姜孫旻，吳雪青，袁文博，余仁強(qiáng)，陸子紅，姚 熒**

1 南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫婦幼保健院 藥學(xué)部，無錫 214002;2 江南大學(xué) 藥學(xué)院，無錫 214000;3 南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫婦幼保健院新生兒科，無錫 214002；

近年來由于極低或超低體重出生兒存活率增加，支氣管肺發(fā)育不良并發(fā)的新生兒持續(xù)肺動(dòng)脈高壓（persistent pulmonaryhypertension of the newbom，PPHN）成為兒科常見的危急重癥[1]。使用西地那非可以增加血管平滑肌cGMP，使NO 通路的血管擴(kuò)張效果持續(xù)，對于PPHN 具有較好的療效[2]。目前枸櫞酸西地那非的市售制劑僅有口服片劑和口服混懸液，在臨床上通過稱量、飲用水分散后給新生兒服用。該方法存在操作繁瑣、給藥劑量不準(zhǔn)確、易使療效降低等不足；此外，新生兒吞咽困難，臨床使用還存在易發(fā)生嗆咽等缺點(diǎn)[3]。因此，很有必要研發(fā)一種易于小兒服用的西地那非新劑型藥物。故采用明膠-蔗糖作為基質(zhì)制備西地那非凝膠劑，既能夠包裹藥物、掩蓋苦味、準(zhǔn)確給藥，又有利于小兒的吞咽，提高患者的順應(yīng)性，改善藥物的療效。

1 材 料

1.1 主要儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；A560 型雙光束紫外可見分光光度計(jì)（翱藝儀器上海有限公司）；BSA124S 電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；FE20 pH 計(jì)（梅特勒-托利儀器上海有限公司）；KQ-200KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Centrifuge 5424R 高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；Hybrid Discovery HR-3 流變儀（美國TA 儀器有限公司）；RC806D 溶出試驗(yàn)儀（天大天發(fā)科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

枸櫞酸西地那非（Hetero Drug Ltd，批號：SD 18 090085；純度99.3%）；明膠為化學(xué)純；卡拉膠為藥用級；食用蔗糖；常用有機(jī)溶劑為分析純；所用試劑均為色譜純；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 枸櫞酸西地那非分析方法學(xué)的建立

2.1.1 溶液的配制 ①流動(dòng)相：三乙胺（取7 mL 三乙胺，用水稀釋至1000 mL，磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.0）-甲醇-乙腈（58∶25∶17，V∶V∶V）為流動(dòng)相。②枸櫞酸西地那非對照品溶液Ⅰ：精密稱取枸櫞酸西地那非原料藥35 mg 置50 mL 量瓶中，用以上述流動(dòng)相作為溶劑稀釋至刻度，再從中精密量取2 mL 于50 mL量瓶中，稀釋至刻度，用0.45 μm 尼龍濾膜過濾，得到質(zhì)量濃度為28 μg·mL-1對照品溶液[4]。③枸櫞酸西地那非對照品溶液Ⅱ：精密稱取枸櫞酸西地那非原料藥50 mg 置50 mL 量瓶中，以流動(dòng)相作為溶劑，稀釋至刻度，從中精密量取5 mL 于50 mL 量瓶中，再稀釋至刻度，用0.45 μm 尼龍濾膜過濾，得到質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1對照品溶液。

2.1.2 最大紫外吸收波長的確定 取枸櫞酸西地那非對照品溶液Ⅰ，使用紫外分光光度計(jì)將其在波長200～400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行紫外全波長掃描，測定其紫外吸收，確定最大吸收波長，以此確定HPLC 法的最佳檢測波長，結(jié)果見圖1。因在190～210 nm 處很多溶劑都有末端吸收，故選擇290 nm 為枸櫞酸西地那非的檢測波長。

