錢 卿，胡 楠**，周 華，凌 靜，陳 榮，鄒素蘭，王莉英

常州市第一人民醫(yī)院 1 藥學(xué)部；2 腎內(nèi)科,常州 213003

特發(fā)性膜性腎?。╥diopathic membranous nephropathy，IMN）是一種腎臟特異性的自身免疫性腎小球疾病，是成人腎病綜合征最常見的病理類型之一[1]。一項研究分析了來自中國938 家醫(yī)院71 151例患者的腎活檢報告，其中膜性腎病的發(fā)病率為23.4%，僅次于IgA 腎?。?8.1%）[2]。環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）聯(lián)合糖皮質(zhì)激素的治療方案是“改善全球腎臟病預(yù)后（kidney disease improving global outcomes,KDIGO）”指南推薦的首選方案之一，其總體緩解率可達(dá)72%，10 年內(nèi)的不透析生存率為89%[3]。然而，CTX 在不同患者個體間的療效與不良反應(yīng)仍存在顯著的差異性，藥物基因組學(xué)研究表明，可能與CTX 體內(nèi)藥動學(xué)過程相關(guān)的代謝酶和轉(zhuǎn)運體的基因多態(tài)性有關(guān)。代謝酶主要涉及細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP）2B6、2C9、2C19、3A4、3A5，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione S transferases，GST）和乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）等，轉(zhuǎn)運體包括多藥耐藥相關(guān)蛋白4（multidrug resistance-associated protein 4，MRP4）和P-糖蛋白（P-gp）[4]。

本研究旨在探討GST 和ALDH 基因多態(tài)性對CTX 方案治療IMN 的效果與不良反應(yīng)的影響，為精準(zhǔn)治療及藥學(xué)監(jiān)護(hù)提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2018 年1 月至2019 年12 月于本院腎內(nèi)科行腎臟穿刺活檢、病理診斷為膜性腎病，且采用CTX 方案的患者共計65 例。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過，所有患者均簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：腎臟病理明確診斷為膜性腎病的患者；治療方案為糖皮質(zhì)激素聯(lián)合CTX 靜脈沖擊治療，且療程達(dá)到1 年及以上；開始CTX 方案治療前3 個月未使用過其他免疫抑制劑。

排除標(biāo)準(zhǔn)：未嚴(yán)格遵循方案規(guī)律行CTX 沖擊治療的患者；改用其他免疫抑制劑的患者；療程＜1 年無法評價療效或不良反應(yīng)的患者；有嚴(yán)重的心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、肝臟疾病或癌癥；無法控制的嚴(yán)重感染；妊娠、哺乳及有生育計劃的育齡期女性；依從性差、隨訪不配合者；年齡＜18 歲。

1.2 用藥方案

二聯(lián)免疫抑制治療采用中等劑量醋酸潑尼松片（0.5mg·kg-1·d-1）或等效劑量甲潑尼龍片口服，聯(lián)合CTX（商品名：安道生，規(guī)格：0.2 g/支，Baxter Oncology GmbH 公司）每月靜脈沖擊治療。CTX 方案為：①治療開始的前6 個月：每月靜脈沖擊治療一次，劑量為0.8g/次，即0.4 g CTX 溶于生理鹽水250 mL 中，連續(xù)靜滴2 天；②治療6 個月后：根據(jù)患者病情改善情況，減量至每2～3 個月靜脈沖擊治療一次，劑量為0.8 g/次，分2 天給予。

1.3 療效及不良反應(yīng)評價

療效評價標(biāo)準(zhǔn)為：①完全緩解：24 h 尿蛋白定量＜0.3 g·d-1，血漿白蛋白正常（≥35 g·L-1），腎功能穩(wěn)定；②部分緩解：24 h 尿蛋白定量0.3～3.5 g·d-1且低于尿蛋白基線值50%以上，血漿白蛋白≥30 g·L-1，腎功能穩(wěn)定；③未緩解：24 h 尿蛋白定量≥3.5 g·d-1和（或）尿蛋白下降＜基線值50%。

