劉 流，邰順章，支榮榮

鹽城市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，鹽城 224055

中藥羅布麻葉為《中國藥典》[1]一部收錄，為夾竹桃科植物羅布麻Apocynum venetum L.的干燥葉，具有平肝安神、清熱利水的功效，用于肝陽眩暈、心悸失眠、浮腫尿少等癥。近年來，發(fā)現(xiàn)市售樣品由白麻（A.pictum）葉混充羅布麻葉的情況較為普遍，兩者成分和功效均有差異[2，3]。《新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》[4]中收錄的大花羅布麻Poacynum hendersonii（Hook.f.）Woodson.的干燥葉即白麻（A.pictum）；但是原則上地方藥材不適用于無此標(biāo)準(zhǔn)的其他省區(qū)。因此羅布麻葉和白麻葉應(yīng)嚴(yán)格區(qū)分。

在《中國藥典》[1]中，對羅布麻葉的性狀鑒別描述與《新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》[4]對白麻葉的性狀鑒別描述基本一致，且羅布麻葉多皺縮卷曲、有的破碎，給外觀鑒別帶來困難[5]；同時(shí)，兩文獻(xiàn)的顯微鑒別描述也缺少顯著特征差異；兩種藥材主要成分的種類是類似的，僅含量差異，且因?yàn)樯L環(huán)境與采收季節(jié)的關(guān)系，含量會發(fā)生變化，采用薄層色譜和高效液相色譜檢測主要化學(xué)成分的含量不能有效區(qū)分羅布麻與白麻[2，6]。故按現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)用性狀、顯微、理化鑒定等傳統(tǒng)方法難以區(qū)分羅布麻和白麻，因此有必要開發(fā)新的方法用于區(qū)分兩種藥材。

《中國藥典》一部應(yīng)用分子生物學(xué)方法鑒定川貝母、霍山石斛、蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇，其中川貝母和霍山石斛鑒定方法為PCR-RFLP，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性方法。

多個(gè)研究表明，ITS2 和psbA-trnH 序列可以作為植物通用DNA 條形碼，可有效鑒別植物中藥材[7]。本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增并測序了羅布麻和白麻的ITS2 和psbA-trnH 序列，去除測序引物端不可靠序列，序列分析結(jié)果顯示，兩者ITS2 序列僅2 bp 堿基差異，而psbA-trnH 序列有一段22 bp 的差異。psbA-trnH 位于植物葉綠體基因組的psbA 基因和trnH 基因的間隔區(qū)，起著重要的調(diào)控作用，有一定的變異率和相對的保守性，在多個(gè)物種的進(jìn)化研究中扮演重要角色。

本實(shí)驗(yàn)選擇在psbA-trnH 序列的基礎(chǔ)上，利用22 bp 的差異序列，建立一個(gè)可行的分子生物學(xué)方法，鑒別羅布麻和白麻；并對親緣關(guān)系相近物種的psbA-trnH 序列進(jìn)行分析，確認(rèn)此方法具有特異性。

1 材 料

1.1 儀器

SimpliAmp PCR 測序儀（Thermo Scientific 公司）；超微量分光光度計(jì)One Drop OD1000+（南京五義科技有限公司）；電泳儀Tanon EPS 300（上海天能科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

植物基因組DNA 小量純化試劑盒（批號AJG2100A）、Ssp Ⅰ（批號AK11181A）TaKaRa 公司；2XTaq PCR MasterMix Ⅱ（批號S7812）、Gene Green核酸染料（批號S8121）、DNA MarkerⅠ（批號R7109）天根生化科技北京有限公司；TAE Buffer Premixed Powder（1X，批號F701KA2248）、瓊脂糖B 低電滲（批號F520BA0015）生工生物工程上海股份有限公司。

1.3 藥材

抽檢標(biāo)示羅布麻樣品21 批，經(jīng)本文通訊作者鑒定，其中7 批為羅布麻，14 批為白麻。樣本信息見表1。

表1 羅布麻和白麻樣本信息

2 方 法

2.1 總DNA 提取

取樣品葉片約0.1 g 于陶瓷研缽（洗凈經(jīng)165 ℃，4 h 高溫烘烤），加液氮快速研磨至極細(xì)粉末，取20～50 mg 粉末，按照MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit 試劑盒說明（Protocol Ⅱ）提取總DNA，其中56 ℃水浴時(shí)間延長至20 min，提取產(chǎn)物用TE 緩沖液溶解之前放置室溫15 min，使乙醇揮發(fā)完全，TE 緩沖液加熱至65 ℃以提高洗脫效率。以微量分光光度計(jì)檢測濃度和純度，21 批樣本的總DNA 濃度為2～10 ng·μL-1，A260/A280為1.6～1.8。