圖1 枸櫞酸西地那非紫外可見光光譜圖

2.1.3 色譜條件 參考《美國藥典》（USP 40）[5]，采用高效液相色譜法進(jìn)行測定。色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：三乙胺-甲醇-乙腈（58∶25∶17，V∶V∶V）；柱溫：30 ℃；檢測波長：290 nm；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.4 專屬性 按“2.1.1”項(xiàng)下配制流動(dòng)相作為空白溶劑與枸櫞酸西地那非對照品溶液Ⅱ，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果見圖2。由圖2 顯示，空白溶劑不干擾枸櫞酸西地那非的檢測，枸櫞酸西地那非色譜峰與相鄰色譜峰分離良好，表明該色譜條件專屬性良好。

圖2 枸櫞酸西地那非專屬性圖

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 取對照品溶液Ⅱ，用流動(dòng)相稀釋配制成系列梯度濃度的線性工作溶液（100、80、60、40、30、20、10、5 μg·mL-1），以10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖與峰面積。以峰面積（Y）對系列濃度（X，μg·mL-1）繪制線性回歸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=25.58X-2.9823（r2=0.999 7）。結(jié)果表明，枸櫞酸西地那非在濃度5.22～104.40 μg·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.6 儀器精密度 取枸櫞酸西地那非對照品溶液Ⅱ，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄相應(yīng)峰面積。枸櫞酸西地那非峰面積的RSD 為0.40%（n=6）。RSD＜2%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 方法精密度 配制5、30、80 μg·mL-1濃度的枸櫞酸西地那非溶液，低、中、高3 個(gè)濃度各配制3份，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄相應(yīng)峰面積。結(jié)果顯示，低、中、高濃度的RSD 分別為1.37%、0.30%、1.93%（均n=3）。RSD 均＜2%，說明方法精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取枸櫞酸西地那非對照品溶液Ⅱ，密封于室溫下放置0、24、48 h，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄相應(yīng)峰面積。計(jì)算枸櫞酸西地那非穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD 為0.166%（n=3）。RSD＜2%，表明枸櫞酸西地那非對照品溶液在室溫下48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2 凝膠基質(zhì)的處方工藝考察

2.2.1 增溶劑的選擇 選擇3 種常用的增溶劑泊洛沙姆F68、泊洛沙姆F127 和聚乙二醇4000（PEG4000）進(jìn)行增溶試驗(yàn)，分別測定增溶劑用量為1%、2%、5%時(shí)的枸櫞酸西地那非的溶解度，結(jié)果見表1。最終選擇5%的泊洛沙姆F127 溶液作為處方的增溶劑。

表1 枸櫞酸西地那非溶解度

2.2.2 凝膠基質(zhì)的選擇 通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[6，7]，以及對不同凝膠劑的性價(jià)比進(jìn)行調(diào)研后，選擇明膠（10%、12%、14%、16%、18%（w/V））和卡拉膠（0.5%、1%、2%（w/V））進(jìn)行感觀評價(jià)，以選擇較優(yōu)的凝膠基質(zhì)與用量。制定感官評分標(biāo)準(zhǔn)：請10 名（5 男5 女）評價(jià)員[8]根據(jù)透明度、細(xì)膩度、強(qiáng)度、氣味進(jìn)行評分，各項(xiàng)分別占20、30、20、30 分，取其平均值作為最終評分結(jié)果，滿分為100 分。結(jié)果表明，明膠基質(zhì)色澤明亮，質(zhì)地均勻光滑、粘彈性適度、無特殊氣味，其得分均高于卡拉膠，故更適合作為吞咽困難患者服用的凝膠基質(zhì)。

2.2.3 凝膠基質(zhì)持水性試驗(yàn) 取不同質(zhì)量濃度的明膠溶液1 mL 于1.5 mL EP 管中，待其膠凝后稱重，放置冷凍高速離心機(jī)中，以10 000 r·min-1離心20 min，吸去上層析出的水分，再次稱重，按公式（1）計(jì)算其持水力（water holding capacity，WHC）[9]。