不良反應(yīng)評價標(biāo)準(zhǔn)參考美國國立癌癥研究所《通用不良事件術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)》（CTCAE v4.0），重點記錄患者在治療過程中發(fā)生的嚴(yán)重胃腸道反應(yīng)、肝腎功能損傷、骨髓抑制、感染性疾病等不良反應(yīng)。評判標(biāo)準(zhǔn)如下：胃腸道反應(yīng)包括惡心、嘔吐、腹痛或腹瀉等；肝功能損傷：谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶或總膽紅素升高≥正常值上限1.5 倍（排除其他引起肝功能損害因素）；腎功能損傷：血清肌酐升高至＞正常值上限或基礎(chǔ)值的1.5 倍以上；骨髓抑制：白細(xì)胞計數(shù)＜3.5×109/L 和（或）中性粒細(xì)胞計數(shù)＜1.5×109/L。

1.4 基因型分析

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）-直接測序法檢測膜 性腎病患者GSTP1 A313G（rs1695）、ALDH3A1（rs2228100）的基因型，儀器采用美國Applied Biosystems 公司3730XL 型DNA Analyzer。

DNA 提?。喝』颊咄庵莒o脈血2 mL 置EDTA抗凝管中，按照全血基因組DNA 提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）說明書操作步驟提取DNA，并通過紫外分光光度法測定所提取基因組DNA 的濃度和純度。

PCR 引物設(shè)計：采用Primer 5.0 軟件設(shè)計擴(kuò)增引物及測序引物，見表1。所有引物均由生工生物工程上海股份有限公司合成。

表1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和延伸反應(yīng)引物

擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件：PCR 反應(yīng)體系包括DNA 模板1 μL（約100 ng），上游引物及下游引物（10 pmol·μL-1）各1 μL，10×Buffer 5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1）4 μL，rTaq DNA 聚合酶（5 U·μL-1）0.5 μL，加滅菌雙蒸水至25 μL。rs1695 的PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，共35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。rs2228100 的PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72℃延伸40 s，共35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。用χ2檢驗等位基因分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡。在療效影響因素的單因素分析中，分類變量采用非參數(shù)檢驗，連續(xù)變量如數(shù)值符合正態(tài)分布則采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布則采用非參數(shù)檢驗；在單因素分析中，有顯著影響的因素進(jìn)一步納入多因素研究，多因素分析采用有序Logistic 回歸?？疾旎蚨鄳B(tài)性對不良反應(yīng)的影響，采用χ2檢驗或Fisher’s 精確檢驗，當(dāng)預(yù)測頻數(shù)＜5 時，采用Fisher’s精確檢驗，當(dāng)預(yù)測頻數(shù)≥5 時，采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

最終納入65 例患者，男39 例，女26 例?；颊咧委熐暗幕A(chǔ)資料，尿蛋白定量（24 h）、血清白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）等檢測指標(biāo)見表2。

表2 膜性腎病患者的人口學(xué)統(tǒng)計資料及實驗室指標(biāo)

2.2 基因型及等位基因頻率

GSTP1 rs1695 A 和G 等位基因的頻率分別為74.62%和25.38%，ALDH3A1 rs2228100 C 和G 等位基因的頻率分別為46.15%和53.85%。通過χ2檢驗，以上各基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡（P＞0.05），研究資料具有群體代表性。

2.3 CTX 方案治療膜性腎病的療效影響因素分析

CTX 聯(lián)合糖皮質(zhì)激素方案治療膜性腎病患者的總體緩解率達(dá)78.5%，其中完全緩解率為41.5%，部分緩解率為36.9%，而未緩解率為21.5%。在單因素分析中，逐個考察性別、年齡、體重、體重指數(shù)、治療前24 h、治療前ALB、治療前BUN、治療前SCr、GSTP1 和ALDH3A1 不同基因型對療效的影響。結(jié)果顯示，性別、體重、GSTP1 rs1695 基因型對療效存在顯著影響（P=0.003、P=0.032、P=0.047），見表3。

