杜小換，黃晨蓉，胡紹燕，劉筱雪，董 吉，朱增燕，劉紀松，李 芳，王文靜，繆麗燕**

1 蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 藥劑科，蘇州 215025；2 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 藥學(xué)部，蘇州 215006；3 蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 血液科，蘇州 215025；4 浙江佰辰醫(yī)療科技有限公司，杭州 310000

白消安（BU）是兒童造血干細胞移植（HSCT）預(yù)處理方案中的重要組成藥物。根據(jù)國際血液和骨髓移植研究中心（CIBMTR）的分類方法，BU 總劑量大于9 mg·kg-1的預(yù)處理方案為清髓方案（MAC），BU低于此劑量的方案為降低強度預(yù)處理方案（RIC）。MAC 方案下的多項研究表明，在兒童患者中BU 藥動學(xué)存在個體差異性[1，2]，且BU 治療窗范圍窄，BU體內(nèi)暴露與HSCT 患者的移植后治療結(jié)局及毒副作用存在顯著相關(guān)性，最佳暴露范圍尚有待確立[3]。國外多個移植中心通過開展BU 治療藥物監(jiān)測（TDM）探索兒童患者的BU 最佳暴露范圍，以期改善移植治療結(jié)局，減少BU 高暴露產(chǎn)生的毒性反應(yīng)[4，5]。由于RIC 方案中BU 用藥療程更短（1～2 天），這對TDM的時效性要求非常高，因此目前RIC 方案下的相關(guān)研究少，尤其是在兒童患者中[6]。

根據(jù)文獻報道，BU 血藥濃度檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[7，8]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[9，10]等。其中LC-MS/MS 法具有檢測特異性、靈敏度、準確度高及檢測速度快等優(yōu)點，日漸成為TDM 主流分析技術(shù)和檢測“金標準”。

本研究擬建立LC-MS/MS 法檢測患兒血漿中BU 藥物濃度，并對RIC 方案下患兒體內(nèi)BU 暴露情況進行估算，為進一步開展兒童HSCT 患者BU 藥動學(xué)和藥效學(xué)研究提供技術(shù)支持和理論參考。

1 材 料

1.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters 公司，型號Xevo TQD，配備電噴霧離子化源（ESI）以及MassLynx V4.1 數(shù)據(jù)處理軟件）；電子分析天平（Mettler Toledo 公司，型號XS105DU）等；超純水儀（Millipore 公司，型號Direct-Q5 UV）；臺式高速離心機（北京白洋醫(yī)療器械有限公司，型號G20）。

1.2 藥品和試劑

BU 對照品（純度＞98%，批號S1111AS，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；BU-D8 對照品（純度為≥98%，批號D021161-1004，CFW Laboratories，Inc）；BU 注射液（規(guī)格10 mL：60 mg，Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.）；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純；試驗用水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEHC18（50mm×2.1 mm，1.7 μm）；以含10 mmol·L-1甲酸銨和0.1%甲酸的水溶液為水相（A），以含0.1%甲酸的乙腈溶液為有機相（B），采用梯度洗脫法（程序為：0～0.5 min，95%A；0.5～1.5 min，95%A→5%A；1.5～2.2 min，5%A；2.2～2.3 min，5%A→95%A；2.3～3 min，95%A）；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

采用ESI 和多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式檢測；毛細管電壓：3.0kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑溫度：400℃；脫溶劑氣流速：800L·h-1；錐孔氣流速：20L·h-1。BU 離子通道為m/z 264.10→150.90；錐孔電壓為25 V，碰撞能量10 V；BU-D8 離子通道為m/z 272.10 →159.10，錐孔電壓為25 V，碰撞能量11 V。