式中：M1為離心前裝有凝膠的離心管質(zhì)量（g）；M2為吸去水分后離心管質(zhì)量（g）。

每個(gè)樣品平行制備3 份，見圖3。結(jié)果表明，明膠濃度為10%時(shí)具有較高的持水性，能夠避免制劑在口腔黏膜上粘附。

2.2.4 基質(zhì)粘彈性試驗(yàn) 將不同質(zhì)量濃度的明膠基質(zhì)制備成直徑為50 mm、厚度為5 mm 的圓形薄片，選用型號104717，錐角為4∶0∶43（deg∶min∶sec），錐板直徑為40 mm，截?cái)鄥?shù)為109 μm 的錐板夾具，用HR-3 流變儀在流動(dòng)模式下進(jìn)行動(dòng)態(tài)頻率測試，掃描頻率為0.1～100 rad·s-1，儀器平衡時(shí)間為5 s，樣品測試平均時(shí)間為30 s，所有測試均在常溫（25 ℃）條件下進(jìn)行。按照公式（2）[10]計(jì)算損耗因子。

式中：tan δ 為損耗因子；G″為損耗模量（Pa）；G′為儲能模量（Pa）。

每個(gè)樣品平行做3 次，結(jié)果見圖4。由圖4 顯示，在0.1～100 rad·s-1范圍內(nèi)，所測樣品的G′均比G″大一個(gè)數(shù)量級，tan δ 小于1，并且隨著角頻率ω的增加，所測樣品的tan δ 都略有增加。這表示所測樣品的動(dòng)態(tài)模式中，彈性（固體特征）均高于粘性（液體特征），并且通過剪切可降低樣品的彈性。在5種濃度的樣品中，10%明膠基質(zhì)具有更低的tanδ，說明此濃度下的明膠基質(zhì)粘性小，彈性大，能夠在擠壓時(shí)減輕患者的服用負(fù)荷。

2.2.5 矯味劑蔗糖的考察 以10%明膠作為基礎(chǔ)，加入不同比例的蔗糖，配制成蔗糖濃度為1%、2%、3%、4%、5%（w/V）的明膠-蔗糖基質(zhì)。按、“2.2.2”、“2.2.3”、“2.2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行感觀評價(jià)、持水性、粘彈性試驗(yàn)。持水性、粘彈性結(jié)果分別見圖3、圖4。

結(jié)果顯示，當(dāng)配比為10%明膠-3%蔗糖時(shí)，基質(zhì)光滑透明、色澤悅目、口感適宜，且具有良好的持水性以及粘彈性。

2.2.6 優(yōu)化處方組成及制備工藝 處方組成為枸櫞酸西地那非1%、2%、3%，泊洛沙姆F127 5%，明膠10%，蔗糖3%。其制備工藝：稱取泊洛沙姆F127 適量溶于，蒸餾水中配制成5%溶液，加入適量的枸櫞酸西地那非，室溫下攪拌溶解。再加入處方量明膠、蔗糖，在水浴70 ℃下攪拌溶解。待溶解完全后，水浴攪拌下降至37 ℃，放置于冰箱4 ℃冷卻至半固態(tài)。

2.3 含量測定

2.3.1 樣品制備 按“2.2.6”項(xiàng)下確定的處方及工藝，制備濃度為1、2、3 mg·mL-1的3 種規(guī)格的枸櫞酸西地那非凝膠劑。

2.3.2 含量測定 分別從濃度為1、2、3 mg·mL-1的3 種凝膠劑中精密稱取1 g 凝膠，切成大小均勻的細(xì)塊，置于50 mL 量瓶中，加入適量流動(dòng)相溶解，超聲至凝膠完全溶解后，以流動(dòng)相稀釋至刻度。按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算半固體凝膠中的藥物含量，每個(gè)樣品平行制備3 份。結(jié)果顯示，在1～3 mg·mL-1范圍內(nèi)，藥物回收與投藥量存在線性關(guān)系，Y=0.823X+0.053（r2=0.998 9），可設(shè)定為枸櫞酸西地那非凝膠劑的藥物含量。

2.4 凝膠劑溶出度試驗(yàn)

