定性定量，需以標(biāo)準(zhǔn)品作為參照，才能得到絕對(duì)定量數(shù)值。膜蛋白的定性、定量方法主要采用SDS-PAGE，此方法一般采用考馬斯亮藍(lán)染液進(jìn)行染色，根據(jù)分離條帶的分子量定性膜蛋白，通過(guò)ImageLab軟件灰度分析對(duì)各類(lèi)膜蛋白進(jìn)行相對(duì)定量。由于不同結(jié)構(gòu)的MFGM蛋白對(duì)染料吸附力不同，會(huì)對(duì)結(jié)果造成偏差。采用新型的免染色SDS-PAGE法，不需要染色標(biāo)記，通過(guò)紫外照射檢測(cè)蛋白中色氨酸殘基來(lái)反映蛋白含量。HOLZMüLLER等[27]根據(jù)免染色SDS-PAGE法得到的圖像，建立了蛋白濃度計(jì)算模型，根據(jù)所要定量蛋白的分子質(zhì)量、色氨酸殘基數(shù)、色氨酸分子質(zhì)量以及ImageLab分析得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率和面積積分定量結(jié)果代入模型公式得到絕對(duì)定量結(jié)果，如公式(1)所示。未來(lái)在膜蛋白定量檢測(cè)中需在精確度和便利性上不斷探索與跟進(jìn)。

Cprotein={[(mTrp/band)/(Trp/protein[%])]×100}÷

(DF×Vprotein)

(1)

式中：DF為蛋白溶液稀釋倍數(shù)；mTrp/band由軟件分析后給出的公式計(jì)算所得；Trp/protein[%]=NTrp/protein×(MwTrp殘基/Mwprotein)×100%，MwTrp殘基=186.21 g/mol，其余蛋白的分子質(zhì)量分?jǐn)?shù)可查資料得[27]。

基于對(duì)酪乳中蛋白種類(lèi)和含量的認(rèn)識(shí)，許多學(xué)者開(kāi)始研究加工工藝條件對(duì)于酪乳中膜蛋白的影響，如熱處理、攪拌、離心等。有研究對(duì)比分析了酪乳和BS的蛋白組分，發(fā)現(xiàn)BS中PAS6/7、XO、BTN這3種蛋白含量高于酪乳，尤其是PAS6/7的含量，BS比酪乳多經(jīng)歷了加熱和離心的加工處理，造成膜蛋白脫落，因此膜蛋白在BS中的含量更高[27]。QU等[7]對(duì)比了脫脂乳、酪乳和BS中蛋白組分差異，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨加工過(guò)程進(jìn)行，工藝下游得到的副產(chǎn)物中蛋白含量不斷增加。這是因?yàn)榻?jīng)過(guò)離心、攪拌操作后MFGM上的蛋白會(huì)不斷脫落得到富集。通過(guò)不同工藝階段副產(chǎn)物中MFGM蛋白的含量來(lái)判斷膜蛋白與膜結(jié)合程度。奶油加工過(guò)程中的攪打溫度和pH會(huì)影響酪乳膜蛋白組成、XO活性及氧化還原電位(Eh)。在低溫和低pH條件下攪打，可增加酪乳膜蛋白含量，提高膜蛋白活性和改變Eh值[28-29]。生產(chǎn)中，可通過(guò)調(diào)節(jié)控制加工條件來(lái)得到膜蛋白含量高和特定Eh值的副產(chǎn)物。HADDADIAN等[29]對(duì)比了BMP、酪乳和α-serum、β-serum的蛋白成分，發(fā)現(xiàn)BMP和酪乳中酪蛋白占比較高，而α-serum和β-serum中膜蛋白占比高，BMP由于經(jīng)過(guò)噴霧干燥、高溫脫水處理，其總蛋白和膜蛋白含量最低，同時(shí)一些膜蛋白的活性也受到影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[28-29]，在配制的乳液中添加分離自酪乳的MFGM蛋白成分能降低Eh值，達(dá)-320～-580 mV，添加來(lái)自α-serum和β-serum的MFGM蛋白會(huì)增加Eh值，達(dá)130～250 mV，雖然添加來(lái)自酪乳的MFGM蛋白乳液XO活性低于α-serum和β-serum，但Eh值降低有利于酪乳在奶酪中應(yīng)用，因?yàn)榈虴h值有利于微生物生長(zhǎng)及風(fēng)味物質(zhì)形成，且能緩解脂肪氧化。