2.3 溶液配制和處理

2.3.1 對照品溶液 精密稱取BU 對照品11.90 mg，置于30 mL 棕色玻璃瓶中，用電子移液器精密加入乙腈11.67 mL 使溶解，制成濃度為1.0 mg·mL-1的BU 對照品儲備液；取該液適量，然后用甲醇-水（1∶1，V∶V）定量稀釋，制成其質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 和100.0 μg·mL-1的系列對照品溶液，以及其質(zhì)量濃度為1.5、15.0、80.0 μg·mL-1的質(zhì)控（QC）溶液。

2.3.2 內(nèi)標溶液 精密稱取BU-D8 對照品10.00mg，置于10 mL 容量瓶中，用甲醇-水（1∶1，V∶V）溶解并稀釋至刻度，制成濃度為1.0 mg·mL-1的BU-D8 內(nèi)標儲備液，取該液適量，用乙腈定量稀釋制成濃度為0.25 μg·mL-1內(nèi)標乙腈溶液。

2.4 血漿樣品配制和處理

取空白血漿90 μL 加入1.5 mL 離心管中，分別加入“2.3.1”項下不同質(zhì)量濃度的BU 對照品溶液以及QC 溶液各10 μL，得到標準曲線和QC 血漿樣品，然后分別加入0.25 μg·mL-1的BU-D8 乙腈溶液300 μL，渦旋混勻3 min，15000 r·min-1離心8 min，取上清液100 μL 至進樣瓶中，進樣量2 μL。

2.5 專屬性考察

分別取6 份不同來源的空白血漿、標準血漿樣品和患者用藥后的血漿樣本，除空白血漿中用乙腈等量代替BU 對照品溶液和BU-D8 內(nèi)標溶液外，其余按照“2.4”項下的操作方法進行配制、處理，然后進樣測定，分別記錄色譜圖，見圖1、圖2、圖3。由圖可見，BU 和BU-D8 的保留時間均為1.34 min；血漿內(nèi)BU 和BU-D8 內(nèi)標物的峰形良好，分離較為完全，不受血漿中內(nèi)源性物質(zhì)干擾。

圖1 空白血漿色譜圖

圖2 BU 標準血漿樣品（0.2 μg·mL-1）與BU-D8內(nèi)標物色譜圖

圖3 某患者BU 首劑給藥后2 h 血漿樣本與BU-D8內(nèi)標物色譜圖

2.6 標準曲線繪制

按照“2.4”項下方法操作，制備不含對照品和內(nèi)標的空白血漿樣品1 份、不含對照品含內(nèi)標的空白血漿樣品1 份，以及濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg·mL-1的標準曲線血漿樣品7 份，處理后進樣測定。

以BU 濃度（μg·mL-1）為橫坐標（X），BU 與內(nèi)標物BU-D8 峰面積的比值（ABU/ABU-D8）為縱坐標（Y），采用加權(quán)最小二乘法進行回歸運算，求得直線回歸方程為：Y=1.416X+0.0103（r=0.999），BU 濃度在0.1～10.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限（LLOQ）為0.1 μg·mL-1。

2.7 準確度和精密度

按照“2.4”項下的操作方法分別配制LLOQ，低、中、高4 個濃度的QC 血漿樣本各6 份，處理后進樣分析，連續(xù)測定3 批。批內(nèi)和批間準確度（RE）分別為101.4%～103.7%和101.1%～103.5%，批內(nèi)和批間精密度（RSD）分別為4.3%～5.1%和3.2%～6.9%，均符合《中國藥典》2020 年版的要求。見表1。