2.4.1 樣品制備 分別從濃度1、2、3 mg·mL-1的3種枸櫞酸西地那非凝膠劑中精密稱取10 g 凝膠，將其切割成大小均勻的小塊備用。

2.4.2 溶出度試驗(yàn) 按照《中國藥典》（2015 版）溶出度測定第二法（槳法）[11]，以0.1 mol·L-1鹽酸溶液900 mL 為溶出介質(zhì)（37 ℃±0.5 ℃），轉(zhuǎn)速設(shè)定為50 r·min-1。將制備好的樣品投入溶出杯內(nèi)，開始計(jì)時(shí)，然后按間隔5、10、15、30、45、60、120 min 定時(shí)取樣。每次取樣5 mL，用0.45 μm 聚醚砜濾膜過濾，取續(xù)濾液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，按公式（3）計(jì)算枸櫞酸西地那非凝膠劑的累積溶出度。每個(gè)樣品平行制備3 份；結(jié)果見圖6。

枸櫞酸西地那非凝膠劑在5 min 時(shí)藥物溶出度已經(jīng)超過90%，在2 h 內(nèi)藥物溶出度維持在95%左右，能夠充分釋放藥物，有利于患者吸收。

式中：A對為枸櫞酸西地那非對照品溶液的峰面積；A0為枸櫞酸西地那非凝膠劑0 時(shí)刻溶液的峰面積（此時(shí)峰面積為0）；An為枸櫞酸西地那非凝膠劑第n 個(gè)時(shí)間點(diǎn)溶液的峰面積（n≥1）；C對為枸櫞酸西地那非對照品溶液濃度（mg·mL-1）；V1為補(bǔ)充溶出介質(zhì)體積/mL（本實(shí)驗(yàn)中為5 mL）；V2為溶出介質(zhì)體積/mL（本實(shí)驗(yàn)中為900 mL）；m理論為枸櫞酸西地那非凝膠劑的理論含藥量/mg。

3 討論

果凍型凝膠劑是一種含藥物的吞咽輔助型凝膠劑，具有改善藥物吞咽、掩蓋藥物異味、飲用方便等優(yōu)點(diǎn)[12]。有研究針對治療老年人的骨質(zhì)疏松癥、制備了負(fù)載阿侖膦酸酯藥物的口服凝膠，適用于吞咽困難的老年患者，提高其用藥順應(yīng)性[13]。此類制劑在穩(wěn)定性、劑量準(zhǔn)確性、使用方便性、患者依從性等方面都具有很大的優(yōu)勢。

在凝膠劑制備過程中，最重要的成分是膠凝劑，本研究考察了明膠和卡拉膠，前者在持水性、均一性、粘彈性、透明度、口感等方面均良好。

枸櫞酸西地那非在《中國藥典》中并未收錄，本研究參考了《美國藥典》（USP 40），建立了體外溶出度測定法，并通過專屬性、精密度、線性范圍、穩(wěn)定性等進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，為枸櫞酸西地拉非凝膠劑的含量及體外溶出測定提供了可靠、準(zhǔn)確的分析方法。

臨床上口服西地那非治療PPNH 常用劑量為0.5～1 mg/次，每6 h 服用一次，可顯著降低患兒肺動(dòng)脈壓力[1]。該凝膠劑處方中使用了增溶劑，對枸櫞酸西地那非進(jìn)行增溶，使其溶解度顯著提高至3.5 mg·mL-1，所設(shè)計(jì)的載藥量為1～3 mg·mL-1的凝膠劑能被完全溶解，并且增加載藥量能夠減少用藥體積，提高新生兒的用藥順應(yīng)性。通過考察，確定了載藥量1～3 mg·mL-1為制劑設(shè)定的規(guī)格。

經(jīng)體外溶出度試驗(yàn)，該凝膠劑在5 min 時(shí)藥物累計(jì)溶出已經(jīng)超過90%，說明在胃中能夠快速且有效地釋放，利于患兒吸收。

研制枸櫞酸西地那非凝膠劑，有望達(dá)到吞咽時(shí)無異物感、改善藥物療效、提高患者依從性等目的，具有開發(fā)的潛力。