酪乳中蛋白定量檢測(cè)需要不斷提高精確度，開(kāi)發(fā)新方法。不斷深入探索酪乳加工條件對(duì)酪乳蛋白組成和含量的影響，追求不影響黃油質(zhì)量前提下，膜蛋白含量高的優(yōu)質(zhì)酪乳。

1.3 酪乳中其他成分

在酪乳中除含有乳蛋白和MFGM成分外，還有乳糖、無(wú)機(jī)鹽、礦物質(zhì)等成分，其中包括許多游離/結(jié)合多糖和一些糖蛋白，如免疫球蛋白、乳鐵蛋白、黏蛋白、乳凝集素和乳角蛋白，這些糖蛋白被證明具有一定程度的抗輪狀病毒活性[30]。同時(shí)酪乳中天然存在不同蛋白水解物，它們具有一定抗氧化活性，可用于生產(chǎn)天然抗氧化劑[31]?？共《尽⒖寡趸然钚允芗庸きh(huán)境影響顯著，特別是熱處理，會(huì)導(dǎo)致發(fā)揮這一活性作用的蛋白發(fā)生變性或聚集，在低溫長(zhǎng)時(shí)間巴氏殺菌處理下，其活性喪失嚴(yán)重，所以研究非熱殺菌如高壓殺菌來(lái)減輕這一活性損失具有重大意義[30]。研究并控制加工過(guò)程條件能為利用酪乳各成分功能特性提供保障。

2 酪乳中MFGM分離技術(shù)研究

酪乳中分離純化MFGM的目的是富集MFGM中極性脂類(lèi)和功能性膜蛋白，盡可能去除非膜蛋白和其他雜質(zhì)成分，包括酪蛋白和乳清蛋白，還有一些乳糖、礦物質(zhì)等。酪蛋白形成的酪蛋白膠束與磷脂大小接近，且與MFGM片段大小有重疊部分，MFGM與酪蛋白膠束間還存在相互作用發(fā)生結(jié)合，這些因素增加了MFGM分離純化難度[32]。超速離心和膜分離技術(shù)是現(xiàn)階段從酪乳中分離MFGM的常用手段。

對(duì)酪乳進(jìn)行超速離心可以得到酪蛋白去除率較高的MFGM富集物[33]，對(duì)奶油攪打后收集的酪乳先進(jìn)行預(yù)處理，添加酪乳體積2%的檸檬酸鈉來(lái)解離酪乳中的酪蛋白膠束，之后在離心力100 000×g下離心50 min，能有效去除酪乳中酪蛋白[33]。但MFGM富集物中乳清蛋白保留率高，因?yàn)樵谀逃秃屠胰榧庸み^(guò)程存在熱處理，部分β-乳球蛋白與MFGM蛋白通過(guò)二硫鍵發(fā)生結(jié)合[34]。MFGM表層的蛋白會(huì)在離心結(jié)束后存在于上層中，造成約20%MFGM蛋白損失[33]。超速離心酪乳的分離方式存在耗時(shí)耗能問(wèn)題，不適合工業(yè)化生產(chǎn)，現(xiàn)階段對(duì)于這種分離技術(shù)的研究有限。