表1 BU 精密度、準確度實驗結(jié)果（n=6）

2.8 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

按照“2.4”項下的操作方法分別配制和處理低、中、高血漿樣品各6 份，定為A1 組；取6 個不同來源的空白血漿各100 μL，先加入乙腈進行蛋白沉淀后取上清液，再分別加入等量3 個不同濃度BU QC溶液和BU-D8 內(nèi)標溶液，定為A2 組；以A1 組中BU 峰面積與A2 組中BU 峰面積的均值之比計算提取回收率。以等體積純化水代替空白血漿，分別加入3 個不同濃度BU QC 溶液各10 μL，定為A3組；以A2 組BU 和BU-D8 峰面積與A3 組中BU 和BU-D8 峰面積的均值之比分別計算基質(zhì)因子，再計算經(jīng)內(nèi)標歸一化的基質(zhì)因子。結(jié)果顯示，平均提取回收率為（111.2±11.8）%，經(jīng)內(nèi)標歸一化的基質(zhì)效應(yīng)均＜15%，說明該方法提取過程中藥物幾乎沒有損失，基質(zhì)對BU 和BU-D8 內(nèi)標物的測定影響較小。見表2。

表2 BU 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)實驗結(jié)果（n=6）

2.9 穩(wěn)定性試驗

分別配制低、高兩個濃度的血漿樣本各3 份進行穩(wěn)定性試驗。結(jié)果顯示，BU 血漿樣品在室溫放置4 h、經(jīng)歷反復(fù)凍融3 次和血漿樣品處理后進樣器內(nèi)放置24 h 條件下均可保持穩(wěn)定，見表3。

表3 BU 血漿樣品穩(wěn)定性實驗結(jié)果（±s，n=3）

表3 BU 血漿樣品穩(wěn)定性實驗結(jié)果（±s，n=3）

2.10 血漿中的BU 濃度測定與體內(nèi)暴露量計算

收集蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液科移植病房中采用RIC 方案的病例，即BU 基于患兒體重，按0.8 mg·kg-1計算每劑給藥量，每劑持續(xù)靜脈輸注2 h，每天給藥4 次，連續(xù)用藥2 天。分別采集BU首劑給藥后即刻（記為2 h）、4 h、6 h 外周靜脈血約2 mL，記錄準確采血時間（精確到分鐘），血樣收集于EDTA 抗凝管內(nèi)，于0.5 h 內(nèi)轉(zhuǎn)移至實驗室，以4000 r·min-1離心5 min 分離血漿，按照“2.4”項下處理后進行血藥濃度測定。使用NextDose 貝葉斯回歸模型分別計算患兒體內(nèi)BU 的暴露情況（以AUC 表示）。

本研究入組患兒21 例，中位年齡為5.4 歲（2.0～15.8 歲），體重18 kg（11～60 kg），BU AUC 中位值為1191.23（775～2511.57）μmol·min·L-1，其他臨床信息見表4。

表4 RIC 方案下患兒臨床信息及BU 暴露結(jié)果

3 討論

本研究使用BU-D8 同位素內(nèi)標，建立了測定HSCT 患兒血漿中BU 濃度的LC-MS/MS 法，該方法采用乙腈進行蛋白沉淀，前處理操作簡單快速，蛋白沉淀完全。在流動相的選擇方面，首先以0.1%甲酸水溶液為水相，乙腈為有機相，但試驗后發(fā)現(xiàn)BU 及內(nèi)標物BU-D8 的響應(yīng)值均較低，故而參考文獻[9]嘗試將水相中加10 mmol·L-1甲酸銨，有機相中加入0.1%甲酸，響應(yīng)明顯提高。該方法中血漿用量少（100 μL），適合兒童患者開展BU治療藥物檢測。

經(jīng)模型估算，本研究中RIC 方案下21 例患兒首劑給藥后的BU 暴露量存在個體差異性，這與MAC 方案下的其他研究結(jié)論一致[11-13]。與美國FDA推薦方案下[14]的目標暴露范圍（900～1350 μmol·min·L-1）相比，本研究中有33.3%的患者未能達到目標值。因此，患者移植后療效以及毒副反應(yīng)發(fā)生情況有待繼續(xù)隨訪，應(yīng)通過進一步分析BU AUC 在患兒個體間出現(xiàn)差異的影響因素以及不同暴露情況下患兒的移植后療效及安全性，建立BU 最佳暴露范圍，從而達到實現(xiàn)BU 個體化給藥，改善患兒移植治療結(jié)局的目的。