表3 12 個月疾病緩解率的單因素分析

將單因素分析中有顯著影響的因素進(jìn)一步納入多因素分析，結(jié)果表明，女性患者出現(xiàn)部分緩解或未緩解的可能性顯著低于男性患者（P=0.017），女性患者出現(xiàn)部分緩解或未緩解的可能性僅為男性患者的25.6%，故性別是12 個月疾病緩解率的獨立影響因素。盡管GSTP1 rs1695 GG 型的疾病完全緩解率是AA 型的2.5 倍（75.00% vs 30.00%），但GSTP1 rs1695 基因型并非12 個月疾病緩解率的獨立影響因素（P＞0.05），見表4。

表4 12 個月疾病緩解率的多因素分析

本次多因素分析的有序Logistic 回歸通過了平行線檢驗（P=0.240），表明以上統(tǒng)計結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.4 GSTP1 和ALDH3A1 基因多態(tài)性與CTX 不良反應(yīng)的相關(guān)性

65 例患者在1 年治療觀察期內(nèi)，有12 例（占18.5%）出現(xiàn)肝功能異常；24 例（占36.9%）發(fā)生感染性疾病，其中13 例（占20.0%）發(fā)生呼吸道感染，13例（占20.0%）發(fā)生泌尿系感染，未發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重胃腸道反應(yīng)和骨髓抑制其他不良反應(yīng)。GSTP1 rs1695、ALDH3A1 rs2228100 位點的基因多態(tài)性與肝損傷或感染等不良反應(yīng)之間無顯著相關(guān)性。

3 討論

在本研究中，CTX 聯(lián)合糖皮質(zhì)激素方案治療IMN 患者12 個月時的總體緩解率達(dá)78.5%，其中完全緩解率為41.5%，部分緩解率為36.9%。

最近，F(xiàn)ernández-Juárez G 等[5]研究比較了糖皮質(zhì)激素和CTX 的循環(huán)交替治療方案與他克莫司和利妥昔單抗的序貫治療方案、用于原發(fā)性膜性腎病誘導(dǎo)和維持治療的有效性。結(jié)果顯示，糖皮質(zhì)激素和CTX 組在12 個月和24 個月時的總體緩解率（含完全緩解和部分緩解）分別為79.1%和83.7%，完全緩解率分別為32.6%和60.5%，均明顯高于他克莫司和利妥昔單抗組。另一納入21 項研究（1187 例）的薈萃分析顯示，CTX 組在治療6 個月和12 個月時的總體緩解率分別為64.7%和77.4%，6 個月時的緩解率低于鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（CNIs）組，但12 個月時的緩解率與CNIs 組無顯著差異[6]。以上文獻(xiàn)中CTX 方案的總體緩解率與本研究的結(jié)果較為一致。

單因素分析顯示，性別對療效存在顯著性影響，多因素分析進(jìn)一步證實男性是12 個月疾病緩解率的獨立危險因素，即男性的疾病緩解率明顯低于女性。其他研究也顯示，性別（男性）、年齡、起病時腎小球濾過率（GFR）下降、低分子量生物標(biāo)記物（如β2微球蛋白）分泌增加、治療后磷脂酶A2 受體抗體（anti-PLA2R）水平持續(xù)升高，以及腎臟病理C3染色陽性是膜性腎病腎功能進(jìn)展的危險因素[1]。Choi JY 等[7]篩選出的膜性腎病預(yù)后良好的預(yù)測因子包括起病時較高的血紅蛋白（HR:0.82，95%CI：0.72～0.93），較高的血清白蛋白水平（HR:0.66，95%CI：0.44～0.99）以及較高的GFR 值（HR:0.96，95%CI：0.95～0.97）。