2.2 psbA-trnH 擴(kuò)增

引物序列來源于《中國藥典》四部[8]。正向引物psbAF（5ˊ-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3ˊ），反向引物trnHR（5ˊ-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3ˊ）。引物短暫離心，按照管壁上的說明加適量TE 緩沖液溶解成100 μmol·L-1的貯備液，并取部分稀釋成2.5 μmol·L-1的工作溶液。

25 μL 擴(kuò)增體系包含：2X Taq PCR Master MixⅡ12.5 μL（說明：此Mix 中的DNA 聚合酶為高保真酶，以確保測序結(jié)果的準(zhǔn)確性），上游引物psbAF（2.5 μM）1 μL，下游引物trnHR（2.5 μM）1 μL，滅菌ddH2O 8.5 μL，DNA 模板2 μL。psbA-trnH 擴(kuò)增程序參考《嶺南中草藥DNA 條形碼序列》[9]并作適當(dāng)調(diào)整：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃充分延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于GeneGreen 染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳、成像，觀察條帶是否明亮清晰、無雜帶且空白對照無條帶。一共21 個(gè)樣本的PCR 產(chǎn)物電泳確認(rèn)合格，送生工雙向測序，測序引物為擴(kuò)增引物psbAF和trnHR。

2.3 酶切位點(diǎn)分析

測序結(jié)果用軟件Chromas2.6.6（Technelysium Pty Ltd）和軟件CodonCode Aligner 9.0.1（Codon-Code Corporation）得到可信序列，然后進(jìn)行Nucleotide BLAST 比對，確認(rèn)測序結(jié)果可靠后進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，查找特異性酶切位點(diǎn)。

2.4 psbA-trnH 擴(kuò)增并酶切

21 批樣本進(jìn)行psbA-trnH 擴(kuò)增，擴(kuò)增過程同“2.2”。擴(kuò)增后電泳檢測，確定條帶明亮清晰無雜帶，大小為300～400 bp。PCR 產(chǎn)物直接酶切，20 μL 酶切體系：Ssp Ⅰ內(nèi)切酶1 μL，10X buffer 2 μL，ddH2O 12 μL，PCR 產(chǎn)物5 μL。37 ℃水浴進(jìn)行酶切反應(yīng)，1.5 h 后每個(gè)體系加10X loading buffer 2 μL 終止酶切反應(yīng)。電泳觀察結(jié)果。

2.5 psbA-trnH 序列分析

2.5.1 酶切位點(diǎn)種間特異性分析 獲取NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫中羅布麻近緣物種psbA-trnH 序列，分析本方法采用的酶切位點(diǎn)是否具有特異性，即在其他物種中沒有此酶切位點(diǎn)。如果在其他物種中有此酶切位點(diǎn)，觀察酶切后的條帶大小是否與羅布麻有區(qū)別。

2.5.2 酶切位點(diǎn)種內(nèi)保守性分析 考察本實(shí)驗(yàn)測序的7 條羅布麻psbA-trnH 序列以及NCBI 中的所有羅布麻psbA-trnH 序列，分析本方法采用的酶切位點(diǎn)是否保守，即是否都在相同位置有相同酶切位點(diǎn)。

2.5.3 分子進(jìn)化分析 基于NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫psbA-trnH 序列，構(gòu)建夾竹桃族各種屬的進(jìn)化樹，考察與羅布麻親緣關(guān)系近的種屬。

2.5.4 其它實(shí)驗(yàn)條件考察 對DNA 提取量、試劑盒、退火溫度等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行考察。

3 結(jié)果與分析

3.1 酶切位點(diǎn)分析

用軟件Chromas 2.6.6（Technelysium Pty Ltd）查看測序得到的.ab1 文件，確認(rèn)峰形正常；對42 條序列Trim Low Quality，顯示除兩端引物區(qū)外的其余部分結(jié)果可信。軟件CodonCode Aligner 9.0.1（Codon-Code Corporation）將同一個(gè)樣本的兩條序列的峰圖拼接起來，去除兩端不可信區(qū)域，得到21 條psbAtrnH 序列。將這21 條psbA-trnH 序列在NCBI 進(jìn)行Nucleotide BLAST：AV1～AV7 最高分結(jié)果為A.venetum chloroplast，complete genome（GenBank：MT313688.1），為羅布麻的序列；AP1～AP14 最高分結(jié)果為A.pictum voucher 65230438 PsbA（psbA）gene，partial cds（GenBank：KP152531.1），為白麻的序列；psbA-trnH 序列Nucleotide BLAST 結(jié)果與表1 鑒定的結(jié)果相符。

用軟件MEGA X[10]進(jìn)行多序列比對（MUSCL法），結(jié)果顯示（表2，“.”表示堿基與首行一致，“-”表示堿基缺失），與羅布麻組相比，白麻組有一段22bp 的序列缺失（gap），序列為5’-AGAATAGTAAATATTCTAAATA-3’。