近年來(lái)研究人員發(fā)現(xiàn)了膜分離技術(shù)去除酪蛋白膠束和乳清蛋白的潛力，將其應(yīng)用于酪乳中分離MFGM[35-37]。酪乳中各成分大小及分子質(zhì)量見(jiàn)表3，這是膜分離MFGM時(shí)選擇膜包孔徑的依據(jù)。膜分離技術(shù)制備MFGM關(guān)鍵點(diǎn)就在于選擇合適的膜孔徑，以最大限度的保留有效成分。針對(duì)膜包孔徑的大小可分為2種膜過(guò)濾方式：微濾(0.1～1 μm)和超濾(0.001～0.1 μm，1～300 kDa)。酪乳中酪蛋白膠束、磷脂和MFGM片段大小相似的，直接膜分離難以分開(kāi)，在分離前可采用了檸檬酸鈉解離法和凝乳酶沉淀法處理，以改變酪蛋白大小，從而有效分離酪蛋白。經(jīng)過(guò)凝乳酶沉淀處理后，可超濾去除其他小分子雜質(zhì)，檸檬酸鈉解離后則采用微濾去除粒徑減小后的酪蛋白和其他小分子雜質(zhì)。有研究表明，在 pH 6.8 和 45 ℃下加入0.03 %凝乳酶，先沉淀酪蛋白，再將上清液用80 nm的陶瓷膜進(jìn)行6步洗濾得到MFGM富集物，其中各種膜蛋白保留率分別為70% (PAS6/7)，35% (XO/XDH) 和20% (BTN)，其中洗滌2次后，酪蛋白和乳清蛋白的去除率幾乎接近100%[13]。存在的不足是：在凝乳和洗濾過(guò)程膜蛋白的損失率較高。可通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化凝乳條件和膜過(guò)濾條件(溫度、pH等)來(lái)降低損失。許多研究中先添加檸檬酸鈉解離酪蛋白膠束，再結(jié)合微濾分離酪乳中MFGM，有研究添加了酪乳20 mg/mL的檸檬酸鈉，再用0.1 μm 微濾膜處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未添加檸檬酸鈉的樣品滲透液中幾乎不存在酪蛋白，而添加檸檬酸鈉后，可顯著提高酪蛋白的透過(guò)率[38]。如使用微濾工藝處理未經(jīng)過(guò)處理的酪蛋白膠束，酪蛋白會(huì)在截留液中大量殘留。除了添加凝乳酶和螯合鹽進(jìn)行膜分離前預(yù)處理以提高 MFGM分離效果外，還可以選用其余原料制備MFGM，如酪乳奶酪乳清(酪乳制備奶酪過(guò)程中排出的乳清)以及乳清酪乳(乳清奶油攪打出來(lái)的酪乳)，這些原料中不含或含有極少量酪蛋白膠束，可作為富集磷脂的優(yōu)質(zhì)原料[35,39]。BARRY等[32]在酪乳中添加蛋白水解酶，將其中的乳蛋白降解成小分子肽段，再采用50 kDa超濾膜去除肽段和乳清蛋白達(dá)到磷脂富集效果，磷脂含量分離濃縮后提高了7.8倍。

表3 酪乳中成分的分子質(zhì)量和大小Table 3 Molecular weights and sizes of ingredients in buttermilk

除選擇合適的分離膜材料、膜孔徑和分離前預(yù)處理方法，膜分離條件對(duì)分離效果也產(chǎn)生很大影響，包括分離溫度和壓力等。分離過(guò)程中溫度的變化會(huì)影響分離效果，較高的溫度會(huì)導(dǎo)致蛋白尤其是乳清蛋白與膜蛋白結(jié)合甚至變性，65 ℃條件下酪乳中磷脂通過(guò)MFGM片段與乳清蛋白發(fā)生聚集，繼續(xù)升溫至80 ℃，磷脂可直接與乳清蛋白發(fā)生聚集[40]。加熱使乳清蛋白吸附到MFG表面，與MFGM片段部分結(jié)合，被結(jié)合的乳清蛋白會(huì)隨著MFGM或MFG進(jìn)入截留液中，降低乳清蛋白去除率[41]。酪乳原料分離前進(jìn)行巴氏殺菌處理，會(huì)導(dǎo)致MFGM富集物中β-乳球蛋白上升，同時(shí)PAS6/7下降，而在分離后對(duì)截留液進(jìn)行巴氏殺菌處理不會(huì)影響MFGM富集物中蛋白組分[42]。膜分離溫度也不能過(guò)低，低溫下液體黏度大，流動(dòng)性差，會(huì)減少膜通量，從而降低分離效果[41]。除了溫度影響外，pH和分離壓力等會(huì)對(duì)分離效果產(chǎn)生影響，酪乳分離時(shí)，提高pH能減少M(fèi)FG聚集，適當(dāng)提高過(guò)膜壓力能提高膜通透性，這都有助于分離制備MFGM。

從酪乳中分離MFGM，近年來(lái)出現(xiàn)了一些新穎的想法。以稀奶油為原料制備黃油時(shí)，在稀奶油攪打之前，可先用分離技術(shù)處理稀奶油，以降低攪打后酪乳中的乳蛋白含量，提高了酪乳中MFGM純度。這是因?yàn)槿榈鞍讜?huì)與MFG競(jìng)爭(zhēng)吸附到水-空氣界面，預(yù)先去除乳蛋白，有利于攪打過(guò)程中MFG和MFGM的釋放[41]。除了降低酪乳中的非膜蛋白外，還可對(duì)脂質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，如脫脂處理，將酪乳中粒徑大于1 μm的脂質(zhì)顆粒脫除，提高極性脂質(zhì)在脂質(zhì)中的占比，減小后續(xù)加工中脂質(zhì)的變化[1]。最新研究將酶解、超濾技術(shù)以及超臨界萃取組合，與只使用超濾工藝比較，使用組合技術(shù)50 kDa膜處理的截留物中磷脂的含量提高了約8倍，總脂含量提高了7～8倍[43]。