CTX 是一種前藥，進(jìn)入體內(nèi)后經(jīng)細(xì)胞色素CYP 2B6、2C9、2C19 等代謝酶轉(zhuǎn)化為4-羥基環(huán)磷酰胺（4-OH-CTX），然后開環(huán)生成醛磷酰胺，兩者處于相互轉(zhuǎn)化的動態(tài)平衡中，最終轉(zhuǎn)化為烷化劑磷酰胺氮芥和丙烯醛。4-OH-CTX 通過GSTM1/GSTP1/GSTT1 催化進(jìn)一步與細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽結(jié)合，生成無毒的水溶性復(fù)合物由尿液排出。醛磷酰胺可通過ALDH1A1和ALDH3A1 氧化生成為羧磷酰胺（CEPM）。因此，GST 和ALDH 的活性對CTX 的療效和毒性反應(yīng)具有非常重要的影響。

一項采用標(biāo)準(zhǔn)CTX 方案治療不同自身免疫性疾病的研究顯示[8]，GSTP1 I105V（rs1695）野生型（AA 型）的治療有效率為21.42%，雜合子（AG 型）和純合子（GG 型）的治療有效率分別為61.53%和50.00%，野生型和突變型的療效差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.03）。其機(jī)制為GSTP1 突變型為弱代謝型，酶活性下降，導(dǎo)致CTX 活性代謝產(chǎn)物治療濃度更高、作用維持時間更長，因此患者的治療反應(yīng)更佳。另有一項對乳腺癌和其他癌癥患者的研究，其報道了GSTP1 I105V 基因多態(tài)性與CTX 為基礎(chǔ)的方案的治療反應(yīng)之間有相關(guān)性，突變型（包括雜合子和純合子）患者總體生存率更高及復(fù)發(fā)率更低[9]。

然而，也有部分研究得出了不同的結(jié)論。Wang HN 等[10]發(fā)現(xiàn)GSTP1 rs1695 基因型對狼瘡性腎炎患者的療效無顯著影響（P=0.31）；但GSTA1*A 雜合子（CT 型）相對于野生型（CC 型）CTX 治療后疾病不緩解的風(fēng)險更大（P=0.005），原因是CTX 活性代謝產(chǎn)物（4-OH-CTX）體內(nèi)暴露量低[AUC4OH-CTX：12.8（9.8，19.5）vs27.5（18.1，32.8）h·mg·L-1，P=0.023]。

Audemard-Verger A 等[11]在采用CTX 方案治療狼瘡性腎炎中探討了GSTP 基因多態(tài)性對預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)GSTP1 C313A（野生型）和C313A＞G（純合子和雜合子）的總體緩解率分別為91.2%和72.4%（P=0.059），在多因素分析中，GSTP1 C313A＞G 是總體緩解率低的獨立影響因子，OR 95%CI 為5.011（1.025～24.510），P=0.047。該研究推測的作用機(jī)制為GSTP1 主要表達(dá)在腎臟而非肝臟，即GSTP1 并不是參與CTX 代謝主要的關(guān)鍵酶，其突變型較低的緩解率是與腎臟的解毒作用有所降低有關(guān)。

基因多態(tài)性對CTX 藥物不良反應(yīng)的影響方面，陳玲燕等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在相同劑量下，ALDH3A1 rs2228100 突變純合子（GG）患者用CTX 后出現(xiàn)肝功能異常的風(fēng)險顯著高于CC/GC 患者OR 95%CI為20.59（2.26～187.96）。在本研究中，ALDH3A1 GG型肝損傷發(fā)生率約為CC 型的2 倍（16.7%vs7.7%），但無統(tǒng)計學(xué)差異，可能與研究方案中CTX 治療劑量偏低以及樣本量偏小有關(guān)，也未發(fā)現(xiàn)CTX 導(dǎo)致骨髓抑制和出血性膀胱炎的病例。

本研究的單因素分析結(jié)果顯示，GSTP1 rs1695基因型對療效存在一定影響，但多因素分析中未顯示其為獨立影響因素，可能與本研究的樣本量較小有關(guān)，需要擴(kuò)大樣本量來進(jìn)一步驗證和探究，而ALDH3A1 rs2228100 基因型對療效與不良反應(yīng)無顯著影響。