表2 psbA-trnH 序列比對結(jié)果

用軟件DNAMAN 進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，此段gap序列包含一個(gè)特異性的Ssp Ⅰ酶切位點(diǎn)AAT/ATT，psbA-trnH 其他部分不含此酶切位點(diǎn)。即羅布麻psbA-trnH 含有特異性酶切位點(diǎn)Ssp Ⅰ，白麻psbAtrnH 不含此酶切位點(diǎn)。

3.2 PCR-RFLP 結(jié)果

21 個(gè)樣本進(jìn)行psbA-trnH 擴(kuò)增，Ssp Ⅰ酶切，以電泳觀察結(jié)果。瓊脂糖凝膠濃度為1.5%且用GeneGreen 染色，每個(gè)樣本先點(diǎn)一個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，再點(diǎn)一個(gè)酶切產(chǎn)物，進(jìn)行對比，如孔1 為AV1 擴(kuò)增產(chǎn)物，孔2 為AV1 酶切產(chǎn)物。Marker 上樣量為3 μL，擴(kuò)增產(chǎn)物上樣量為3 μL，酶切產(chǎn)物上樣量為8 μL。電泳條件為105 V，45 min。結(jié)果顯示，羅布麻均可以酶切為228 bp 和108 bp 兩個(gè)片段，白麻均不能酶切，見圖1。本實(shí)驗(yàn)建立的擴(kuò)增psbA-trnH 片段并用SspⅠ酶切的方法可以有效鑒別羅布麻和白麻。

圖1 羅布麻和白麻Ssp I 酶切驗(yàn)證

4 psbA-trnH 序列分析

4.1 酶切位點(diǎn)種間特異性分析

在NCBI 分類學(xué)數(shù)據(jù)庫Taxonomy 中，夾竹桃族（Apocyneae）收錄了7 個(gè)亞族、35 個(gè)屬，其中12 個(gè)屬有psbA-trnH 序列信息。羅布麻屬有6 個(gè)種，包括羅布麻和白麻，其中有5 個(gè)種有psbA-trnH 序列，金平藤缺少psbA-trnH 序列信息。下載夾竹桃族的所有相關(guān)序列，有的為葉綠體基因組序列，有的為包含psbA-trnH 的短序列，分別與引物psbAF/trnHR 進(jìn)行序列比對，得到各個(gè)物種的psbA-trnH序列，并進(jìn)行Ssp Ⅰ酶切位點(diǎn)分析，包含Ssp Ⅰ酶切位點(diǎn)的序列一共5 條。信息見表3。

表3 夾竹桃族psbA-trnH 序列Ssp Ⅰ酶切位點(diǎn)信息

由分析可見，有5 個(gè)物種的psbA-trnH 序列含 有Ssp Ⅰ酶切位點(diǎn)。在羅布麻屬中，羅布麻psbAtrnH 序列含有Ssp Ⅰ位點(diǎn)，金平藤信息未知，包括白麻在內(nèi)的其余5 個(gè)種均不含Ssp Ⅰ位點(diǎn)，由此可見羅布麻psbA-trnH 序列的Ssp Ⅰ酶切位點(diǎn)在羅布麻屬中具有較高的種間特異性。

羅布麻屬以外的其它屬中，目前已知4 個(gè)屬的物種中含有Ssp Ⅰ位點(diǎn)，但PCR 產(chǎn)物長度和酶切后片段長度均與羅布麻種差別較大，可以由電泳區(qū)分。但其它屬種有很多種目前沒有測序數(shù)據(jù)，因此在整個(gè)夾竹桃族中，羅布麻psbA-trnH 的Ssp Ⅰ酶切位點(diǎn)的特異性暫時(shí)未知。

4.2 酶切位點(diǎn)種內(nèi)保守性分析

在NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫中，獲得4 條羅布麻psbAtrnH 序列，分別為 KP152526.1、KP152527.1、KP152528.1、KT365818.1。本實(shí)驗(yàn)獲得7 條羅布麻psbA-trnH 序列，一共有11 條序列，多序列比對結(jié)果表明，序列相似度高，長度基本一致且均在約228 bp位置有Ssp Ⅰ酶切位點(diǎn)，可見psbA-trnH 序列的SspⅠ酶切位點(diǎn)在羅布麻種內(nèi)具有較高的保守性。

4.3 分子進(jìn)化分析

用軟件MEGA X[10]將“4.1”獲得的16 條夾竹桃族不同種屬psbA-trnH 序列構(gòu)建進(jìn)化樹（鄰接法），見圖2。從進(jìn)化樹看出，大花羅布麻A.hendersonii voucher 和白麻A.pictum voucher 在進(jìn)化樹上處于同一位置，與《中國植物志》中將大花羅布麻和白麻合并統(tǒng)一為白麻的情況相一致。另外進(jìn)化樹也表明，與羅布麻屬最近緣，易于混淆的品種為白麻，與市場上的混淆情況也相一致。