膜分離工藝中，酪乳預(yù)處理應(yīng)盡可能減少營(yíng)養(yǎng)成分的損失，為第2階段膜分離提供優(yōu)質(zhì)原料；不同孔徑下膜分離的條件有待優(yōu)化來(lái)精確控制，提高分離效果。將新型的技術(shù)與膜分離結(jié)合，并不斷完善分離效果的評(píng)價(jià)體系，是未來(lái)從酪乳中分離MFGM的研究方向。

3 酪乳的應(yīng)用研究

酪乳中營(yíng)養(yǎng)成分豐富，功能繁多，是乳制品研究的熱點(diǎn)話(huà)題，酪乳中富含的MFGM具有獨(dú)特加工特性和生物活性功能。為更好開(kāi)發(fā)利用酪乳原料，挖掘其潛在價(jià)值，近年來(lái)關(guān)于酪乳的應(yīng)用研究不斷深入。

研究人員不斷深入探索酪乳中極性脂質(zhì)和膜蛋白的功能特性，有研究分離酪乳中脂肪組分來(lái)評(píng)價(jià)其潛在抗增殖作用，采用了食品級(jí)和非食品級(jí)溶劑進(jìn)行選擇性萃取，發(fā)現(xiàn)中性組分和極性組分對(duì)9種人癌細(xì)胞株均有一定的抗增殖活性，并且使用食品級(jí)乙醇獲得的餾分比使用非食品級(jí)溶劑獲得的產(chǎn)率更高，富含磷脂和鞘脂的組分對(duì)人卵巢和結(jié)腸癌細(xì)胞有很強(qiáng)的抗增殖作用，深入挖掘酪乳中脂類(lèi)物質(zhì)的功能特性為酪乳作為功能性食品添加劑奠定基礎(chǔ)[45]。乳凝集素是MFGM一種外周糖蛋白，具有多種生物學(xué)活性，如抗病毒、抗凝血和抗炎癥，實(shí)驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)多種乳副產(chǎn)品中乳凝集素進(jìn)行定量，發(fā)現(xiàn)酪乳的乳凝集素含量最高，熱處理和水解都能使乳凝集素濃度下降，且水解影響更顯著[46]。

MFGM富含磷脂，是嬰幼兒大腦發(fā)育重要物質(zhì)，能應(yīng)用于IF改良[8]。國(guó)外在IF中添加MFGM的研究較多，研究發(fā)現(xiàn)MFGM成分可調(diào)節(jié)嬰幼兒代謝和腸道微生物，對(duì)腸道的發(fā)育成熟起著重要作用[47]。鞘磷脂是母乳中最重要的鞘脂，乳汁中的鞘磷脂對(duì)哺乳期新生兒腸道成熟起著關(guān)鍵性作用，以植物油和大豆卵磷脂混合為基礎(chǔ)的嬰兒配方奶粉中的鞘磷脂含量顯著低于人乳，而人乳中的磷脂種類(lèi)與酪乳中的磷脂譜高度相似，可成為IF中磷脂的優(yōu)質(zhì)原料[17]。有IF的制造商已經(jīng)將富含MFGM成分的物質(zhì)添加到IF中以改善嬰兒的生長(zhǎng)和發(fā)育，添加MFGM的IF已經(jīng)在瑞典、西班牙等國(guó)家上市[48]，評(píng)價(jià)添加MFGM的IF與不同泌乳期的母乳在脂質(zhì)組成和含量的差異具有重要意義。在仿人乳新型IF產(chǎn)品中，關(guān)于構(gòu)造的MFG表面成分的精確組成和其在人體中消化特性及代謝有待進(jìn)一步的研究[6]。