圖2 夾竹桃族進(jìn)化樹

4.4 其它實(shí)驗(yàn)條件考察

本實(shí)驗(yàn)嘗試了用20 mg 或者50 mg 液氮研磨的粉末均可以提取出總DNA，作為擴(kuò)增模板時(shí)都可以得到明亮的條帶，后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)為了保證藥材在液氮研磨后盡快加入Buffer HS Ⅱ，便不再稱量，用小量勺估計(jì)20～50 mg 的粉末直接加入準(zhǔn)備好Buffer HSⅡ的EP 管中，均可以成功提取總DNA。PCR 擴(kuò)增程序的退火溫度設(shè)置在56 ℃、57 ℃、58 ℃時(shí)均可以有效擴(kuò)增。所有批次樣本擴(kuò)增做了3 次重復(fù)，一次使用含普通Taq 酶的Mix，兩次使用含高保真Taq酶的Mix，一共擴(kuò)增63 批次，擴(kuò)增成功率為100%。所有樣本測序做了兩次重復(fù)，一次為單向測序（測序引物為psbAF），一次為雙向測序（測序引物為psbAF/trnHR），一共測序42 批次，全部得到合格的測序結(jié)果，測序的成功率為100%。

5 討論

在干燥植物中，中藥材DNA 提取難度較大，有的研究采用改良CTAB 法[11]，先去除多糖類成分，得到質(zhì)量較高的DNA。本實(shí)驗(yàn)采用的TaKaRa 植物基因組DNA 小量純化試劑盒，用ProtocolⅠ提取的DNA 無法成功進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，用Protocol Ⅱ提取的DNA 均能成功擴(kuò)增。液氮研磨需要盡量得到非常細(xì)致的粉末，56 ℃水浴時(shí)間可以稍延長，以提高DNA 得率。本實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)在于DNA 提取，高質(zhì)量的DNA 是后續(xù)實(shí)驗(yàn)成功的保障。

基于羅布麻和白麻psbA-trnH 序列的22 bp 差異，曾嘗試設(shè)計(jì)特異性引物，預(yù)期能擴(kuò)增出羅布麻片段，不能擴(kuò)增白麻片段；但試驗(yàn)了多對引物，均沒有成功，于是改用PCR-RFLP 方法。

對于PCR-RFLP 法，由于其最終判定依據(jù)在于是否被酶切和酶切條帶大小，因而考察的重點(diǎn)應(yīng)該是酶切條件的種屬特異性和種內(nèi)保守性等。而對于擴(kuò)增結(jié)果的影響因素如反應(yīng)輪數(shù)、退火溫度、酶、擴(kuò)增儀器和試劑等的考察則不是那么重要[12]。本研究結(jié)合NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫中的測序數(shù)據(jù)和對本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，羅布麻psbA-trnH 序列的種間特異性高，種內(nèi)保守性高，理論上羅布麻與羅布麻屬中的絕大部分物種都可以采用此法區(qū)分。在羅布麻屬中，金平藤的序列信息未知，可以對金平藤的psbA-trnH區(qū)域進(jìn)行測序分析，以進(jìn)一步考察此方法的特異性。

目前，使用psbA-trnH 序列作為中藥材DNA 條形碼的研究越來越多，例如綿馬貫眾[13]、鼠曲草屬植物[14]等，psbA-trnH 是否能夠作為羅布麻的DNA 條形碼仍有待研究。DNA 條形碼鑒定方法需要進(jìn)行測序，而大多數(shù)藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)還不具備測序條件；如果只需要區(qū)分羅布麻和白麻，本實(shí)驗(yàn)建立的PCRRFLP 法比較快捷。

分子生物學(xué)方法是傳統(tǒng)鑒定方法的有效補(bǔ)充[15]，除了DNA 條形碼、PCR-RFLP 方法外，還有特異性熒光定量PCR，位點(diǎn)特異性PCR，snp 分子標(biāo)記，HRM 技術(shù)[16～18]等。除了中藥材，有研究表明很多的中藥飲片也能夠使用分子生物學(xué)方法進(jìn)行有效鑒定[17]，對于中藥粉末和含原粉的中成藥進(jìn)行鑒定也是可行的[18]，因?yàn)槠錂z驗(yàn)的是物種的遺傳物質(zhì)，不會隨藥材的部位、狀態(tài)的改變而改變；但要注意高溫炮制等過程可能會破壞DNA。對于羅布麻葉片、復(fù)方羅布麻片等含有羅布麻葉原粉的中成藥，可以進(jìn)一步研究此PCR-RFLP 鑒別方法是否適用。