由于酪乳中富含蛋白和磷脂，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始研究將其應(yīng)用于奶酪、低脂酸奶等產(chǎn)品中，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值同時(shí)觀察對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響。將酪乳噴霧干燥成BMP加入奶酪中，能夠改善奶酪質(zhì)地風(fēng)味、提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但也存在增加奶酪水分含量和延長(zhǎng)凝乳時(shí)間等負(fù)面影響。這是因?yàn)榱字妥冃匀榍宓鞍椎拇嬖?，前者的極性基團(tuán)結(jié)合較多水分，削弱脫水效果；后者可以與酪蛋白膠束和κ-酪蛋白相互作用，形成酪蛋白-乳清復(fù)合物，影響凝固劑對(duì)κ-酪蛋白的相互作用，從而增加凝乳酶凝固時(shí)間[49]。研究對(duì)添加了BMP的奶酪感官特性、功能性、成分組成和微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)添加10%BMP可提高奶酪的磷脂含量、水分、pH和鹽分，降低奶酪的總脂肪和非發(fā)酵菌含量，顯著增加來(lái)自蛋白分解途徑揮發(fā)性化合物的產(chǎn)生，添加BMP后會(huì)形成多孔的奶酪微結(jié)構(gòu)，奶酪質(zhì)地更柔軟，流動(dòng)性顯著降低[49-50]。在奶酪中添加BMP能提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，更符合消費(fèi)者健康需求，但要控制好添加量以避免造成不良風(fēng)味和質(zhì)地。近年來(lái)，由于人們對(duì)健康低脂飲食的追求，對(duì)低脂酸奶的需求量不斷增加，但脂肪含量降低會(huì)導(dǎo)致酸奶質(zhì)構(gòu)特性不佳，風(fēng)味釋放不平衡，酸味尖銳，缺乏乳香，產(chǎn)生令人不快的味道，這大大降低了低脂酸奶的可接受度。有研究對(duì)全脂酸奶、無(wú)添加的低脂酸奶和添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)BMP的低脂酸奶的感官特性和揮發(fā)性成分進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)BMP的添加改善了低脂酸奶的風(fēng)味和質(zhì)地，但添加過(guò)多(>4%)會(huì)降低其風(fēng)味的可接受性。感官和電子鼻分析表明，添加1%BMP的低脂酸奶具有與全脂酸奶相似的風(fēng)味[48]，這為解決低脂酸奶質(zhì)構(gòu)風(fēng)味問(wèn)題提供參考。

一些乳制品經(jīng)常出現(xiàn)脂肪上浮現(xiàn)象，這是由于MFG之間發(fā)生了聚集導(dǎo)致相轉(zhuǎn)化，而MFGM富含極性脂質(zhì)和特異性膜蛋白，使其具有乳化性質(zhì)。MFGM上磷脂的氧化還原電位與MFG相近，而MFGM蛋白又能提供空間電阻，兩者能作為表面活性劑來(lái)競(jìng)爭(zhēng)脂肪滴界面，起到了乳化穩(wěn)定的作用[36]。這能有效防止MFG之間的絮凝和聚集，為酪乳解決脂肪上浮提供了思路[51]。

目前關(guān)于酪乳功能特性和應(yīng)用研究已經(jīng)有了很多成果，闡明功能特性的機(jī)理并將成果轉(zhuǎn)化為實(shí)際應(yīng)用是接下來(lái)重點(diǎn)攻克的難題，基于現(xiàn)有研究對(duì)酪乳成分、特性和應(yīng)用的不斷深入，加工利用乳品加工副產(chǎn)物具有良好的發(fā)展前景。

4 總結(jié)與展望

在酪乳成分分析方面，由于MFGM成分含量和功能特性受酪乳加工條件、檢測(cè)方法的影響，不同研究定量數(shù)據(jù)存在較大差異。在未來(lái)研究中重點(diǎn)關(guān)注加工條件對(duì)成分造成的損失，并開(kāi)發(fā)精確環(huán)保的檢測(cè)方法，為研究提供便利。

分離提取MFGM時(shí)，以提高非膜成分去除率，提高膜成分保留率為目標(biāo)，在未來(lái)研究中對(duì)酪乳預(yù)處理?xiàng)l件、分離條件不斷優(yōu)化，減少極性脂質(zhì)和膜蛋白的損失。尋求新型技術(shù)應(yīng)用于MFGM的分離，以減少加工時(shí)間和能耗，不斷提高分離效果并降低成本。

在酪乳應(yīng)用方面，將正處于實(shí)驗(yàn)初級(jí)階段的成果不斷深入探索和轉(zhuǎn)化，為開(kāi)發(fā)膳食補(bǔ)充劑、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑和免疫增強(qiáng)劑等方面提供指導(dǎo)。在各類(lèi)產(chǎn)品應(yīng)用中，研究添加后對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)影響，豐富評(píng)價(jià)指標(biāo)，為酪乳和MFGM作為乳品配料奠定基礎(chǔ)。

目前市售的酪乳粉和MFGM富集物還存在一些問(wèn)題需要改進(jìn)，比如MFGM富集物純度不高，溶解性差，酪乳粉生物活性成分損失嚴(yán)重。不斷優(yōu)化加工條件和尋求新型技術(shù)，讓成品的營(yíng)養(yǎng)和可利用度最大化。